三氟拉嗪通过内化水通道蛋白4减轻蛛网膜下腔出血大鼠脑水肿.pdf

Chinese Journal of Neuroanatomy志杂经解部神2023,39(3)：3 16 3 2 0三氟拉嗪通过内化水通道蛋白4减轻蛛网膜下腔出血大鼠脑水肿初广新，李佳朔，王振，董玉书（北部战区总医院神经外科，沈阳110 0 16）摘要 目的：研究三氟拉嗪（TFP)对蛛网膜下腔出血（SAH)模型大鼠水通道蛋白4（AQP4）细胞定位及脑水肿的影响。方法：利用往小脑延髓池二次注射自体动脉血的方法制备 SAH大鼠模型，治疗组通过灌胃给予TFP处理；利用湿干比方法检测大鼠脑含水量；利用伊文思蓝染料渗透实验检测血脑屏障（BBB)的完整性；利用试剂盒分别提取胞膜蛋白和胞浆蛋白，利用WesternBlot方法检测AQP4的表达。结果：与SAH组大鼠相比，TFP治疗组大鼠脑含水量减少，脑组织中伊文思蓝染料的含量下降，同时AQP4在细胞膜的分布减少。结论：TFP通过内化AQP4减轻SAH模型大鼠脑水肿。关键词蛛网膜下腔出血；三氟拉嗪；脑水肿；水通道蛋白4；大鼠D0I:10.16557/ki.1000-7547.2023.03.010Trifluoperazine alleviates cerebral edema in subarachnoid hemorrhagemodel rats by internalizing aquaporin 4CHU Guangxin,LI Jiashuo,WANG Zhen,DONG Yushu(Department of Neurosurgery,General Hospital of Northern Theater Command of ChinesePeoples Liberation Army,Shenyang 110016,China)Abstract Objective:To investigate the effects of trifluoperazine(TFP)on the localization of aquaporin-4(AQP4)cells and brain edema in rats with subarachnoid hemorrhage(SAH).Methods:The rat model of SAH was prepared byinjecting autologous arterial blood into the cerebellomedullary cistern twice.The treatment group of rats were adminstrat-ed TFP by intragastric administration.The water content of rat brain was determined by wet-dry ratio method.The integ-rity of blood-brain barrier(BBB)was determined by Evans blue dye penetration test.Cytoplasmic protein and cytoplas-mic protein were extracted by the kit respectively,and the expression of AQP4 was detected by Western Blot.Results:Compared with SAH group,the water content of brain,the content of Evans blue dye in brain tissue and the distributionof AQP4 in cell membrane were decreased in TFP treatment group rats.Conclusion:TFP can relieve cerebral edema ofSAH model rats by internalizing AQP4.Key wordssubarachnoid hemorrhage(SAH);trifluoperazine(TFP);brain edema;aquaporin-4(AQP4);rat蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH)是一种致残率高、死亡率高的脑卒中,主要由颅内动脉瘤破裂引起。越来越多的证据表明，SAH发病后7 2 h内发生的早期脑损伤（earlybraininjury，EBI)是导致患者高死亡率和致残率的主要原因2.3。EBI的主要病理机制包括颅内压升高、脑基金项目：国家自然科学基金（8 2 0 7 148 1）*通信作者：董玉书电话：13352 45530 1，E-mail：d o n g y u s h u 46 3 16 3.c o m317初广新：三氟拉嗪通过内化水通道蛋白4减轻蛛网膜下腔出血大鼠脑水肿血流量减少、氧化应激、神经炎症、血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB）破坏、脑水肿和神经元细胞凋亡4。脑水肿被认为在SAH后EBI中起重要作用5。因此,通过药物缓解脑水肿可能减轻SAH后的EBI。水通道蛋白4（aquaporin4，A Q P4）在各种神经系统疾病中的表达和活性已被广泛研究,并取得了一些有趣的发现6 。在脑水肿和脑缺血中,AQP4表达增加，通过基因敲除或抑制剂预处理抑制AQP4活性已被证明可以减少水肿形成7.8 。三氟拉嗪（t r i f l u o p e r a z i n e，T FP）是一种钙调蛋白（calmodulin，CaM)抗剂，被美国食品和药物管理局批准为抗精神病药物,研究表明TFP可以通过干扰CaM抑制AQP4在脊髓损伤小鼠星形胶质细胞膜上的分布，进而减轻细胞毒性水肿9.0 1。本实验中我们利用二次注射自体动脉血方法制备了SAH大鼠模型，同时给予TFP治疗,观察TFP对 SAH大鼠早期脑水肿的影响。材料和方法1.材料1.1动物分组60只雄性SD大鼠，8 周龄，购自沈阳医学院实验动物中心，12 h白天/12 h黑夜节律循环，自由获取食物和饮水。大鼠按照随机数字法分假手术组（sham）、蛛网膜下腔出血模型组（SAH）和三氟拉嗪治疗组（SAH+TFP），每组2 0 只，实验方案经北部战区总医院伦理委员会批准。1.2试剂和仪器盐酸三氟拉嗪片购自广州白云山光华制药股份有限公司，异氟烷和小动物麻醉机购自深圳瑞沃德公司，兔抗大鼠AQP4单克隆抗体（a b 2 59 318）和兔抗-actin多克隆抗体（ab8227）购自英国Abcam公司，小鼠抗钠/钾离子转运ATP酶l（a l p h a-l s u b u n i t o f t h e Na t/K+A T Pa s e,ATP1A1）单克隆抗体（sc-21712）购自美国SantaCruz公司，细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒（P0 0 33）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗均购自上海碧云天公司，伊文思蓝染色试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。2.方法2.1模型制备大鼠经异氟烷（2%异氟烷、2 9%氧气和6 9%氮气）诱导麻醉后，俯卧位固定在手术台上，剪除项背部毛发，碘伏消毒后暴露小脑延髓池。使用二次注血法制备SAH模型。分两次分别往小脑延髓池注射非肝素化的自体动脉血30 0 l和200 l,间隔2 4 h。2.2药物处理将盐酸三氟拉嗪片用生理盐水溶解，SAH+TFP大鼠按照0.3mg/kg灌胃，每天1次，直至实验结束,sham组和SAH组大鼠给予同等剂量生理盐水12 2.3脑含水量检测SAH术后7 2 h检测各组大鼠的脑含水量，每组取3只大鼠，异氟烷麻醉后完成取出脑组织，称重，记为脑的湿重，将脑用锡箔纸包裹后放人烤箱中10 0 烘烤2 4h，以充分烤干，再次称量，记为脑的干重。计算脑含水量，公式为：脑含水量=（湿重干重）/湿重10 0%。2.4伊文思蓝渗透实验SAH手术后7 2 h,采用伊文斯蓝渗透实验对检测各组大鼠BBB的通透性。每组取3只，通过尾静脉注射浓度为2%的伊文斯蓝溶液(2 ml/kg）,1h 后用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30mg/kg）,快速灌注40 0 ml生理盐水,迅速取出脑组织,用剪刀剪碎后加人1ml三氯乙酸混匀,放置于60水浴锅中孵育2 4h，10 0 0 r/m i n 离心5min，用酶标仪检测6 2 0 nm的吸光值，用试剂盒中标准品倍比稀释并绘制标准曲线，通过标准曲线计算每组样品中伊文斯蓝的含量,结果以g/g脑组织表示2.5Western Blot每组取3只大鼠，异氟烷麻醉，从每只大鼠脑相同脑区（额叶）取10 0 mg脑组织，利用细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒分别提取细胞膜蛋白和胞浆蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度，每个样品取30 g进行蛋白电泳，随即进行转膜和封闭，加人兔抗大鼠AQP4单克隆抗体（1:18 0 0）、膜蛋白内参为小鼠抗ATP1A1单克隆抗体（1:150 0），胞浆蛋白内参为兔抗-actin多克隆抗（1:30 0 0），将杂交膜置于4冰箱中孵育过夜，PBST洗膜3次后，加人HRP标记的山羊抗兔二抗（1:40 0 0），室温孵育1.5h,PBST洗膜3次后使用ECL发光液进行发光，经凝胶成像仪拍照，利用ImageJ软件进行定量分析。2.6乡统计学分析斤用SPSS20.0软件进行数据处理,计量资料用均数标准差（xs)表示。两组间的比较用单因素方差分析（onewayANOVA）,P0.05），假手术组无大鼠死亡（Fig.1）。提示TFP不能显著减低SAH大鼠的死亡率。3530(%)aeuoe2520151050ShamSAHSAH+TFPFig.1 The mortality of rat at 24 hours after SAH.2.三氟拉嗪治疗减轻蛛网膜下腔出血大鼠脑水肿与假手术组大鼠相比,SAH组大鼠在第二次注血7 2 h后脑的含水量显著增加（P0.05）,T FP组治疗后使SAH组大鼠脑含水量降低至与假手术组相似的水平(P0.05,Fig.2)。100a9080b706050ShamSAHSAH+TFPFig.2 TFP reduced brain water content of SAH rats.aP0.05 usSham group,bP0.05 us SAH group.3.三氟拉嗪治疗降低蛛网膜下腔出血大鼠伊文思蓝通透性正常情况下伊文思蓝染料不易通过完整的血脑屏障,SAH在第二次注血7 2 h后内通过尾静脉注射至大鼠体内的伊文思蓝染料渗透到到所有脑区，提示SAH大鼠血脑屏障完整性受到破坏。TFP治疗后SAH大鼠脑组织中伊文思蓝染料和含量显著降低（P0.05，Fi g.3）,表明TFP治疗后SAH大鼠的血脑屏障破坏减轻。1.61.4a1.210.8b0.60.40.20ShamSAHSAH+TFPFig.3 TFP treatment reducd Evans blue permeability in rats withSAH.aP0.05 us Sham group,bp0.05 us SAH group.4.三氟拉嗪促进蛛网膜下腔出血大鼠脑内AQP4从胞膜转移至胞浆SAH发生后7 2 h，脑组织中AQP4迅速分布至胞膜，这种细胞定位使水分子过多的进人到胞内，引起细胞性水肿,然而TFP治疗组的SAH大鼠脑内细胞膜AQP4显著降低，胞浆中AQP4的表达增加（P 0.0 5，Fi g.4），表明TFP促进蛛网膜下腔出血大鼠脑内AQP4从胞膜转移至胞浆，减少了水的通透性，从而减轻细胞性水肿。ShamSAHSAH+TFP3.0a2.5mAQP430kDa2.0ATP1A11.5110kDab1.0CAQP430kDa0.5-actin42kDa0.0ShamSAHSAH+TFPFig.4 TFP promoted AQP4 taffic from membrane to cytoplasm in rats with SAH.P0.05 us Sham group,bP0.05 us SAH group.mAQP4:membrane AQP4,cAQP4:cytoplasmic AQP4.319初广新：三氟拉嗪通过内化水通道蛋白4减轻蛛网膜下腔出血大鼠脑水肿讨论脑水肿是SAH患者死亡和预后不良的主要独立危险因素之一,脑水肿的一个关键表现是血脑屏障功能障碍12 。旨在保护血脑屏障的新疗法可能改善SAH患者的预后13。脑水肿可分为细胞毒性水肿和血管源性水肿，前者是由于缺血缺氧导致细胞能量代谢障碍、细胞膜上各种离子通道受损，引起水钠潴留,细胞肿胀,细胞外间隙变窄，血脑屏障破坏不明显；后者是由于血脑屏障破坏导致血管内的水、各种离子等小分子物质渗透到细胞间隙14。水通道蛋白（AQPs）是质膜通道，在细胞毒性水肿的发展中起着不可或缺的作用，因为它们促进了双向跨膜水的流动15。AQP4是该家族在中枢神经系统中的主要成员,在星形胶质细胞中大量表达。在AQP4基因敲除小鼠中,与野生型对照相比,缺血后脑水肿减少了35%，而星形胶质细胞特异性条件敲除小鼠在系统性低渗应激后脑水摄取减少了31%，这有力地支持了AQP4在细胞毒性水肿中的关键作用7.15。OAQP4与CaM的直接相互作用导致AQP4羧基端发生特异性构象变化，驱动AQP4细胞表面定位16 。我们的研究表明，在SAH早期使用种CaM拮抗剂TFP可以抑制AQP4在细胞膜的定位，大部分被停留在胞浆中。有研究表明,AQP4在中枢神经系统水肿的发生和消退中具有不同的作用，在损伤后早期,通过AQP4的水流驱动细胞毒性水肿的发展，但在后期清除血管源性水肿过程中发挥重要作用17.8 。因此，在急性期可道抑制AQP4,晚期促进AQP4的功能是防止中枢神经系统水肿的可行策略2.3。在本实验中，我们在大鼠SAH造模的同时给予TFP治疗,SAH大鼠脑水肿显著减轻,这种早期干预策略提示治疗时间窗口选择的重要性。综上所述，我们的研究结果表明，TFP可以减轻大鼠SAH后脑水肿。我们的研究扩展了目前对TFP在EBI的神经保护作用的理解。参考文献1(Griswold DP,Fernandez L,Rubiano AM.Traumatic subarachnoidhemorrhage:A scoping reviewJ.J Neurotrauma,2022,39(1-2):35-48.D0I:10.1089/neu.2021.0007.2 Doherty RJ,Henry J,Brennan D,et al.Predictive factors for pre-in-tervention rebleeding in aneurysmal subarachnoid haemorrhage:Asystematic review and meta-analysisJ.Neurosurg Rev,2022,46(1):24.D0I:10.1007/s10143-022-01930-0.3 Abir-Awan M,Kitchen P,Salman MM,et al.Inhibitors of mamma-lian aquaporin water channelsJ.Int J Mol Sci,2019,20(7):1589.D0I:10.3390/ijms20071589.4 Vandebroek A,Yasui M.Regulation of AQP4 in the central nervoussystemJ.Int J Mol Sci,2020,21(5):1603.D0I:10.3390/ijms21051603.5 Suzuki H,Kanamaru H,Kawakita F,et al.Cerebrovascular patho-physiology of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarach-noid hemorrhageJ.Histol Histopathol,2021,36(2):143-158.D0I:10.14670/HH-18-253.6 Chu H,Huang C,Ding H,et al.Aquaporin-4 and cerebrovasculardiseasesJ.Int J Mol Sci,2016,17(8):1249.D0I:10.3390/ijms17081249.7 Dempsey RJ,Baskaya MK,Dogan A.Attenuation of brain edema,blood-brain barrier breakdown,and injury volume by ifenprodil,apolyamine-site N-methyl-D-aspartate receptor antagonist,after ex-perimental traumatic brain injury in rats J.Neurosurgery,2000,47(2):399-404;discussion404-406.D0I:10.1097/00006123-200008000-00024.8 Kitchen P,Salman MM,Halsey AM,et al.Targeting aquaporin-4subcellular localization to treat central nervous system edema J.Cell,2020,181(4):784-799.D0I:10.1016/j.cell.2020.03.037.9董玉书，赵忠惠，郝广志，等.NLRP3通过下调claudin-1增加早期蛛网膜下腔出血大鼠血脑屏障通透性J.神经解剖学杂志，2 0 2 1，37（1)：6 7-7 1.D0I:10.16557/ki.10007547.2021.01.011.10 Park S,Yamaguchi M,Zhou C,et al.Neurovascular protection re-duces early brain injury after subarachnoid hemorrhage J.Stroke,2004,35（10):2 412-2 417.D 0 I:10.116 1/0 1.ST R.0000141162.29864.11 Jeon H,Ai J,Sabri M,et al.Neurological and neurobehavioral as-sessment of experimental subarachnoid hemorrhage J.BMC Neu-rosci,2009,10:103.D0I:10.1186/1471-2202-10-103.12 Ding Q,Sethna F,Wu XT,et al.Transcriptome signature analysisrepurposes trifluoperazine for the treatment of fragile X syndrome inmouse modelJ.Commun Biol,2020,3(1):127.D0I:10.1038/s42003-020-0833-4.13 Guo D,Wilkinson DA,Thompson BG,et al.MRI characterizationin the acute phase of experimental subarachnoid hemorrhage J.Transl Stroke Res,2017,8(3):234-243.D0I:10.1007/s12975-0160511-5.14 Vandebroek A,Yasui M.Regulation of AQP4 in the central nervoussystemJ.Int JMol Sci,2020,21(5):1603.D0I:10.3390/ijms21051603.15 Schmalzing G.Metabolism and disposition of trifluoperazine in therat.II.Kinetics after oral and intravenous administration in acutelyand chronically treated animals J.Drug Metab Dispos,1977,5(2):104-115.16 Thompson JW,Elwardany O,McCarthy DJ,et al.In vivo cerebralaneurysm modelsJ.Neurosurg Focus,2019,47(1):E20.DOI:320神经解剖学杂志，2023年5月第39 卷第3期10.3171/2019.4.FOCUS19219.17 Papadopoulos MC,Verkman AS.Aquaporin 4 and neuromyelitisopticaJ.Lancet Neurol,2012,11(6):535-544.D0I:10.1016/S1474-4422(12)701333.18 Suzuki H,Kawakita F,Asada R.Neuroelectric mechanisms of de-layed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhageJ.Int J Mol Sci,2022,23(6):3102.D0I:10.3390/ijms23063102.（收稿日期：2 0 2 3-0 2-2 5）书讯神经形态学图谱由国家科学技术学术著作出版基金资助，由中国解剖学会理事长、空军军医大学李云庆教授历时8 年多，收集整理国内外6 2 位学者提供的330 幅精美图片编撰而成，于2 0 2 3年3月由科学出版社出版发行。该图谱是国内首部主要借助图片系统介绍神经形态学结构的专著。本图谱采用理论说明与实践结果相结合的方式，围绕传统神经形态学染色技术、神经纤维束路示踪技术、化学神经解剖学技术和电子显微镜技术4个主题，系统、全面展示了神经形态学研究技术的原理、优缺点及其所显示的神经结构。文字介绍与实验结果相互映衬、相互辅佐，使相关技术的科学内涵更加形象直观、便于理解和记忆。本图谱按照先简单、后复杂，先发育、后成年，先外周、后中枢的规律排列图片，在图片的选择上也极力提倡各类神经形态学技术方法的综合应用，以便使读者对神经形态学技术和神经系统的结构形成深刻的理解。此外，本图谱在图片的标注、裁剪、排列、组合等方面，也有值得读者借鉴之处。正是基于本书的上述特点，中国科学院杨雄里教授在其“序”中对该图谱倾情力荐：“该图谱的出版将为学生们学习和了解神经系统的形态结构、学习神经科学的相关知识提供帮助,对于临床医务工作者或神经科学研究人员来说更是一本案头必备的工具书。”希望本书的出版能够帮助广大读者更好地学习神经解剖学，探索神经系统的奥秘。