基于扫描电子显微镜制样的不同干燥方法对棉花和水稻幼苗叶片制备的差异分析.pdf

第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ，文章编号：（）基于扫描电子显微镜制样的不同干燥方法对棉花和水稻幼苗叶片制备的差异分析徐寸发，丁林云，周 昊，汪佳蕾，杨晨晔，王 宁，杨 丹（江苏省农业科学院中心实验室，江苏 南京）摘 要 选取棉花和水稻的幼苗叶片为研究对象，利用扫描电子显微镜（，）观察两种不同作物叶片经烘箱干燥法、自然干燥法、临界点干燥法和真空冷冻干燥法处理后的叶表面微观形态，比较不同干燥方法对棉花和水稻叶片表面微观结构的影响。结果表明：含水量为 棉花叶片经烘箱干燥法和自然干燥法处理后，叶片近轴面和远轴面均发生严重皱缩现象，采用临界点干燥法和真空冷冻干燥法处理后叶片形态特征较为自然，呈现出较真实的表面特征，尤其是临界点干燥法；含水量为 水稻叶片经四种不同干燥法处理后，其叶片表面形态差异较小，均能反映水稻叶片表面真实微观结构。因此，对含水量较高的棉花叶片优选临界点干燥法制备；对含水量相对低的水稻叶片可选简单、经济的自然干燥法处理。关键词 棉花；水稻；叶片；干燥法；扫描电子显微镜中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：江苏省农业科学院科学仪器开放共享自主研究课题（）作者简介：徐寸发（），男（汉族），江西瑞金人，助理研究员：通讯作者：杨丹（），女（汉族），黑龙江齐齐哈尔人，副研究员：作为一种先进的微观结构测试技术，扫描电子显微镜（，）自 年开始用于观察植物叶表面的微观形态。叶片是植物的重要组成部分，对植物的生长、发育等具有重要影响。植物叶片的表面形态特征具有一定遗传稳定性，利用 观察叶片表面微观形态特征对植物组织的生理特性研究、种类鉴定均具有重要意义，在一定程度也能反映类群间的亲缘关系。由于植物叶片含水多，如果直接进行 观察叶片表面微观结构，往往因水分挥发造成电子束偏移引起图像飘逸，从而导致样品的 图像质量较差，且容易污染仪器内部的光阑、镜头等部件，影响灯丝正常使用寿命等。因此，为了获得植物叶片真实、清晰的微观形态特征，大多数情况下需要将叶片干燥处理后进行 观察。目前报道较多的植物叶片干燥方法主要包括烘箱干燥法、自然干燥法、临界点干燥法、冷冻干燥法等方法。然而，并不是所有植物均适合同一种干燥方法，往往需要根据样品中含水量的多少，选择合适的处理方法。侯燕鸣等探讨了含水量为 的不同植物叶片（桑叶、白菜叶和油菜叶）观察的方法，发现不同含水量植物叶片的制备方法并不一致，含水量的植物叶片可不经处理，直接进行 观察，的叶片必须经过样品干燥制备后观察，才能获得较为理想的图片。同样，有人研究发现植物花粉的含水量多少也影响其 样品的制备方法，陆生植物老鹳草花粉含水量低，采用自然干燥法即可得到结构完整清晰，无变形的图片，而对含水量高一些的水生植物睡莲花粉则需要经过固定脱水处理后才能得到真实的实验结果。棉花（）和水稻（）分别是我国重要的经济作物和粮食作物之一，与国民生活密切联系。从被子植物的形态特征上分类，棉花和水稻分别是双子叶植物和单子叶植物，在叶片结构组成、含水量等方面均存在差异，在其叶片进行 样品制备时更适合那些干燥处理方式的研究报道不多。虽然有少量关于其叶片形态报道，但尚无针对这两种植物叶片的 样品制备方法开展比较全面的研究。本研究以棉花真叶和水稻完全叶为研究对象，利用 观察两种不同作物叶片经四种不同干燥方法处理后的叶表面微观形态，比较不同干燥方法对棉花和水稻叶片表面微观结构观察的影响，以期找到适合棉花和水稻 第 期徐寸发等：基于扫描电子显微镜制样的不同干燥方法对棉花和水稻幼苗叶片制备的差异分析 叶片的 样品制备方法，为研究者更好地针对棉花和水稻的叶片微观形态观察提供参考。材料与方法 供试植物 棉花幼苗：选取陆地棉品种“苏早”饱满的种子，将其播种在蛭石与营养土混合土壤中（质量混合比为 ），将其放置光照培养箱中自然生长（，光培养，暗培养）天左右。水稻幼苗：选取饱满健康的水稻品种 的种子，催芽保湿 天，将种子均匀点播于在蛭石与营养土混合土壤中（质量混合比为 ），于人工气候箱中培养（、，光照 黑暗）中育苗 天左右。仪器设备 扫描电子显微镜（型号：；德国 公司）；体视显微镜（型号：；德国 公司）；全自动离子溅射仪（型号：；英国 公司）；真空冷冻干燥机（型号：；北京博医康实验仪器有限公司）；电热恒温干燥箱（型号：；上海精宏实验设备有限公司）。试验方法 分别选取长势较好且大小基本一致的 株棉花幼苗的真叶和 株水稻幼苗的完全叶为试验材料，并用超纯水清洗干净备用。取适量的叶片于 烘箱烘至恒重测其含水量，同时，利用体视显微镜观察并拍摄两种植物新鲜叶片的表面形态，放大倍数为 倍。此外，于棉花和水稻叶片中部分别裁取多个 大小的叶片组织块，分别用烘箱干燥法、自然干燥法、临界点干燥法和真空冷冻干燥法进行处理，具体干燥过程如下。烘箱干燥法：将选择好的棉花和水稻叶片样品放置于 烘箱中干燥 。自然干燥法：将选择好的棉花和水稻叶片放置于无尘纸上进行自然晾晒 。临界点干燥法：将选择好的棉花和水稻叶片用 的戊二醛于 冰箱中固定 （过夜），然后用 、值 的 漂洗 次，每次，再用乙醇对叶片进行梯度脱水处理：乙醇 乙醇 乙醇 乙醇 无水乙醇 脱水 次。叔丁醇进行置换 次，每次 ，最后放入临界点干燥仪干燥 。真空冷冻干燥法：将选择好的棉花和水稻叶片放置于 冰箱进行冷冻 ，然后放入真空冷冻干燥机处理 。干燥处理后的棉花和水稻的叶片，分近轴面、远轴面分别朝上，用导电胶带固定于样品台，然后用离子溅射仪进行喷金 处理后放入 样品仓进行观察并拍摄图像。样品图像采集条件：加速电压、或 的工作距离、灯丝电流、放大倍数 倍。结果与分析 自然条件下棉花和水稻叶片的表观形态 经培育的棉花和水稻适龄幼苗如图 所示：棉花植株株高 左右，展开 片真叶；而水稻植株 左右，展开第一片完全叶。从图 可看出，新鲜棉花和水稻叶片的表观形态存在一定的表观差异性，双子叶植物棉花叶片上有明显的茸毛和呈黑色点状的腺体，且茸毛仅生长于叶脉；而单子叶植物水稻叶片则具有较多平行叶脉与叶毛，叶片表面较为粗糙，叶远轴面有一突出的中脉。通过含水量测定 结 果 显 示，发 现 棉 花 叶 片 的 含 水 量 达 到，高于水稻叶片的 （表），这与两种作物的不同叶片表观差异存在一定关联。表 植物叶片的含水量 叶片名称鲜重 干重 含水量 棉花叶片 水稻叶片 干燥后棉花和水稻叶片的微观形态变化 通过 图像可看出，双子叶植物棉花叶片近轴面和远轴面结构并不一致，叶远轴面气孔分布多于近轴面，呈开放或闭合状态，叶片表面还有腺体组织且突出于普通表皮细胞（图）；然而从单子叶植物水稻叶片近轴面和远轴面的 图像可看出，叶片由众多平行叶脉构成，叶片近轴面和远轴面均具有较多乳突、哑铃型的硅细胞、叶毛和蜡质层，气孔上不仅有蜡质层覆盖，两端还有乳突分布（图）。经不同干燥方法处理后，由表、图 和图 可知，电子显微学报 第 卷图 棉花和水稻的幼苗。棉花，；水稻，。；图 棉花和水稻叶片的体视显微结构。棉花叶片近轴面；棉花叶片远轴面；水稻叶片近轴面；水稻叶片远轴面。；两种植物叶片的微观形态存在些差异，尤其棉花叶片表面形态变化较为明显；经烘箱干燥法或自然干燥法处理后，棉花叶片近轴面和远轴面表皮均发生严重的收缩，表面褶皱较为严重，几乎无法分别出表皮细胞；然而，经临界点干燥法或真空冷冻干燥法处理后，棉花叶片近轴面和远轴面表皮未发生严重的皱缩现象，能看清棉花叶片表面的真实微观形态，不过真空冷冻法处理后棉花叶片远轴面有些破损；相比之下，水稻叶片经烘箱干燥法和自然干燥法后，虽然叶脉间距稍微有些收缩，但与经临界点干燥法或真空冷冻干燥法处理的结果对比差异较小，整体上均能获得水稻叶片近轴面和远轴面真实的微观结构。第 期徐寸发等：基于扫描电子显微镜制样的不同干燥方法对棉花和水稻幼苗叶片制备的差异分析 图 不同处理条件下棉花叶片的 图像。，分别为烘箱干燥法下的叶片近轴面和远轴面；，分别为自然干燥法下的叶片近轴面和远轴面；，分别为临界点干燥法下叶片近轴面和远轴面；，分别为真空冷冻干燥法下叶片近轴面和远轴面。，；，；，；，电子显微学报 第 卷图 不同干燥处理法下水稻叶片的 图像。，分别为烘箱干燥法下的叶片近轴面和远轴面；，分别为自然干燥法下的叶片近轴面和远轴面；，分别为临界点干燥法下叶片近轴面和远轴面；，分别为真空冷冻干燥法下叶片近轴面和远轴面。，；，；，；，第 期徐寸发等：基于扫描电子显微镜制样的不同干燥方法对棉花和水稻幼苗叶片制备的差异分析 表 四种干燥方法对叶片表面形态的影响 植物叶片干燥方法叶片是否发生收缩叶片表面形态烘箱干燥是近轴面和远轴面均不平整，严重皱缩，有不规则块状凸起棉花叶片自然干燥是近轴面和远轴面均不平整，严重皱缩，近轴面呈条带状凸起，远轴面围绕气孔周围凸起临界点干燥否近轴面和远轴面较为平整，表皮细胞明显真空冷冻干燥否近轴面和表面较为平整，近轴面有少许条状褶皱，表皮细胞明显，远轴面有些损伤烘箱干燥是叶脉间距变小，有较多乳突和叶毛结构，蜡质层覆盖于表面，叶毛有些干煸水稻叶片自然干燥是叶脉间距变小，有较多乳突和叶毛结构，蜡质层覆盖于表面临界点干燥否有较多乳突和叶毛结构，蜡质层覆盖于表面真空冷冻干燥否有较多乳突和叶毛结构，蜡质层覆盖于表面 讨论与结论 比起体视显微镜观察的棉花和水稻叶片表面形态，可以观察发现叶片表面更加细微的结构特征，如水稻叶片表面的蜡质层，更能清晰展示叶片的微观形态特征。本研究结果表明，棉花和水稻的叶片经过不同干燥处理后所得到的微观形态特征的差异，与样品的制备方法密切相关。从样品制备过程的复杂性、时间和经济成本而言：烘箱干燥法和自然干燥法操作简单、时间短、成本低廉，尤其是自然干燥法；临界点干燥法操作复杂、时间长、需使用多种试剂；真空冷冻法虽然操作简单，但需要的时间较长，经济成本相对较低。从干燥原理而言：烘箱干燥法是通过加热使叶片中水分转化成水蒸气而达到快速脱水的效果；自然干燥法是在室温下，借太阳的辐射热或自然风力使叶片中水分气化而达到干燥目的；临界点干燥法是液态 替换叶片中的溶剂，通过升温使液态 从液体转为气体达到干燥效果；真空冷冻干燥法是将叶片在下冷冻成固态，在真空条件下叶片中的水分直接升华成气态而达到脱水目的。在叶片进行干燥处理过程中，由于水具有较大的内聚力和电极性，可与样品中的极性成分瞬间结合，在干燥时存在的表面张力牵动样品组分导致发生形变，影响对样品真实形态的观察。在使用临界点干燥法处理时，在临界点条件下，叶片表面张力为零，可很大程度上降低表面应力对样品的破坏，同样真空冷冻干燥中样品水分直接由固态升华为气态，也避免了气相和液相之间表面张力对样品的损伤。本研究发现，在临界点干燥或真空冷冻干燥过程中，由于大大降低了叶片表面张力的影响，棉花和水稻叶片表面均未发生明显皱缩，呈现出真实微观结构，有研究者发现冷冻干燥过程中冷冻和脱水应力可能会造成植物叶片的损伤；然而，棉花和水稻叶片在烘箱干燥或自然干燥过程中，叶片表面张力对棉花叶片影响明显，表面发生严重皱缩，而对水稻叶片的影响较小，这可能是棉花叶片含水量明显高于水稻叶片的缘故。姚锐等研究也发现含水量较低的黑麦类作物叶片，直接用自然干燥法制备 样品，也可获得较为理想的叶片表面微观形态。综上所述，针对含水量相差较多的植物样品，在 样品制备过程中可以选择不同的干燥处理方法。对含水量较高的棉花叶片，优先选择能保留真实微观形态、不破坏表面结构的临界点干燥法；对含水量较低的水稻叶片，建议采用最简单、经济的自然干燥法进行样品制备。参考文献：，（）：，（），（）：赵孟良，任延靖扫描电子显微镜在植物中应用研究进展 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