单克隆抗体类生物制品关键质量属性.pdf

CHINA MEDICINE AND PHARMACY Vol.13 No.18 September 2023177 2023年9月第13卷第18期工作探讨 基金项目 江苏省市场监督管理局科技计划项目（KJ2023061）；江苏省苏州市科技计划项目（SYS2020199）。通讯作者单克隆抗体类生物制品关键质量属性景荣先1曾媛2张国林3 1.南京医科大学附属苏州医院苏州市立医院药学部，江苏苏州215002；2.辉瑞（中国）研究开发有限公司中国药物研发部临床药理部，上海201203；3.苏州市药品检验检测研究中心，江苏苏州215104 摘要 分析单克隆抗体（mAb）类生物制品关键质量属性（CQAs）及影响其杂质检测结果准确性、可靠性的因素。依据 mAb 类药物的特点及目标产品质量概况（QTPP）分析其关键质量属性。质量属性可分为关键的和非关键的：质量属性是否作为 CQAs 主要通过评价其超出可接受范围时对产品安全性和有效性的影响程度。mAb 类药物 CQAs 包括等电点、单体、大小变异体、电荷变异体、N-糖基化修饰、唾液酸含量、生物学活性等。研究 mAb 类生物制品 CQAs、分析其杂质检测结果准确可靠的影响因素对产品治疗控制和临床用药安全具有重要的价值。关键词 单克隆抗体；杂质；质量；准确性；稳定性 中图分类号 R927.1 文献标识码 A 文章编号 2095-0616（2023）18-0177-04DOI:10.20116/j.issn2095-0616.2023.18.42Critical quality attributes of monoclonal antibody-based biological productsJINGRongxian1ZENGYuan2ZHANGGuolin31.Pharmacy Department,the Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University,Suzhou Municipal Hospital,Jiangsu,Suzhou 215002,China;2.China Drug Research and Development Department,Clinical Pharmacology Department,Pfizer(China)Research and Development Co.,Ltd.,Shanghai 201203;3.Suzhou Institute for Drug Control,Jiangsu,Suzhou 215104,ChinaAbstract To analyze the critical quality attributes(CQAs)of monoclonal antibody(mAb)based biological products and the factors that affect the accuracy and reliability of impurity detection results.Analyze the critical quality attributes of mAb drugs based on their characteristics and quality target product profile(QTPP).Quality attributes can be divided into critical and noncritical:whether quality attributes are considered CQAs mainly depends on evaluating their impact on product safety and effectiveness when they exceed the acceptable range.CQAs of mAb drugs include isoelectric points,monomers,size heterogeneities,charge heterogeneities,N-glycosylation modifications,sialic acid content,biological activity,etc.Studying the CQAs of mAb biological products and analyzing the factors that affect the accuracy and reliability of impurity detection results are of great value for product treatment control and clinical medication safety.Key words Monoclonal antibody;Impurities;Quality;Accuracy;Stability单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）已成为抗肿瘤治疗领域发展最为迅猛的生物药类型1-2。目前已批准上市的治疗性 mAb 类药物有 70 余种，结构多为两条重链和两条轻链经二硫键和非共价键联合形成的免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）大分子。mAb 类药物抗原表位、理化性质和生物活性均一性程度较高，能特异性与靶标分子结合，免疫原性低，患者耐受性好。但由于其分子量大、立体结构复杂，在生产、纯化、贮存和运输等过程中易产生变异体，影响药物的安全性、有效性、稳定性和生物学活性，甚至产生免疫原性导致严重后果3-4。程 序 性 死 亡 受 体-1（programmed cell death protein 1，PD-1）、血 管 内 皮 生 长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）等都是 mAb 药物的靶点5-6。肿瘤细胞高表达细胞程序性死亡-配体 1/2（programmed cell death ligand 1/2，PD-L1/L2），抑制 T 细胞功能，导致肿瘤细胞无法被杀灭，而 PD-1 mAb 药物可以阻断这一通路，恢复 T 细胞功能，使免疫细胞继续杀伤肿瘤细胞。血管内皮生CHINA MEDICINE AND PHARMACY Vol.13 No.18 September 2023178 2023年9月第13卷第18期工作探讨长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）参与多种恶性肿瘤的发生和细胞迁移、凋亡过程，是肿瘤治疗的关键靶点之一。随着临床需求的增加和抗 VEGF mAb 原研药（安维汀）专利到期，国内相关生物类似药贝伐珠单抗的研发如火如荼，并已有9 个品种获批。目标产品质量概况（quality target of product profile，QTPP）是产品质量属性的前瞻性总结和预期目标，是与产品质量、安全和有效性相关的质量属性。质量属性可分作关键的和非关键的：质量属性是否作为关键质量属性（critical quality attributes，CQAs）主要通过评价其超出可接受范围时对产品安全性和有效性的影响程度7-8。研究 mAb 类生物制品 CQAs、分析其杂质检测结果准确可靠的影响因素对产品治疗控制和临床用药安全具有重要的价值。1单抗类药物的CQAsCQAs 是 mAb 类药物符合预期用途的关键属性，通常根据产品特点及 QTPP 方面切入分析。mAb 的 CQAs 主要包括等电点、单体、大小变异体、电荷变异体、N-糖基化修饰、唾液酸含量、生物学活性等，是影响药品安全性和有效性的重要指标。CQAs 与产品的高级结构、生物活性及免疫原性等均密切相关。单体是 PD-1 mAb 药物的作用基础，分子大小变异体是最常见的变异体类型，也是影响抗体稳定性的关键因素。分子大小变异体影响抗体的活性和效价，使蛋白单体浓度降低，增加药物的免疫原性。鉴定分子大小变异体的种类，分析其形成的机制和对产品质量的影响并采取适当控制措施是单抗类产品整个生命周期中都需要关注的问题。分子大小变异体包括高分子量变异体（high molecular weight，HMW）和低分子量变异体（low molecular weight，LMW）。前者主要是 mAb 药物发生聚合形成二聚体或多聚体形成的，后者是由于mAb 药物发生降解或分子发生断裂形成低分子量蛋白造成的。分子大小变异体随时间变化率可提供聚体的功能特征，且对应着 mAb 药物产品的有效期。1.1电荷异质性电荷异质性是 mAb 药物变异体的另一类型9。细胞培养条件变化、纯化工艺及产品储存条件变化等均会引起 mAb 药物电荷异质性。mAb 药物电荷异质性会影响单抗的稳定性，对其功能和组织分布及药代动力学均有明显的影响。电荷变异体分析是 mAb 药物质量控制的重要参数。酸性变异体与碱性变异体是 mAb 药物电荷变异体的主要类型，其中门冬酰胺脱酰胺和糖化修饰是酸性变异体的常见来源。1.2等电点（isoelectric point，pI）等电点是反映 mAb 电荷异质性的关键指标，可体现药物电荷与空间构象的均一性10。采用等点聚焦电泳（iso-electric focusing，IEF）分析时，酸性变异体的表观 pI 小于抗体主峰，而采用阳离子交换 色 谱（cation exchange chromatography，CEX）分析时，酸性变异体的保留时间小于抗体主峰。mAb的 C 端发生 Lys 修饰及 N 端谷氨酰胺的不完全环化是碱性变异体的主要来源。门冬氨酸异构化及甲硫氨酸氧化也是碱性变异体的重要原因。采用IEF 分析时，碱性变异体的表观 pI 大于抗体主峰，而采用 CEX 分析时，碱性变异体的保留时间大于抗体主峰。mAb 药物电荷异质性分析可以作为批间一致性评价的参考指标，也可通过分析电荷的分布情况监测整个生产工艺流程，推动产品生产工艺的优化。mAb 药物电荷变异体的检测技术主要包括离子交换色谱（ion exchange high performance liquid chromatography，IEX-HPLC）、毛细管等电聚焦电泳（capillary iso-electric focusing，cIEF）和全柱成像毛细管等电聚焦电泳（imaging capillary electrofocusing electrophoresis，iCIEF）等11-15。mAb 药物变异体的产生是一个动态过程，分析引起变异体的因素并采取应对措施可以有效降低变异体的发生率。分析变异体随时间变化的趋势并采取措施对产品实施质量控制比检测终产品变异体更为重要，而揭示单抗类产品容易发生聚集的机制，并从产品设计和工艺改进以降低变异体的发生比分析变异体的时间变化趋势更重要。1.3糖基化大部分 mAb 是由中华仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）表达系统生产的。mAb生产过程中易受到各种内外部因素影响而发生翻译后修饰（post-translational modification，PTM）而产生变异体影响 mAb 的稳定型和与目标抗原的结合活性，并可能产生免疫原性。糖基化（glycosylation）和糖化（glacation）修饰是最常见的 PTM 类型16-17。糖化为非酶促化学修饰反应，主要是还原糖（葡萄糖、半乳糖等）的醛基与生物大分子（核酸、蛋白质等）的伯氨基发生缩合反应形成 Schiff 碱，进一步发生 Amadori 重排并形成稳定的共价键的状态。在抗体药物中，糖化主要发生在重链互补决定区 3 的Lys 上。糖化是重组抗体药物异质性的重要原因，对该类药物的结构、理化特性和稳定型及安全性造 CHINA MEDICINE AND PHARMACY Vol.13 No.18 September 2023179 2023年9月第13卷第18期工作探讨成不利影响。糖基化为酶促化学修饰反应，即在糖基转移酶的作用下，非糖生物大分子与糖共价结合的反应18。N-糖基化和 O-糖基化是最常见的糖基化连接方式。mAb 的翻译后糖基化修饰会影响药物的稳定型、溶解性和空间结构及生物活性等，也会对该类药物在体内的代谢和分布造成一定的影响。目前，FDA 和 EMEA 及中国药典等均要求对 mAb 药物的糖化水平进行分析。mAb 的糖基化是其 CQAs 之一。N-糖基化和 O-糖基化是 PD-1 mAb 药物的主要糖基化修饰。N-糖基化即寡糖连接到门冬酰胺上，其经典的保守序列为 Asn-AA-Ser/Thr-AA。PD-1mAb 药物上 N-糖基化的发生与宿主细胞、培养基组成和培养条件有关。mAb 药物糖化的重链和轻链在还原的十二烷基硫酸钠-毛细管电泳（capillary electrophoresis-sodiumdodecyl sulfate，CE-SDS）表现为峰图展宽，且轻链在紫外光或激光诱导荧光检测可出现肩峰，可用于 PD-1 mAb药物的糖型分析。采用常规紫外检测器或荧光检测器的亲水作用色谱和毛细管电泳等是基于标记的糖型分析手段19-20。O-糖基化是在糖基转移酶的作用下，在 Ser 或 Thr 上连接糖链的过程。O-糖基化糖链结构复杂，无典型的核心结构和通用的内切酶，分析难度较大。O-糖基化的分析策略通常是采用 消除释放 O-糖链，对释放的糖链进行荧光标记后进行色谱分离和荧光检测器检测。1.4生物学活性生物学活性是单抗类药物筛选、表征和放行的重要属性，也是稳定性研究的重要指标。虽然仪器分析技术的进步为单抗分子结构的确定提供了新的思路和手段，但其高级结构及其翻译后修饰的研究仍存在诸多局限性。生物学活性分析是分析单抗类生物制品高级结构研究的重要措施。目前，单抗类药物生物学活性分析的方法主要有细胞毒性法、细胞增殖抑制法、补体依赖的细胞毒性法、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性法和报告基因法等21-26。生物学活性是反映生物学性质的重要方法，是体现单抗类药物特定生物学效应的量值，是药物高级结构确证的补充，是单抗类药物的关键质量属性之一。2小结mAb 已成为抗肿瘤治疗领域发展最为迅猛的生物药物类型。但由于其分子量大、立体结构复杂，在生产、纯化、贮存和运输等过程中易产生变异体，影响药物的安全性、有效性、稳定性和生物学活性，甚至产生免疫原性造成严重后果。研究 mAb 类生物制品 CQAs、分析其杂质检测结果准确可靠的影响因素对产品治疗控制和临床用药安全具有重要的价值。mAb 的 CQAs 主要包括等电点、单体、大小变异体、电荷变异体、N-糖基化修饰、唾液酸含量、生物学活性等，是影响药品安全性和有效性的重要指标，与产品安全性和有效性均密切相关。参考文献 1 张志宇，邢体坤，王斌，等.单克隆抗体药物治疗自身免疫性疾病研究进展 J.中国医药科学，2022，12（13）：57-61.2 张国林，景荣先，郭乐，等.治疗性单克隆抗体类药物分析技术及其应用 J.中国新药杂志，2021，30（6）：528-534.3 郭亚明，朱兴，戴朝六，等.阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗治疗肝细胞癌的现状 J.中华肝胆外科杂志，2022，28（10）：789-792.4 曹卫荣，袁灿，张迪，等.酶法定点制备抗 HER2 抗体偶联药物的质量研究 J.中国药学杂志，2022，57（20）：1762-1770.5 袁俊杰，高栋，胡锋，等.阿达木单抗电荷异构体的分离和表征 J.高校化学工程学报，2021，35（5）：840-848.6 董菊红，宗云岗，张标，等.国内 PD-1 抑制剂研发与上市竞争透析 J.中国处方药，2022，20（3）：28-31.7 李思鹏，张仲理，许圣昌，等.单抗生物类似药与原研药质量相似性研究解析 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