2022年云南省边境地区牛蓝舌病病毒及阿卡斑病毒抗体检测.pdf

10流 行 病 学2022 年云南省边境地区牛蓝舌病病毒及阿卡斑病毒抗体检测谢佳芮，寇美玲，陈文瑾，李桂芬，苗海生（云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明650224）摘要：为了解云南省边境地区牛蓝舌病病毒（bluetongue virus，BTV）与阿卡斑病毒（Akabane virus，AKAV）的流行与分布现状，2022 年在云南省 9 个边境县（市）采集 1 820 份牛血清样本，应用 cELISA 方法进行 BTV与 AKAV 抗体检测，并对检测结果利用 IBM SPSS Statistics 22、Excel 2007 等软件进行区间、群间和时间的分类统计分析。结果显示：共检出 BTV 阳性样品 1 207 份，样品阳性率为 66.32%（1 207/1 820）；检出 AKAV 阳性样品 350 份，样品阳性率为 32.17%（350/1 088）。各县（市、区）的 BTV 样品阳性率为 43.50%93.00%，AKAV 为 12.90%50.00%，不同地区间的差异有统计学意义（P 0.01）；黄牛和西门塔尔牛的 BTV 和 AKAV抗体样品阳性率均高于水牛，入境牛 BTV 抗体阳性率显著高于本土牛，两组数据差异均有统计学意义（P 0.01）；规模养殖场的 BTV 和 AKAV 抗体阳性率和散养户差异无统计学意义（P 0.05）；78 月的 BTV和 AKAV 抗体阳性率显著高于 56 月（P 0.01）。结果表明：BTV 和 AKAV 在云南省边境地区已广泛存在，其感染有加重趋势；病原通过境外牛传入国内的风险不断增加，防控形势较为严峻。因此，云南省应继续加强边境地区 BTV、AKAV 等虫媒病毒的监控，并制定实施相应防控措施，以保障国内畜牧业健康发展。关键词：蓝舌病病毒；阿卡斑病毒；竞争 ELISA；抗体检测；边境地区；入境牛中图分类号：S852.5文献标识码：A文章编号：1005-944X（2023）08-0010-06DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2023.08.003Detection of Antibodies against Bovine Bluetongue Virus and Akabane Virus in Yunnan Border Areas in 2022Xie Jiarui，Kou Meiling，Chen Wenjin，Li Guifen，Miao Haisheng（Yunnan Academy of Sciences of Animal Husbandry and Veterinary，Key Laboratory of Tropical and Subtropical Animal Viral Diseases of Yunnan Province，Kunming，Yunnan650224，China）Abstract：In order to investigate the status of prevalence and distribution of bovine bluetongue virus（BTV）and Akabane virus（AKAV）in Yunnan border areas，1 820 bovine serum samples were collected in 9 border counties（cities）in the province in 2022 to detect antibodies against the two viruses by cELISA，based on the results，statistical analysis was conducted from the aspects of regions，populations and time using IBM SPSS Statistics 22，Excel 2007 and other softwares.The results revealed that 1 207 BTV-positive and 350 AKAV-positive samples were detected，with positive rates of 66.32%（1 207/1 820）and 32.17%（350/1 088），respectively.The positive rate in each county（city/district）was 43.50%-93.00%for BTV samples，and 12.90%-50.00%for AKAV，with statistical significance（P 0.01）among different regions；the positive rates of antibodies against BTV and AKAV were both higher in yellow cattle and Simmental cattle compared to those of buffalo，and that of antibodies against BTV in entry cattle was higher than that 收稿日期：2023-04-20修回日期：2023-06-01基金项目：云南省重大科技专项计划项目（202102AE090039）；云南省畜禽种质创新及标准化养殖技术推广 专项资金项目；云南省郭慧琛专家工作站项目（202205AF150007）通信作者：苗海生。E-mail：112023年第40卷第8期流 行 病 学of native cattle，with a statistical significance（P 0.01）between the two groups；the positive rates of antibodies against BTV and AKAV in large-scale farms were similar（P 0.05）to those in free-range farms；and obviously higher from July to August than those from May to June（P 0.01）.In conclusion，BTV and AKAV had been widely and increasingly available in Yunnan border areas，with increasing entry risk introduced by overseas cattle，which made the fighting against the two diseases more severe.Therefore，BTV，AKAV and other arthropod-borne viruses should be further monitored in Yunnan border areas，and corresponding countermeasures should be developed and implemented to safeguard healthy development of domestic livestock industry.Key words：BTV；AKAV；c-ELISA；antibody detection；border area；entry cattle蓝舌病（bluetongue，BT）是由蓝舌病病毒（bluetongue virus，BTV）引起的一种通过吸血库蠓传播的虫媒病毒病，牛、羊等反刍动物对其易感，致死率为 20%30%，目前尚无有效的治疗方法1。BTV不同血清型间缺乏有效的交叉免疫保护，因而会出现不同血清型毒株在同一区域混合流行的情况，这给 BT 防控带来了极大挑战2。阿卡斑病（Akabane disease）是由阿卡斑病病毒（Akabanne disease virus，AKAV）引起牛、绵羊、山羊胎儿的先天性疾病，临床上以妊娠母羊的流行性流产，产死胎、畸形胎，新生胎儿发生关节弯曲为特征。我国部分牛、羊血清中含有 AKAV 抗体，揭示我国有该病存在3。BTV和AKAV主要侵害反刍动物，其中牛、绵羊、山羊对其最易感，其流行具有明显的季节性和地区性，热带、温带湿热的夏秋季以及吸血昆虫活跃季节，池塘、河流较多的地区，多呈地方性流行或散发4。云南省地理位置特殊，气候复杂多变，生态系统多样，自然资源丰富，这为蠓虫提供了孳生栖息的良好环境。同时云南省边境地区与周边国家交往频繁，是主要的陆上通道。与云南省相邻的东南亚国家动物疫情不断发生，动物带毒情况较为普遍，尤其是虫媒病毒病流行严重。近年来，国内牛肉消耗量快速增长，大量牛通过口岸或边境进入我国境内，因此云南省边境地区的虫媒病疫情防控形势严峻3。为掌握云南省边境地区牛群 BTV 和 AKAV 感染情况，全面了解这 2 种病原在云南省边境地区的分布情况和危害程度，本研究应用 cELISA 检测试剂盒，对云南省 9 个边境县（市）采集牛血清进行BTV、AKAV 抗体检测，评估这 2 种病原的感染状况和境外传入风险，以期为边境地区这 2 种疫病防控政策研究与制定提供依据。1材料与方法1.1病例定义经 cELISA 抗体试剂盒检测为 BTV 或 AKAV抗体阳性的牛为抗体阳性个体；场内至少有 1 头BTV 或 AKAV 抗体阳性个体的牛场为抗体阳性场。1.2样本来源及抽样原则牛血清样品，由当地动物疫病防控机构随机采自云南沧源、勐海、勐腊、芒市、盈江、富宁、景洪、澜沧、施甸 9 个边境县（市）的 22 个养殖场、88 个散养户；采样地点，选择气温高、降雨量大、日照时间长、相对湿度大，适于媒介昆虫库蠓生长和繁殖的地区。每个县（市）按所属地理位置划定采样区域，随机抽取养殖场19个、散养户119个；场户内，根据存栏量按比例通过颈静脉随机采集牛血清样品。各地区具体采样信息见表 1。1.3主要仪器和材料BTV、AKAV cELISA 检测试剂盒、PBST（磷酸盐缓冲液+Tween 20），为云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室制备；PBS 干粉、Tween 20，购自云南丰科生物科技有限公司；Multiskan FC 酶标仪，购自 Thermo 公司。1.4抗体检测1.4.1BTV、AKAV血清抗体在96孔ELISA板，每孔加 12 L 待检血清和阴、阳性对照样品；按1:100 稀释豚鼠竞争抗体，每孔加入 50 L 稀释好12流 行 病 学的竞争抗体，震荡混匀，37 温育 1 h；用 PBST 洗液洗板 3 次，拍干；按 1:1 000 稀释兔抗豚鼠酶标二抗，每孔 50 L，37 温育 30 min；用 PBST洗液洗板 5 次，拍干；每孔加 50 L 底物反应液，37 避光温育 1015 min，加 50 L 终止液终止反应，用酶标仪在 450 nm 波长下读取结果。质控标准：两个阳性对照孔 A450 0.2，两孔 A450差距0.05，两个阴性对照孔 1.0 A450 1.6，两孔 A450差距 0.2。判定标准：抑制率（PI）=（阴性对照A450平均值-样品血清 A450）/阴性对照 A450平均值 100%计算，抑制率 50%时判为抗体阳性，否则为阴性5。AKAV 血清抗体检测方法与 BTV一致。质控标准：两个阳性对照孔 A450 0.2，两个阴性对照孔 A450 0.8。判定标准：按照公式抑制率（PI）=（1-样品血清/阴性对照 A450平均值）100%计算；抑制率 40%时判为阳性，否则为阴性6。1.4.2检测结果分析利用 IBM SPSS Statistics 22 软件对检测结果进行统计分析，用卡方检验进行数据间显著性分析，用 Excel 2007 软件统计数据。根据样品采样记录，按采样地区、牛品种、牛来源、采样时间和采样场点进行分类统计。2结果与分析2.1总体情况在 1 820 份血清样品中检出 1 207 份 BTV 抗体阳性，样品阳性率为 66.32%（1 207/1 820），场户阳性率为 96.36%；在 1 088 份血清样品中，检出 350 份 AKAV 抗体阳性，样品阳性率为 32.17%（350/1 088），场户阳性率为 84.38%。因采样牛群均未免疫过 BTV、AKAV 疫苗，以上样品阳性率可视为各病原的自然感染率。上述结果表明，云南省边境地区这2种病原流行较普遍，感染较严重。2.2地域分布不同地区统计结果（表 2）显示：各县（市）牛 BTV 样品阳性率为 43.50%93.00%，AKAV 样品阳性率为 12.90%50.00%，不同地区间的差异有统计学意义（P 0.01）。结果表明，这 2 种病原在云南省边境地区存在一定的区域流行差异。2.3群间分布2.3.1牛来源不同来源牛统计结果（表3）显示：境内本地牛BTV样品阳性率为67.41%（658/976），入境牛为 100%（44/44），两组数据差异有统计学意义（P 0.01）；境内本地牛 AKAV 样品阳性率为36.29%（192/529），入境牛为18.18%（6/33），两组数据差异有统计学意义（P0.01）。结果表明，不同来源牛 2 种病原的感染状况不一，其中入境牛BTV 感染严重，而境内本地牛 AKAV 感染较重。2.3.2牛品种不同品种牛统计结果（表4）显示：黄牛 BTV 样品阳性率为 73.22%（577/788），西门塔尔牛为 72.00%（18/25），均高于水牛 64.13%表 1云南省边境地区样品采集信息县（市）样品数/份采样时间养殖场数/个（样品数/份）散养户数/个（样品数/份）BTVAKAVBTVAKAVBTVAKAV沧源2001248 月1（61）1（61）6（139）4（63）勐海20012457 月0（0）0（0）25（200）13（124）勐腊20012058 月4（93）0（0）8（107）9（120）芒市2101248 月 4（158）3（124）7（52）0（0）盈江2101247 月 5（210）4（124）0（0）0（0）富宁20012478 月0（0）0（0）9（200）6（124）景洪2001247 月3（78）2（62）7（122）4（62）澜沧20010458 月2（68）2（70）11（132）2（34）施甸20012067 月 3（103）2（62）15（97）12（58）合计/平均1 8201 08858 月22（771）14（503）88（1 049）50（585）132023年第40卷第8期流 行 病 学（143/223），差异有统计学意义（P 0.05）；黄牛 AKAV 样品阳性率为 43.17%（180/417），西门塔尔牛为 56.00%（14/25），均高于水牛 28.93%（57/197），差异有统计学意义（P 0.01）。结果表明，黄牛和西门塔尔牛 2 种病原的感染状况较水牛严重。2.3.3牛养殖规模不同采样场点统计结果（表5）显示：养殖场牛 BTV 样品阳性率为 65.01%（444/683），散养户为 67.10%（763/1 137），差异无统计学意义（P 0.05）；养殖场牛 AKAV样品阳性率为 30.22%（152/503），散养户牛为33.85%（198/585），差 异 无 统 计 学 意 义（P 表 4不同品种牛 BTV 和 AKAV 抗体检测结果统计品种血清样品总数/份 阳性样品数/份样品阳性率/%BTVAKAVBTVAKAVBTVAKAV黄牛78841757718073.2243.17水牛2231971435764.1328.93西门塔尔牛2525181472.0056.00背景不详7844494699959.8222.05合计/平均1 8201 0881 20735066.3232.17表 22022 年不同地区牛 BTV、AKAV 抗体检测结果统计县（市）被检样品数/份阳性样品数/份样品阳性率/%采样场户数/个阳性场户数/个场户阳性率/%BTVAKAVBTVAKAVBTVAKAVBTVAKAVBTVAKAVBTVAKAV沧源2001241261663.0012.90757410080.00勐海2001241135456.5043.552513251010076.92勐腊2001201862993.0024.17129129100100芒市2101241253259.5225.81113113100100盈江2101241474970.0039.525454100100富宁2001241486274.0050.009696100100景洪2001241334966.5039.52106106100100澜沧2001041423571.0033.6513413310075.00施甸200120 872443.5020.00181414977.7064.29合计/平均1 8201 0881 20735066.3232.17110641065496.3684.38表 3不同来源牛 BTV 和 AKAV 抗体检测结果统计来源阳性总数/份平均阳性率/%地区阳性场户数/个（阳性样品数/份）养殖场散养户BTVAKAVBTVAKAVBTVAKAVBTVAKAV背景不详（BTV，n=600；AKAV，n=364）1261666.5018.96沧源1（35）1（6）6（91）3（10）8724施甸3（52）2（10）11（35）7（14）18629勐腊0（0）0（0）12（186）9（29）本地（BTV，n=976；AKAV，n=529）1043367.4136.29勐海0（0）0（0）28（104）9（33）12532芒市 4（103）3（32）7（22）0（0）8618盈江4（86）2（18）0（0）0（0）5312景洪1（19）1（8）4（34）1（4）14235澜沧2（59）2（33）11（83）1（2）14862富宁0（0）0（0）9（148）6（62）国内其他地区（BTV，n=200；AKAV，n=162）92153.0051.23勐海0（0）0（0）1（9）1（21）1725盈江1（17）2（25）0（0）0（0）8037景洪2（29）1（14）3（51）3（23）入境（BTV，n=44；AKAV，n=33）44610018.18盈江1（44）1（6）0（0）0（0）14流 行 病 学0.05）。结果表明，这 2 种病原的流行与养殖规模无关。2.4时间分布不同采样时间统计结果（表 6）显示：2022年 58 月，牛 BTV 样品阳性率整体呈升高趋势，其中 78 月阳性率显著高于 56 月（P 0.01）；2022 年 78 月采集的牛血清样品 AKAV阳性率显著高于 56 月（P 0.01）。结果表明，2 种病原的流行有一定的季节分布特征，随气温升高，其流行率呈上升趋势。3讨论吸血库蠓叮咬家畜可传播 BTV，因此 BT 的分布与库蠓活动范围密切相关。由于全球气候变暖，加之媒介昆虫种类的增加和全球贸易的频繁往来，BTV 已经传播至中东地区以及亚洲其他国家和南美洲国家等，甚至蔓延至寒冷的北欧国家7。我国于 1979 年在云南省师宗县首次发现 BT 并成功分离到 BTV 毒株。目前，我国 31 个省（自治区、直辖市）已发现 BTV 血清阳性动物，主要流行的致病血清型为 BTV-1 型和 BTV-16 型，尚未发现高致病性 BTV-8 型。但随着全球贸易化的高速发展，高致病性 BTV-8 型随时可能传入我国。目前已发现 28 种 BTV 血清型，这些血清型病毒分布于全球各地，各血清型间没有交叉保护性8。此外，BTV基因组为分节段的双链 RNA（dsRNA），当宿主或者传播媒介感染了一种以上的毒株或者血清型时，病毒基因可发生重组，产生新的毒株9。西双版纳州勐腊县地处云南省最南端的中缅边境地区，属热带、亚热带气候，雨量充沛，高温高湿，植被丰富，适宜蚊虫生存和繁殖。中缅两国通道众多，人员边贸往来频繁，常年存在走私猪、牛等动物及其制品（冻品）等违法行为，从境外低价收购未经检疫的牛，通过边境村庄的 20 多个非法通道进入国内10。如此反复的活动，导致大量印度、孟加拉国、泰国、老挝、缅甸等国家的牛非法进入我国。据报道4，老挝反刍动物的 BTV 抗体阳性率高达 96.7%，牛 BTV 感染严重。同时，勐腊县的库蠓种类相较于云南省其他地方更为丰富，存在多种库蠓种群，比如琉球库蠓、短须库蠓、长斑库蠓和荒川库蠓等11。这可能是勐腊县牛 BTV 抗体阳性率较高的原因之一。曾嘉庆等4对云南省边境 7 市 20182019 年、2021 年的牛血液样品进行了 BTV 检测，发现抗体阳性率从11.86%上升至 2021 年的 23.22%。寇美玲等12-13对云南省边境 12 县市 2019 年、2020 年的牛血清样品进行 BTV ELISA 检测，发现总阳性率分别为表 5不同采样场点的牛 BTV 及 AKAV 抗体检测结果统计场户类型检测血清数/份 阳性血清数/份样品阳性率/%阳性场户数/个场户阳性率/%BTVAKAVBTVAKAVBTVAKAVBTVAKAVBTVAKAV养殖场 68350344415265.0130.221814100100散养户1 13758576319867.1033.85924093.0080.00合计/平均1 8201 0881 20735066.0532.171105496.5084.36表 6不同采样时间牛 BTV 及 AKAV 抗体检测结果统计采样时间血清总数/份阳性数/份样品阳性率/%BTVAKAVBTVAKAVBTVAKAV2022 年 5 月109109472343.1221.102022 年 6 月124120491039.528.332022 年 7 月76545152618868.7641.692022 年 8 月82240858512971.1731.62合计/平均1 8201 0881 20735066.3232.17152023年第40卷第8期流 行 病 学73.1%、77.9%。富宁县牛 AKAV 抗体样品阳性率最高，且抗体阳性率从 2017 年的 24%3升高至 2022 年的50%，同时边境其他地区 AKAV 抗体阳性率也呈现逐年升高的态势。对境内本地牛和入境牛的检测结果统计发现，入境牛 BTV 抗体阳性率几乎是 100%，明显高于本地牛（67.41%）；境内本地牛 AKAV 抗体阳性率为 36.29%明显高于入境牛（18.18%）。这可能有来源牛背景信息收集不完全的原因。但本研究的统计结果表明，接壤国家的BTV 流行较为严重，对我国本地牛群威胁较大。2020 年以来，受新型冠状病毒感染疫情影响，动物贸易停滞，在没有外来动物疫病传入风险的背景下，BTV 和 AKAV 的抗体阳性率仍然升高，且养殖场和散养户等不同养殖规模牛群的抗体阳性率无显著差异，从某种程度上说明云南省边境地区的BTV和AKAV已广泛传播定殖。本研究发现，黄牛、西门塔尔牛和水牛均存在 BTV 和 AKAV 感染，但水牛的抗体阳性率与其他品种牛相比明显偏低，与寇美玲等3，12的检测结果一致。这其中可能有水牛样本较少的原因，牛品种与 BTV 和 AKAV 感染之间的关联性需要进一步加大样本量来验证。本研究发现，每年 78 月的 BTV 和 AKAV 抗体阳性率显著高于 56 月，进一步验证了 BTV 和 AKAV感染高发于高热高湿、蚊虫库蠓繁殖活跃的夏秋季节。本研究结果表明：BTV 和 AKAV 在云南省边境地区已广泛存在，其感染有加重趋势；病原通过境外牛传入国内的风险不断增加，防控形势较为严峻。为保障国内畜牧业的健康发展，需要继续加强监测，落实各项防控措施，控制 BTV 和 AKAV 的流行，同时严厉打击边境走私行为，阻断境外病原传入国内；因地制宜，实施免疫措施，强化生物安全，做好蚊虫控制；继续加强对 BTV 和 AKAV 的调查与研究，全面掌握这 2 种病原的分布和流行特征，为预防与控制这 2 种疫病奠定基础。参考文献：1 王洪亮，王增辉.牛蓝舌病的诊断与防治 J.中国畜禽种业，2022，18（4）：138-139.2 寇美玲，谢佳芮，苗海生，等.云南省边境地区送检牛血清样品蓝舌病病毒抗体检测与血清型鉴定 J.中国动物检疫，2020，37（10）：16-20.3 谢佳芮，苗海生，寇美玲，等.20172018 年云南省边境地区阿卡斑病毒抗体检测 J.中国动物检疫，2019，36（3）：23-28.4 曾嘉庆.云南边境地区牛蓝舌病分子流行病学调查及库蠓病毒组学研究 D.北京：军事科学院，2022.5 苗海生，李乐，李华春，等.蓝舌病多克隆抗体 C-ELISA 检测方法的建立和比较研究 J.云南农业大学学报，2014，29（1）：58-62.6 苗海生，李乐，廖德芳，等.阿卡斑病毒竞争 ELISA抗体检测方法的建立和比较试验J.中国预防兽医学报，2019，41（4）：371-375.7 DARPEL K E，BATTEN C A，VERONESI E，et al.Clinical signs and pathology shown by British sheep and cattle infected with bluetongue virus serotype 8 derived from the 2006 outbreak in northern EuropenJ.Veterinary record，2007，161（8）：253-261.8 LPEZ A M，PINILLA E C，BARRIALES D，et al.Microspheres-prime/rMVA-boost vaccination enhances humoral and cellular immune response in IFNAR（-/-）mice conferring protection against serotypes 1 and 4 of bluetongue virusJ.Antiviral research，2017（142）：55-62.9 COETZEE P，VAN VUUREN M，STOKSTAD M，et al.Bluetongue virus genetic and phenotypic diversity：towards identifying the molecular determinants that influence virulence and transmission potentialJ.Veterinary microbiology，2012，161（1/2）：1-12.10 朱畅荣，罗莉，黄祟元.西双版纳州动物防疫工作的探索与思考 J.兽医导刊，2018（7）：34-35.11 李苏胜，王静林.中国动物虫媒病毒主要传播媒介库蠓种类及其分布 J.中国热带医学，2022，22（6）：505-511.12 寇美玲，杨佳萍，谢佳芮，等.2020 年云南省边境地区牛蓝舌病血清学调查 J.中国动物检疫，2022，39（1）：5-9.13 寇美玲，谢佳芮，李乐，等.云南省边境地区送检牛血清样品蓝舌病病毒抗体检测与血清型鉴定 J.中国动物检疫，2020，37（10）：16-20.（责任编辑：朱迪国）