异种移植中猪内源性逆转录病毒的传播.pdf

综述异种移植中猪内源性逆转录病毒的传播余一凡宋佳华宋相钦李涛江建白云昊王毅【摘要】器官移植是治疗各类终末期疾病最有效的手段，为了解决器官移植中供体短缺的问题，人们开始探究异种移植的可能。猪是异种器官移植常见的供体来源之一，猪器官作为连接两个物种间的桥梁，其携带的病毒有可能在物种间传播并存在引起人畜共患病的风险。猪内源性逆转录病毒（PERV）整合在基因组中，是一种跨物种传播的逆转录病毒。本文介绍了 PERV 传播特性的影响因素、PERV 及其重组病毒的传播风险以及异种移植试验中 PERV 的检测与传播风险评估，以期为缓解器官移植供体严重短缺的现状，推动异种移植技术的发展提供参考。【关键词】异种移植；猪内源性逆转录病毒；器官短缺；转基因；传播特性；人畜共患病；免疫缺陷；感染【中图分类号】R617,Q527+.5【文献标志码】A【文章编号】1674-7445（2023）05-0017-06Transmission of porcine endogenous retrovirus in xenotransplantation Yu Yifan*,Song Jiahua,Song Xiangqin,Li Tao,JiangJian,Bai Yunhao,Wang Yi.*Transplantation Institute,the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Hainan 570216,ChinaCorresponding author:Wang Yi,Email:【Abstract】Organtransplantationisthemosteffectivetreatmentforvarioustypesofend-stagediseases.Toresolvetheproblemofdonorshortageinorgantransplantation,thepossibilityofxenotransplantationhasbeengraduallyexploredbysurgeons.Pigisoneofthecommondonorsourcesforxenotransplantation.Asabridgebetweentwospecies,thevirusescarriedbypigorgansmaybetransmittedbetweenspeciesandcausetheriskofzoonosis.Porcineendogenousretrovirus(PERV)isintegratedintothegenome,whichisacategoryofretrovirusfeaturingcross-speciestransmission.Inthisarticle,theinfluencingfactorsoftransmissioncharacteristicsofPERV,thetransmissionriskofPERVanditsrecombinantvirus,andthedetectionandtransmissionriskassessmentofPERVinxenotransplantationtestwerereviewed,aimingtoprovidereferenceforalleviatingsevereshortageofdonororgansanddrivingtheadvancementofxenotransplantationtechnologies.【Key words】Xenotransplantation;Porcine endogenous retrovirus;Organ shortage;Transgene;Transmissioncharacteristics;Zoonosis;Immunodeficiency;Infection器官移植是目前治疗各类终末期疾病的有效手段，器官短缺阻碍了移植技术的发展。在世界范围内，许多国家陷入了供体短缺的状态，每年大约有200 万人需要器官移植，并且该数字还在随着人口老龄化的进程持续递增。据不完全统计，美国每日有22 人因为等不到移植器官而失去生命1。解决器官短缺问题最实用和最有效的方案是异种器官移植2-3。随着基因编辑技术的兴起与免疫抑制方案的不断完DOI:10.3969/j.issn.1674-7445.2023293基金项目：国家自然科学基金（82260154）；海南省卫生计生行业科研项目（20A200360）；海南省科技厅自然科学基金（820RC766）；海南医学院 2021 年度研究生创新科研课题（HYYS2021B0）作者单位：570216海口，海南医学院第二附属医院移植研究所（余一凡、宋相钦、李涛、江建、白云昊、王毅）；南华大学附属第二医院泌尿外科（宋佳华）作者简介：余一凡（ORCID：0009-0001-8954-5642），硕士，研究方向为外科学、异种移植，Email：通信作者：王毅（ORCID：0000-0001-7152-0757），医学博士、二级教授、一级主任医师、博士研究生导师，研究方向为外科学、异种移植，Email：第 14 卷第 5 期器官移植Vol.14No.52023 年 9 月Organ TransplantationSep.2023善，猪成为了异种器官移植最有前途的供体来源之一，在胰岛细胞、心脏、肺、肾和肝异种移植中取得了不错的结果。猪内源性逆转录病毒（porcineendogenousretrovirus，PERV）整合在基因组中，是一种跨物种传播的逆转录病毒。随着异种移植进入临床4，PERV 不可避免地成为了人们关注的热点。1PERV异种移植潜在的人畜共患病感染源出于对伦理、育种、器官大小、组织结构、免疫程度、生理相似性、病毒传播等方面的统筹考虑5-6，猪被选中为异种器官移植的目标供体。为了更好地利用猪进行异种移植研究，研究者们解决了一系列的困难，包括免疫障碍、器官生长控制、人畜共患病等。为了克服免疫问题，研究者开发了经过选择地敲除特定异种抗原的转基因猪5-6。但是，转基因猪仍然不能杜绝人畜共患病的发生在转基因工程猪中，仍然发现了 PERV 传播的可能性。甚至，在已感染的受体细胞中，PERV 传播能力存在进一步增强的可能7。一旦 PERV 在人群中广泛传播，PERV 或将与人内源性逆转录病毒（humanendogenousretrovirus，HERV）结合形成一种新的病毒8。近年来，异种移植从实验室走向临床，好消息不断：2021 年 9 月与 11 月，美国纽约大学研究团队成功将转基因猪的肾脏分别移植到 2 例脑死亡患者体内并存活长达 54h9。2022 年 1 月，美国马里兰大学医学中心实施了世界首例将猪的心脏移植到人体的手术，57 岁的心脏病患者接受了一颗基因编辑猪心脏以挽救生命，该心脏敲除了特异性排斥反应及生长因子基因10，这是继首例异种实验后的又一次大胆尝试。关于美国马里兰大学医学中心异种心脏移植，研究者们认为导致患者死亡的原因或许是猪巨细胞病毒或猪玫瑰病毒感染。这再次开启了关于异种移植是否会传播病毒并带来社会传播风险的讨论。目前，整合在供体猪基因组内的 PERV 被认为是众多引起人畜共患病的猪源性感染源中最重要的病原体之一。PERV 为 逆转录病毒，可在体外感染猪、犬、猫、蝙蝠及多种灵长类动物细胞和十余种人源细胞11。除了 PERV 外，还有许多其他猪病毒可能构成异种移植的风险，如猪巨细胞病毒、戊型肝炎病毒、猪淋巴疱疹病毒和猪环状病毒12，大多数猪细菌、真菌和病毒可以通过隔离传染源、使用抗病毒药物治疗、接种疫苗等手段来减少传播，但是 PERV 无法用上述常规手段消除。更重要的是，异种移植中免疫抑制药的使用进一步加剧了病毒传播的可能性13。2PERV 传播特性的影响因素异种移植亚临床研究，PERV 的传播速度受到PERV 负载量、PERV 亚型、器官分布、散播频率或免疫抑制药的影响。迄今为止，研究者们并没有直接在体内观察到 PERV 从各种猪源细胞传播到受体宿主细胞14，这也可能是因为以往亚临床研究条件有限。在特殊情况下，免疫缺陷动物如非肥胖糖尿病或严重联合免疫缺陷小鼠模型15，在猪胰岛细胞移植后检测到 PERV 感染和病毒基因表达16。研究发现不同种属的猪之间不仅其 PERV 负载量各不相同，而且其携带的 PERV 亚型也存在差异17。2.1 不同亚型的 PERV 传播特性不同PERV 全长 8.18.9kb，包括编码序列和非编码序列，分别是 5非编码区、核心蛋白基因 GAG、聚合酶基因 POL、囊膜基因 ENV 及 3非编码区18。GAG 基因编码结构蛋白，包括衣壳、核衣壳和基质；POL 基因编码反转录酶、核糖核酸酶、整合酶和蛋白酶；ENV 基因编码跨膜蛋白 TM 和表面膜蛋白 SU19。PERV 亚型受到膜蛋白表面的受体结合域决定，其中编码区由GAG、POL、ENV3个功能基因组成。GAG 基因与 POL 基因高度保守，具有高度相似性，ENV 基因则相对 GAG、POL 差异较大。人们根据其编码的囊膜糖蛋白结构不同，将 PERV 分为 PERV-A、PERV-B 和 PERV-C3 种亚型7。研究发现，PERV-A 和 PERV-B 为多噬性，具有感染多种人源细胞的能力，PERV-C 为亲噬性且较不稳定，仅能感染猪源细胞20。人们发现 PERV-A 与 PERV-C 可组成 PERV-A/C 重组体21，而该重组体在猪体细胞中具有更高的复制效率，产生足够高浓度的病毒颗粒，更易感染人源细胞。为了评估不同PERV 亚型的感染风险，研究者对 PERV 感染的人类细胞和猪细胞进行了 RNA 测序，并通过检测 PERV序列的 reads 数来预测 PERV 的传播风险22。2.2 不同组织中 PERV 传播特性不同通过 Northern 杂交技术、逆转录聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR）技术可检测 PERV 的传播情况23，并确定各不第 5 期余一凡等异种移植中猪内源性逆转录病毒的传播755 同种系猪病毒拷贝数与分型上的区别：PERV 在德国大白猪、我国荣昌猪和五指山小型猪 3 种猪中均有分布；小型猪 PERV 表达水平较高，德国大白猪则较低；PERV-A 亚型在德国大白猪心、肝、脾、肺、肾、扁桃体等 6 种组织中均存在，在扁桃体等免疫器官组织中表达水平最高24；进一步研究显示 PERV 在肾脏中高表达，其次是肝脏、肺和心脏，在胰腺中表达水平较低25。通过五指山小型猪不同器官基因组DNA（genomicDNA，gDNA）和互补 DNA（complementaryDNA，cDNA）的 RT-PCR 结论推测，PERV 在猪生长发育早期就已整合在宿主基因组中，并随宿主基因的复制而复制并表达26。PERV 不仅在不同品种中拷贝数不同，在不同器官中的拷贝数也有所不同，并且还受到年龄影响。3PERV 及其重组病毒的传播风险内源性逆转录病毒（endogenousretrovirus，ERV）广泛存在于人类基因组中，是一类古老的逆转录病毒，整合在宿主基因组并按孟德尔规律遗传27。ERV 可以隐藏在哺乳动物基因组中的未表征功能基因中28，即使失活的 ERV 在某些情况下仍能重新感染细胞并大量复制，并对邻近基因的表达产生调控作用。在生物进化过程中，ERV 跨物种传播引起的宿主转换现象时有发生29，人类基因组中充斥着的大量 HERV 是否会与 PERV 发生重组或者宿主转换呢？据研究报道，在高等脊椎动物基因组中最为普遍的 类和 类 ERV，其宿主转换现象偶有发生30-31。1997 年，Patience 等32将猪细胞和人细胞进行共培养发现 PERV 可以在体外感染人源细胞。此后，Bach 等33在美国哈佛医学院呼吁人们禁止异种器官移植试验，担心 PERV 在普通人群中扩散。1999 年，研究者们收集了 160 例接受过猪组织治疗患者的样品并对样本中 PERVDNA 等进行检测分析，试验并没有找到传染的决定性证据34，但发现了 23 例患者在长达 8.5 年中存在着微嵌合体，这增加了病毒传播的隐患35。2004 年，美国斯克里普斯研究所的科学家们发表文章研究了嵌合体，实验中并未观察到PERV 的传播，由此认为其感染的风险性并不高36。2000 年，Nature上发表的一篇文章报道了 PERV跨物种感染的证据：（1）猪胰岛检测到 PERV；（2）产生的 PERV 感染了人源细胞；（3）猪胰岛移植到免疫缺陷小鼠体内后能持续检测到 PERV 病毒20。移植受者通常会服用免疫抑制药，其机体的免疫功能将会受到抑制，亚临床试验受者长期直接接触异种器官，仍然受到人畜共患病的暴露风险。其次，转基因猪的相关改造也存在影响病毒传播的可能。因此，PERV 临床感染风险仍被世界卫生组织列为其关注的核心问题之一。4异种移植试验中 PERV 的检测与传播风险评估在异种移植亚临床研究不断推进的前提下，为了评估异种移植受者面临的潜在感染风险，寻求无症状感染者的检测方法37，研究者们应该统筹考虑猪品种以及移植器官之间不同的影响，选择一种稳定、高效、可控的 PERV 检测方法。4.1 PERV 的检测手段在异种移植实验中，检测方法、引物设计、聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）灵敏度等因素都会影响 PERV 拷贝数，开发更快捷准确的检测技术一直是人们讨论的热点之一。随着对 PERV 的研究不断深入，研究者们开始采用多种技术辅助研究，如通过 RT-PCR 技术来检测 PERV 的表达，通过 PERV 特异性引物 PCR 技术以及实时定量 PCR 技术来筛选 PERV 低表达动物23；通过 Southern 印迹杂交检测前病毒的整合情况；通过荧光原位杂交技术检测前病毒在染色体上的定位和病毒 RNA 的表达情况；通过 RT-PCR 技术检测释放病毒粒子的 RNA38，其他还包括基因测序技术等常规检测手段39。传统检测手段主要识别序列已知的 PERV 或仅仅识别 PERV 的保守序列，无法识别序列未知的PERV。通过微滴数字 PCR 技术，科学家们研究了德国地方猪和哥廷根迷你猪的感染风险，并在其中发现每个基因组的拷贝数约为 60copies，野猪的数量低于家猪40；通过液滴式数字 PCR 定量检测，Krger 等41观察了淋巴瘤发展阶段与 PERV 表达的关系，并通过蛋白质印迹法验证了 PERV 从淋巴瘤细胞中表达和释放的过程。在过去，PERV 传播检测模型主要依靠动物模型实验，但其与临床情况存在明显差异。与之相比，小规模的亚临床试验将能更方便地阐释疾病监测、免疫抑制方案对病毒传播的影响、PCR 灵敏度等问题，将有助于开发更快捷高效稳定可靠的检测方法，规划更合理直观的风险评估模型，推动异种移植756器官移植第 14 卷取得新的进展。4.2 评估传播风险的新方法目前，评估 PERV 从猪细胞、组织或器官传播风险的金标准是使用复合 HEK293 共孵育试验。Denner等42提出了费用更低且耗时更少的替代方案：一是采用分子生物学方法的替代检测方法替代 HEK293 细胞共孵育试验7。二是筛选 PERV-A/C信使核糖核酸（messengerRNA，mRNA），因为只有 PERV-A/C从丝裂原激活的外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）中释放。丝裂原激活的猪PBMC 被证明可以增加 PERV 的表达和释放。为了支持这一观点，研究者们使用特异性引物的 RT-PCR 检测，在产生病毒的 PK15 细胞和携带并释放的人HEK293 细胞中发现了含有 PERV-A/C 的剪接mRNA。一般来说，PERV 在 RNA 水平上的表达是通过 RT-PCR 来检测的，HEK293 细胞共培养感染试验至少需要 8 周，而 RT-PCR 需要 4h 不到，并且 PCR检测剪接 RNA 或 PERV-A/CmRNA 费用更低及更加规范。5小结在可以预见的将来，异种移植亚临床试验将在世界范围内进一步加速发展，异种移植学科的发展已经充分证明设计良好的器官移植临床试验是合理的43。当异种移植从实验走向临床，在免疫抑制不可避免、PERV 无法根除的情况下，必须对异种移植供受体执行更加严格的安全检测。更好地了解 PERV，更深入地探索 PERV 的各种特性、传播条件、转录规律、预防策略，将有助于规范异种移植医疗程序，化解人们对异种移植感染风险的担忧，规避大规模人畜共患病的威胁。探索 PERV 检测与传播风险评估的方法，开发快捷有效的检测手段与风险预测模型，探究PERV 预防策略，将有助于预防人畜共患病并推动异种移植技术的发展。在未来，基因改造供体猪的生产、PERV 对转基因猪器官功能的影响、受者对PERV 的适应与传播、PERV 与 HERV 结合形成的新病毒是否会在人群中传播、抗逆转录病毒药物可否有效抑制重组病毒等问题值得人们关注。参考文献：OPTN/SRTR2020annualdatareport:prefaceJ.AmJTransplant,2022,22(Suppl2):1-10.DOI:10.1111/ajt.16975.1WANGY,LEIT,WEIL,etal.XenotransplantationinChina:present statusJ.Xenotransplantation,2019,26(1):e12490.DOI:10.1111/xen.12490.2COZZI E,SCHNEEBERGER S,BELLINI MI,et al.Organtransplantsofthefuture:planningforinnovationsincluding xenotransplantationJ.Transpl Int,2021,34(11):2006-2018.DOI:10.1111/tri.14031.3FISCHER K,SCHNIEKE A.XenotransplantationbecomingrealityJ.TransgenicRes,2022,31(3):391-398.DOI:10.1007/s11248-022-00306-w.4NIU D,MA X,YUAN T,et al.Porcine genomeengineeringforxenotransplantationJ.AdvDrugDelivRev,2021,168:229-245.DOI:10.1016/j.addr.2020.04.001.5张玄,王琳,张洪涛,等.多基因编辑猪-猴心脏、肝脏、肾脏移植临床前研究初步报道J.器官移植,2021,12(1):51-56.DOI:10.3969/j.issn.1674-7445.2021.01.008.ZHANGX,WANGL,ZHANGHT,etal.Preliminaryreport of a preclinical study of multigene-edited pig-monkey heart,liver,and kidney transplantation 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