基于RPA-LFD法的多黏菌素耐药基因mcr-1可视化快速检测方法建立与应用.pdf

焦雪，董羽织，王靖雯，等.基于 RPA-LFD 法的多黏菌素耐药基因 mcr-1 可视化快速检测方法建立与应用 J.食品工业科技，2023，44（18）：209216.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120034JIAO Xue,DONG Yuzhi,WANG Jingwen,et al.Establishment and Application of Rapid Detection Method for Polymyxin ResistanceGene mcr-1 Based on RPA-LFD MethodJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):209216.(in Chinese withEnglish abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120034 生物工程 基基于于 RPA-LFD 法的多黏菌素耐药基因法的多黏菌素耐药基因mcr-1 可视化快速检测方法建立与应用可视化快速检测方法建立与应用焦雪，董羽织，王靖雯，吕晨泽，方结红，蒋晗*（中国计量大学生命科学学院浙江省特色农产品品质及危害物控制技术重点实验室，浙江杭州 310018）摘要：目的：建立一种快速、高效、可视化的细菌多黏菌素耐药基因 mcr-1 检测方法，为其基层检测的展开提供依据和便利。方法：利用重组酶聚合酶扩增结合胶体金侧向流试纸条技术（Recombinase polymerase amplificationcombined with a lateral flow dipstick，RPA-LFD），辅以手持式胶体金读数仪；根据 mcr-1 基因保守序列设计合成一对特异性 RPA 引物，通过对反应条件和体系的优化，以及特异性试验、灵敏度试验、模拟食样试验和实际样品试验，成功建立了可视化定量检测细菌多黏菌素耐药基因 mcr-1 的 RPA-LFD 方法。结果：在引物浓度 400 nmol/L，引物比例 1:1 时，该方法最佳反应条件为 Mg2+浓度 14.0 mmol/L，反应温度 37，反应时间 20 min；灵敏度好，标准曲线方程为 y=0.117x+0.051，定量限为 101108 copies/L，检出限为 101 copies/L，比 PCR 法低一个数量级且模拟样品检出结果与 PCR 法一致。利用建立的 RPA-LFD 法对猪肉样品、鸡肉样品、生猪养殖场环境样品、肉鸡养殖场环境样品、大肠杆菌分离株和弯曲肠杆菌分离株各 15 份中多黏菌素耐药基因 mcr-1 携带情况进行分析；RPA-LFD 法与常规 PCR 法阳性样本检出率一致，共检出 9 份 mcr-1 基因阳性样品。RPA-LFD 定量分析显示，阳性样品中 mcr-1 基因浓度在 4.51028.6104 copies/L 之间。结论：本研究建立的细菌多黏菌素耐药基因 mcr-1 的RPA-LFD 检测法特异性强、灵敏性高、操作简单，可广泛应用于基层检验。关键词：多黏菌素耐药基因 mcr-1，重组酶聚合酶扩增技术，胶体金侧向流试纸条，快速检测，可视化，定量本文网刊:中图分类号：TS207.4 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）18020908DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120034EstablishmentandApplicationofRapidDetectionMethodforPolymyxinResistanceGenemcr-1BasedonRPA-LFDMethodJIAOXue，DONGYuzhi，WANGJingwen，LChenze，FANGJiehong，JIANGHan*（Key Laboratory of Specialty Agri-products Quality and Hazard Controlling Technology of Zhejiang Province,College ofLife Sciences,China Jiliang University,Hangzhou 310018,China）Abstract：Objective:To develop a rapid,efficient and visual method for the detection of bacterial colistin resistance genemcr-1,so as to provide the basis and convenience for the development of its detection at the grassroots level.Methods:Using recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick(RPA-LFD)assay,supplemented by ahand-held colloidal gold reader.According to the conserved sequence of the mcr-1 gene,a pair of specific RPA primerswere designed and synthesized.Through the optimization of the reaction conditions and system,as well as the specificitytest,sensitivity test,simulated food sample test and actual sample test,the RPA-LFD assay for visual and quantitative 收稿日期：20221215 基金项目：国家自然科学基金（31901792，31801655）；浙江省基础公益研究计划项目（LGN22C200013）；宁波市公益类科技计划项目（2022S014）；萧山区重大科技计划项目（2021226）；浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划（2022R409A050，2022R409A057）。作者简介：焦雪（1996），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail：。*通信作者：蒋晗（1987），女，博士，高级实验师，研究方向：食品生物技术，E-mail：。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 detection of bacterial colistin resistance gene mcr-1 was successfully established.Results:When the primer concentrationwas 400 nmol/L and the primer ratio was 1:1,the optimal reaction conditions of this method are Mg2+concentration14.0 mmol/L,reaction temperature 37 and reaction time 20 min.The sensitivity was good,the standard curve equationwas y=0.117x+0.051,the quantification limit was 101108 copies/L,and the detection limit was 101 copies/L,which wasan order of magnitude lower than the PCR method and the detection result of the simulated sample was consistent with thePCR method.Carrying status of colistin resistance gene mcr-1 in each 15 pork samples,chicken samples,pig farmenvironmental samples,broiler farm environmental samples,Escherichia coli isolates and Enterobacter campylobacterisolates were analyzed by the established RPA-LFD assay.The detection rate of positive samples by RPA-LFD assay wasconsistent with that of conventional PCR method,and a total of 9 mcr-1 gene positive samples were detected.RPA-LFDquantitative analysis showed that the concentration of mcr-1 gene in positive samples was between 4.51028.6104 copies/L.Conclition:The RPA-LFD detection method of the bacterial colistin resistance gene mcr-1 establishedin this study had strong specificity,high sensitivity,and simple operation,and could be widely used in grassrootsinspections.Keywords：bacterial colistin resistance gene mcr-1；recombinase polymerase amplification；lateral flow dipstick；rapiddetection；visualization；quantification 多黏菌素是一种提取于多粘芽孢杆菌变种的多肽类抗生素，临床上用于治疗多重耐药革兰氏阴性菌引起的感染，被称为抵抗多重耐药细菌感染的“最后一道防线”12。此外，硫酸粘菌素也在全球养殖业中作为细菌性疾病治疗用药而广泛应用3。然而，自2015 年质粒介导的多黏菌素耐药基因 mcr-1 首次被报道后4，其在临床、食品、畜牧养殖、水产及相关环境中屡屡检出56。Borowiak 等7分析了德国联邦风险评估研究所从动物、食物、饲料和环境中收集的耐药沙门氏菌，发现 mcr-1 基因在德国家畜和食品来源的沙门氏菌中广泛流行。此外，mcr-1 基因也普遍存在于大肠埃希菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌中811。有报道显示，动物源、动物性食品源和人源肠杆菌科细菌中，mcr-1 基因检出率在5%30%1213。与其他国家相比，我国的 mcr-1 基因检出率较高，在 5%80%之间1416。mcr-1 基因的流行率高且传播速度快，严重威胁了公众安全和人类健康，因此亟需建立一种适用于基层的的检测方法对该耐药基因进行快速诊断和及时监测。目前，对 mcr-1 基因的检测，主要是基于传统PCR、荧光定量 PCR 以及数字 PCR 等技术的分子检测方法1720。这些检测方法重复性、特异性均较好，但大多数仍存在反应时间长、操作较为繁琐等弊端，且相关实验设备昂贵，对技术人员的熟练度要求高，不适用于基层对目的样品的快速检测。重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplifica-tion，RPA）被称为是可以替代 PCR 的核酸检测技术，其特点是能够在常温条件下实现核酸扩增21。RPA 技术使用重组酶促进寡核苷酸引物与其双链DNA 分子互补序列结合，该过程由单链 DNA 结合蛋白辅助，可防止引物解离，之后由 DNA 聚合酶进行复制22。RPA 技术具有反应时间快速、操作简便、灵敏度高等优点，一般在 2030 min 即可获得检出范围内的扩增产物，非常适用于基层检测2326。通过与荧光基团标记后，获得的扩增产物可与侧流层析试纸条（lateral flow dipstick，LFD）相结合，能够实现可视化检测。RPA 技术在临床检验、动物疫病诊断、畜牧养殖产业、微生物及其耐药性检测等领域均有涉及，已成功应用到日本血吸虫、非洲猪瘟病毒、猪嵴病毒、布鲁氏菌病等的检测中，结合 LFD 后，其定性检测结果可在 25 min 内直接进行判定2730。此外，LFD 检测结果可通过手持式胶体金读数仪扫描，读取 T/C 值，进一步实现目的基因的定量检测。本研究利用 RPA-LFD 技术辅以手持式胶体金读数仪，建立了一种快速、高效、可应用于基层的细菌多黏菌素耐药基因 mcr-1 的检测方法，这对多黏菌素耐药基因 mcr-1 的快速检测、切断传播途径、保障人们身体健康具有十分重要的意义3133。1材料与方法 1.1材料与仪器携带 mcr-1 基因的重组质粒 pGM-T-mcr-1、携带质粒 pGM-T-mcr-1 的重组大肠杆菌 Escherichiacoli Top10-pGM-T-mcr-1本实验室前期构建；质粒 pGM-T、大肠杆菌 E.coli Top10杭州纽贝生物科技有限公司；质控菌株大肠杆菌 E.coli ATCC25922（不含耐药基因）美国典型培养物保藏中心；不携带 mcr-1 基因的大肠杆菌 E.coli、弯曲肠杆菌Enterobacter campylobacter、霍氏肠杆菌 E.hormae-chei、干酪乳杆菌 Lactobacillus casei实验室前期分离鉴定；15 株大肠杆菌分离株 E.coli（菌株编号E1E15）、15 株弯曲肠杆菌分离株 E.campylobacter（菌株编号 EC1EC15）来源于浙江省某养殖场的猪粪样品，为实验室前期分离保存；15 份生猪养殖场环境样品（样品编号 SZ1SZ15）来源于浙江省某养殖场猪粪（取生猪新鲜粪便分别密封于无菌均质袋中，置于装有冰袋的泡沫箱中，密封后在 2 h 内运送回实验室处理）；15 份肉鸡养殖场环境样品（样品编号 RJ1RJ15）来源于浙江省某养殖场鸡粪（处理 210 食品工业科技2023 年 9 月方法同上）；15 份猪肉样品（样品编号 ZR1ZR15）和 15 份鸡肉样品（样品编号 JR1JR15）浙江省某农贸市场（处理方法同上）；营养琼脂培养基、LB 液体培养基和甘油等生化试剂青岛海博生物技术有限公司；RPA 核酸扩增试剂盒（基础型）英国TwistDX 公司；其它常规生化试剂美国 Sigma 公司；PCR 试剂、细菌质粒提取试剂盒、细菌基因组DNA 提取试剂盒等分子生物学试验用试剂宝生物工程（大连）有限公司。SW-CJ-2FD/2F 超净工作台上海 BOXUN 公司；GT14DP 高压蒸汽灭菌锅美国 ZEALWAYF公司；NanoDrop 2000c 超微量紫外分光光度计美国 Thermo Scientific 公司；EPS-600 电泳装置上海 Tanon 公司；Arktik PCR 仪美国 Thermo Scien-tific 公司；Gel Doc EZ 凝胶成像分析系统美国Bio-Rad 公司；TSR-200 手持式胶体金读数仪杭州奥盛仪器有限公司。1.2实验方法 1.2.1 携带 mcr-1 基因的标准质粒 pGM-T-mcr-1 制备在80 冰箱中取出实验室冻存的携带 mcr-1 基因的重组大肠杆菌 E.coli Top10-pGM-T-mcr-1 划线于 LB 琼脂培养基，于 37 过夜培养，挑取单菌落于 LB 液体培养基中，摇床中 37，200 r/min培养至菌液 OD600为 1.0，参照细菌质粒提取试剂盒操作说明书方法提取携带 mcr-1 基因标准质粒pGM-T-mcr-1。利用 Nanodrop 2000c 紫外分光光度计测定标准质粒浓度。采用煮沸法制备待测大肠杆菌 E.coli、弯曲肠杆菌 E.campylobacter、霍氏肠杆菌 E.hormaechei、干酪乳杆菌 L.casei 等菌液模板DNA：取 1 L 待测菌液加入 30 L Tris 缓冲液，煮沸 5 min，冰上冷却 2 min，离心 12000 r/min，2 min，取上清液用作 DNA 模板34。1.2.2 PCR 和 RPA 引物设计登录 NCBI（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载 mcr-1 基因序列，分析目标基因 mcr-1 序列的多态性并确定其保守区域。针对保守区域序列，利用 Primer Premier 5.0 软件设计 PCR 与 RPA 引物。PCR 与 RPA 引物序列见表 1，由上海生工生物工程有限公司合成。表 1 RPA 扩增和 PCR 扩增引物序列Table 1 Sequence of RPA amplification and PCR amplificationprimers引物名称引物序列（5-3）引物序列大小（bp）mcr-1-F15-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-3309mcr-1-R15-CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3mcr-1-rpa-F25-GTCCGTTTGTTCTTGTGGCGAGTGTTGCCGTT-3298mcr-1-rpa-R25-TCGGTCTGTAGGGCATTTTGGAGCATGGTCGT-3 1.2.3 PCR 与 RPA 反应体系与反应程序PCR 反应体系：总体系 25.0 L，Premix TaqTM 12.5 L，上下游引物（10 mol/L）各 1 L，DNA 样本 2 L，灭菌去离子水 8.5 L。PCR 反应程序：94 预变性 1 min；98 变性 30 s，55 退火 30 s，72 延伸 20 s，30次循环；72 延伸 20 s，72 再延伸 10 min，4 保存。取 6 L 扩增产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳后，分析凝胶成像结果。RPA 反应体系（50.0 L）：反应干粉 1 管，Rehydration Buffer 29.5 L，上下游引物（10 mol/L）各 2 L，Mg2+2.5 L，DNA 样本 5.0 L，灭菌去离子水 11.0 L。37 孵育 30 min。RPA 扩增产物纯化后进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳，分析凝胶成像结果。1.2.4 RPA-LFD 可视化检测策略RPA-LFD 可视化检测策略如图 1 所示。RPA 引物荧光集团标记：mcr-1-rpa-F2 引物 5端标记 Biotin，mcr-1-rpa-R2 引物 5端标记 Digoxin；LFD 试纸条制备：利用金标点 Digoxinmcr-1mcr-1Biotin抗Biotin抗体抗Digaoxin金标抗体二抗1.211.020.830.640.450.260.078Test line intensity(T valur/C value)Log Concentration(copies/L)y=0.117x+0.051R2=0.9920C线T线图 1 RPA-LFD 可视化检测原理图Fig.1 Schematic diagram of RPA-LFD visual inspection 第 44 卷 第 18 期焦雪，等：基于 RPA-LFD 法的多黏菌素耐药基因 mcr-1 可视化快速检测方法建立与应用 211 膜仪将 0.65 mg/mL 抗 Biotin 单克隆抗体、1 mg/mL羊抗鼠多克隆二抗和 10 g/mL 的胶体金标记 Digoxin单抗溶液分布均匀标记在 LFD 试纸条 NC 膜的检测线T 线、质控线C 线和结合垫上。将标记好的NC 膜和结合垫置于烘箱 37 干燥 12 h。将干燥好的 NC 膜、结合垫与样品垫、吸收垫和底板组合组装成 LFD 试纸条；RPA-LFD 可视化：将稀释后的 RPA 扩增产物滴加到 LFD 试纸条样品垫，标记有 Biotin 和 Digoxin的扩增产物侧向层析后被包被在检测线 T 的抗Biotin 单克隆抗体捕获，被捕获的扩增产物因标记有 Digoxin，将胶体金标记 Digoxin 单抗捕获在 T 线，多余的胶体金标记 Digoxin单抗在控制线 C 线被包被的多克隆二抗捕获，最终实现 T 线、C 线显色；当扩增产物无目标产物时，则只有 C 线显色；可用TSR-200 手持式胶体金读数仪读取试纸条 T/C 值，记录数据，分析检测定量结果。1.2.5 RPA-LFD 方法的优化RPA 反应体系见1.2.3。用 LFD 试纸条缓冲液将 RPA 扩增产物稀释50 倍进行 LFD 侧流层析。510 min 内读取结果。为提高目标基因的扩增效率，获得最优的反应条件，对 RPA-LFD 可视化体系的反应温度、反应时间以及 Mg2+反应浓度进行了优化。设置反应温度梯度为：30、35、37、39、45 和 50；固定反应温度以及Mg2+反应浓度，设置反应时间梯度为：2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5 和 30 min；设置 Mg2+反应浓度梯度为：2.8、5.6、8.4、11.2、14 和 16.8 mmol/L。在研究一个变量时，RPA 反应的其它条件按照1.2.3 里的条件固定。1.2.6 RPA-LFD 方法特异性分析采用优化后的RPA-LFD 体系，以重组质粒 pGM-T-mcr-1 和重组大肠杆菌 E.coli Top10-pGM-T-mcr-1 为阳性对照，以质粒 pGM-T、大肠杆菌 E.coli Top10、耐药敏感菌株大肠杆菌 E.coli ATCC25922、以经鉴定不携带 mcr-1 基因的大肠杆菌 E.coli、弯曲肠杆菌 E.campylobacter、霍氏肠杆菌 E.hormaechei、干酪乳杆菌 L.casei 分离株为阴性对照，以灭菌去离子水为空白对照，分析 RPA-LFD 方法特异性。1.2.7 RPA-LFD 方法灵敏度分析利用 Nanodrop2000c 紫外分光光度计测定提取的 pGM-T-mcr-1 标准质粒浓度，并计算标准质粒拷贝数。拷贝数计算公式为：拷贝数/L=质粒浓度（ng/L）6.021023/（660质粒长度），其中 6.021023为 1 摩尔中含有的摩尔分子（拷贝数）；660 为计算 dsDNA 平均分子量的常数。用 Tris-HCl 缓冲液以 10 为倍数梯度稀释标准质粒，制备 108、107、106、105、104、103、102、101、100和 101 copies/L 浓度梯度的标准质粒溶液。以10 倍浓度梯度稀释的标准质粒溶液为模板，采用优化的最优 RPA-LFD 反应，分析 RPA-LFD 方法灵敏度。同时，利用读数仪读取 LFD 试纸条 T/C 值，以T/C 值为纵坐标轴，以标准质粒拷贝数浓度的 lg10对数为横坐标轴，建立 mcr-1 基因定量标准曲线。1.2.8 RPA-LFD 方法用于模拟食样检测从当地农贸市场购买猪肉和鸡肉等样品，参考 GB 4789.1 进行样品前处理，制成样品液。用细菌基因组 DNA 提取试剂盒法提取样品 DNA，采用常规 PCR 方法确证所有样品中不含 mcr-1 耐药基因。将标准质粒添加到猪肉和鸡肉样品，使得样品中标准质粒菌株的终浓度为 104100 copies/L，制备样品液并提取样品DNA，用建立的 RPA-LFD 方法分析模拟食样中携带 mcr-1 基因情况。1.2.9 RPA-LFD 方法用于实际样品检测利用RPA-LFD 方法和常规 PCR 方法，分析 15 份猪肉样品（样品编号 ZR1ZR15）、15 份鸡肉样品（样品编号 JR1JR15）、15 份生猪养殖场环境样品（样品编号 SZ1SZ15）、15 份肉鸡养殖场环境样品（样品编号 RJ1RJ15）、15 株大肠杆菌分离株 E.coli（菌株编号 E1E15）和 15 株弯曲肠杆菌分离株样品 E.campy-lobacter（菌株编号 EC1EC15）中携带 mcr-1 基因情况，分析 RPA-LFD 方法与常规 PCR 方法检测结果一致性。1.3数据处理利用 Adobe Photoshop CC 2019将所得电泳、试纸条图片进行标注；利用 OriginLab Origin 2021 对数据进行处理并制作柱状图。2结果与分析 2.1RPA-LFD 检测方法反应条件优化以 mcr-1 基因标准质粒 pGM-T-mcr-1 为模板，对 RPA-LFD 方法的反应温度、反应时间以及 Mg2+浓度进行优化。设置 3050 温度梯度，对反应温度进行优化，结果显示，在 35、37 和 39 的反应温度下，mcr-1 基因检出效果均较好，电泳条带明亮且试纸条的目标检测线较为清晰（图 2a1图 2a3）。设置 2.530 min 反应时间梯度，对反应时间进行优化，结果显示，在电泳条带和试纸条颜色在反应 20、22.5 和 30 min 处清晰明亮，mcr-1 基因检出效果均较好（图 2b1图 2b3）。设置 2.816.8 mmol/L 的Mg2+反应浓度梯度，优化 Mg2+浓度，结果显示，Mg2+浓度达到 14.0 和 16.8 mmol/L 时 mcr-1 耐药基因检出效果均较好（图 2c1图 2c3）。综上所述，结合高效与节约角度，37 为最优反应温度，14 mmol/L 为最优 Mg2+浓度，22.5 min 为最佳反应时间。2.2特异性试验特异性试验按照 1.2.6 进行，检测结果如图 3 所示。经 RPA-LFD 检测，仅重组质粒 pGM-T-mcr-1和重组大肠杆菌 E.coli Top10-pGM-T-mcr-1 为的检测结果显示为阳性。质粒 pGM-T、大肠杆菌 E.coliTop10、耐药敏感菌株大肠杆菌 E.coli ATCC25 922、不携带 mcr-1 基因的大肠杆菌 E.coli、弯曲肠杆菌 212 食品工业科技2023 年 9 月E.campylobacter、霍氏肠杆菌 E.hormaechei、干酪乳杆菌 L.casei 分离株等不含 mcr-1 耐药基因样品检测结果均显示为阴性。试验结果表明，本研究建立的 RPA-LFD 检测 mcr-1 耐药基因的方法特异性好，与其他不携带 mcr-1 基因的质粒和分离株无交叉反应。2.3灵敏度试验灵敏度试验按照 1.2.7 进行，检测结果如图 4 所示。以 108101 copies/L 浓度梯度的 mcr-1 基因标准质粒为 RPA 扩增模板，进行 RPA-LFD 灵敏度试验。结果表明 RPA-LFD 方法检测 mcr-1 耐药基因 2000 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM1234561 2 3 4 5 6控制线mcr-1检出线2000 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM 1 2 3 4 51098761 2 3 4 5109876控制线mcr-1检出线2000 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM1234561 2 3 4 5 6控制线mcr-1检出线1.00.80.60.40.20.0测试线强度(T valur/C value)30 35 37 39 45 50 1.00.80.60.40.20.0测试线强度(T valur/C value)2.5 min5.0 min7.5 min10.0 min12.5 min15.0 min17.5 min20.0 min22.5 min30.0 min1.00.80.60.40.20.0测试线强度(T valur/C value)2.8 mmol/L5.6 mmol/L8.4 mmol/L11.2 mmol/L14.0 mmol/L16.8 mmol/La1a2a3b1b2b3c1c2c3图 2 RPA-LFD 反应条件优化Fig.2 Optimization of RPA-LFD reaction conditions注：a1 为反应温度优化电泳结果；a2 为反应温度优化 LFD 试纸条检测结果；a3 为反应温度优化手持式设备检测结果；b1 为反应时间优化电泳结果；b2 为反应时间优化 LFD 试纸条检测结果；b3 为反应时间优化手持式设备检测结果；c1 为 Mg2+浓度优化电泳结果；c2 为 Mg2+浓度优化 LFD 试纸条检测结果；c3 为 Mg2+浓度优化手持式设备检测结果；M 表示 DNA Marker（DL2000）；a 系列图中，16 分别表示 30、35、37、39、45、50；b 系列图中，110 分别表示 2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、30 min；c 系列图中，16 分别表示 2.8、5.6、8.4、11.2、14.0、16.8 mmol/L。aM 123456789 10 11 12 13 14 15 16控制线mcr-1检出线b1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415162000 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp图 3 RPA-LFD 特异性检测Fig.3 RPA-LFD specificity test注：a 为 RPA-LFD 特异性电泳结果；b 为 RPA-LFD 特异性LFD 试纸条检测结果；M：DNA Marker（DL2000）；1：质粒pGM-T-mcr-1；2：E.coli Top10-pGM-T-mcr-1；3：质粒 pGM-TT；4：E.coli Top10；5：耐药敏感菌株 E.coli ATCC25922；68：不携带 mcr-1 基因的大肠杆菌分离株 E.coli；910：不携带 mcr-1 基因的弯曲肠杆菌分离株 E.campylobacter；1112：不携带 mcr-1 基因的霍氏肠杆菌分离株 E.hormaechei；1314：不携带 mcr-1 基因的干酪乳杆菌分离株 L.casei；15：灭菌去离子水；16：空白对照。2000 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM12345678910 11 12a 第 44 卷 第 18 期焦雪，等：基于 RPA-LFD 法的多黏菌素耐药基因 mcr-1 可视化快速检测方法建立与应用 213 的检测灵敏度为 101 copies/L，具有较好的检测灵敏度。根据 LFD 试纸条 T/C 值和对应 mcr-1 基因标准质粒拷贝数浓度的对数，建立 mcr-1 基因 RPA-LFD 定量标准曲线，结果显示，T/C 值和对应 mcr-1 基因标准质粒拷贝数浓度的对数存在显著的正相关性，标准曲线方程为 y=0.117x+0.051，R2=0.9920。2.4模拟食样检测模拟食样检测按照 1.2.8 进行，检测结果如表 2所示。RPA-LFD 方法对添加 mcr-1 基因标准质粒的模拟食样的检出结果传统 PCR 方法检测结果一致，且 RPA-LFD 方法检测模拟样品中的携带 mcr-1耐药基因的菌液的检出限可达 101 copies/L，比PCR 方法的检出限 102 copies/L 低 1 个数量级。表 2 模拟食样检测结果Table 2 Test results of simulated food samples样品添加浓度（copies/L）RPA-LFD检测PCR检测猪肉11049.45103是11031.10103是11028.70101是11011.16101否1100否否鸡肉11048.78103是11039.30102是11021.36102是11011.07101否1100否否 2.5实际样品检测实际样品检测按照 1.2.9 进行，检测结果如表 3所示。在实际样品的检测试验中，RPA-LFD 方法与常规 PCR 方法对 15 份猪肉样品（样品编号 ZR1ZR15）、15 份鸡肉样品（样品编号 JR1JR15）、15 份生猪养殖场环境样品（样品编号 SZ1SZ15）、15 份肉鸡养殖场环境样品（样品编号 RJ1RJ15）、15 株大肠杆菌分离株 E.coli（菌株编号 E1E15）和 15 株弯曲肠杆菌分离株样品 E.campylobacter（菌株编号EC1EC15）中 mcr-1 基因携带情况进行分析，结果显示，RPA-LFD 方法与常规 PCR 方法阳性样本检出率一致，共检出 9 份 mcr-1 基因阳性样品。RPA-LFD 定量分析显示，阳性样品中 mcr-1 基因浓度在4.51028.6104 copies/L 之间。表 3 实际样品检测结果Table 3 Test results of actual samples样品数量（份或株）RPA-LFD检测结果常规PCR检测结果阳性数 定量（copies/L）阳性数定量猪肉样品1524.51023.51032鸡肉样品1500生猪养殖场环境样品1532.11048.61043肉鸡养殖场环境样品1500猪肉源大肠杆菌1517.51021肉鸡养殖场环境来源弯曲肠杆菌1536.51027.61033 3讨论与结论自细菌多黏菌素耐药基因 mcr-1 被报道以来，基于 PCR 方法1720和重组酶介导扩增方法35等检测方法相继出现。如屈素洁等17建立了 blaNDM-1和 mcr-1 基因双重 TaqMan 荧光定量 PCR 检测方法，该法对 mcr-1 基因检出下限为 1.63101 copies/L，并且能够特异性的检出 blaNDM-1 和 mcr-1 基因质粒标准品，重复性好。沈伟伟等18建立了双重荧光定量 PCR 检测携带 mcr-1 基因的鼠伤寒沙门菌的检测方法，该法对 mcr-1 基因检测的线性范围为 1.401011.40108 copies/L，能够实现对携带 mcr-1 基因的鼠伤寒沙门菌的筛查与耐药性持续监测。车勇良等35建立了多黏菌素耐药基因 mcr-1 重组酶介导扩增结合荧光定量 PCR 的方法，可在 21 min 后出结果，能特异性地检测多黏菌素耐药基因 mcr-1，最低检出限为 102 copies/L 的 mcr-1 阳性质粒拷贝数。这些检测方法重复性、特异性均好，但大多数仍存在依赖大型仪器等不足，目前仍未见适用于基层进行耐药筛查和监测的 mcr-1 耐药基因快速检测方法。本研究利用 RPA-LFD 技术，是一项将重组酶聚合酶扩增、胶体金标记（三明治夹心法）、分子杂交和侧向流层析等方法相结合，且结果可视化的核酸检测技术36，与 PCR 方法相比，不需要复杂的热循环和 123456789 10 11 12控制线mcr-1检出线bcmcr-11.211.020.830.640.450.260.078测试线强度(T valur/C value)Log Concentration(copies/L)y=0.117x+0.051R2=0.992图 4 RPA-LFD 检测灵敏度Fig.4 RPA-LFD detection sensitivity注：a 为 RPA-LFD 灵敏度电泳结果；b 为 RPA-LFD 灵敏度LFD 试纸条检测结果；c 为 mcr-1 基因标准方程；M：DNAMarker（DL2000）；1：mcr-1 阳性质粒；211 分别代表 108、107、106、105、104、103、102、101、100、101 copies/L；12 代表灭菌去离子水。214 食品工业科技2023 年 9 月PCR 反应仪器，用时短，在此次细菌多黏菌素耐药基因 mcr-1 的检测中，