咖啡酸苯乙酯对HepG2细胞氧化应激和脂质代谢的调节作用.pdf

86 2023,Vol.44,No.17 食品科学 营养卫生咖啡酸苯乙酯对HepG2细胞氧化应激 和脂质代谢的调节作用刘 畅1，常 超1，陈瑞达1，林萌慧1，孙 蓉1，蔡成岗1，赵敏洁2，蔡海莺1,2,3,*（1.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江 杭州 310023；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058；3.美欣达集团有限公司，浙江 湖州 313002）摘 要：咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）是来源于蜂胶中的一种天然多酚物质，具有良好的调节脂代谢生物活性，但其调节脂代谢的分子机制尚不明确，本研究利用CAPE处理油酸诱导的人肝脏肿瘤细胞HepG2，通过转录组学探讨其在细胞水平上改善脂代谢的作用与机制。结果表明，与高脂肪组相比，经过CAPE干预后的细胞脂质积累情况得到明显的改善，转录组水平上共筛选出3 270 个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），其中表达上调的DEGs有1 351 个，表达下调的DEGs有1 919 个。经京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能注释分析发现，CAPE处理后的DEGs显著注释到脂质代谢相关通路上。由KEGG信号通路富集分析显示，富集较显著的信号通路为HIF-1通路和脂肪酸分解代谢通路，其中CAPE组HIF-1、PPAR、CPT1A、FABP5等基因表达水平比高脂肪组分别提高了0.326、0.661、1.039、1.598 倍。综上，CAPE可能通过HIF-1通路改善高脂细胞氧化应激，并通过PPAR和脂肪酸氧化分解途径改善高脂诱导细胞的脂代谢紊乱。本实验可为CAPE调节脂代谢的分子机制及调节高脂膳食脂代谢紊乱的深入研究提供一定的理论参考。关键词：咖啡酸苯乙酯；HepG2细胞；脂代谢；转录组；信号通路Regulatory Effect of Caffeic Acid Phenethyl Ester on Oxidative Stress and Lipid Metabolism in HepG2 CellsLIU Chang1,CHANG Chao1,CHEN Ruida1,LIN Menghui1,SUN Rong1,CAI Chenggang1,ZHAO Minjie2,CAI Haiying1,2,3,*(1.Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources Biochemical Manufacturing,Zhejiang Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Product,School of Biological and Chemical Engineering,Zhejiang University of Science and Technology,Hangzhou 310023,China;2.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;3.Mizuda Group Co.,Ltd.,Huzhou 313002,China)Abstract:Caffeic acid phenethyl ester(CAPE),a natural polyphenol derived from propolis,has a good regulatory effect on lipid metabolism,but its molecular mechanism is not clear.In the present study,the ameliorative effect of CAPE on lipid metabolism in oleic acid-induced HepG2 human liver cancer cells and its mechanism at the cellular level were investigated.The results showed that compared with the high fat group,lipid accumulation in the cells was significantly improved after CAPE intervention,and a total of 3 270 differentially expressed genes(DEGs)were selected at the transcriptomic level;1 351 of them were up-regulated and the rest were down-regulated.The functional annotation analysis using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)database showed that the DEGs caused by CAPE intervention were significantly annotated to lipid metabolism-related pathways.The KEGG signaling pathway enrichment analysis showed that the HIF-1 pathway and the fatty acid catabolism pathway were significantly enriched.The expression levels of gene HIF-1,PPAR,CPT1A and FABP5 were 1.326,1.661,2.039 and 2.598 times higher in the CAPE group than the high fat group.It is suggested that CAPE can improve lipid metabolism disorder in oleic acid-induced cells possibly by reducing 收稿日期：2022-09-09基金项目：国家自然科学基金面上项目（31972079；32172214）；浙江省自然科学基金一般项目（LQ19E030001；LY18C200006）第一作者简介：刘畅（1996）（ORCID:0000-0003-4225-6955），男，硕士研究生，研究方向为功能性油脂。E-mail:*通信作者简介：蔡海莺（1982）（ORCID:0000-0002-8902-9269），男，副教授，博士，研究方向为功能性油脂的开发 和评价以及对食品功能因子基于肠道菌群和胆汁酸的脂质代谢调节。E-mail:营养卫生 食品科学 2023,Vol.44,No.17 87oxidative stress and regulating the PPAR and fatty acid oxidative catabolic pathways.This study provides a theoretical reference for future research on the molecular mechanism of lipid metabolism regulation by CAPE and the regulation of lipid metabolism disorder induced by a high-fat diet.Keywords:caffeic acid phenethyl ester;HepG2 cells;lipid metabolism;transcriptome;signaling pathwayDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220909-085中图分类号：Q591.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）17-0086-08引文格式：刘畅,常超,陈瑞达,等.咖啡酸苯乙酯对HepG2细胞氧化应激和脂质代谢的调节作用J.食品科学,2023,44(17):86-93.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220909-085.http:/LIU Chang,CHANG Chao,CHEN Ruida,et al.Regulatory effect of caffeic acid phenethyl ester on oxidative stress and lipid metabolism in HepG2 cellsJ.Food Science,2023,44(17):86-93.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220909-085.http:/随着居民膳食结构的变化，高脂膳食摄入的不断增加成为日益显著的现象，过量摄入的高脂膳食会导致机体物质和能量代谢失衡1，引起体质量增加、脂肪积累、氧化应激提高以及系统性炎症2-3，并且伴随着肥胖、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）、代谢综合征等多种疾病的产生4-5。引起人们广泛关注的脂代谢紊乱也和高脂膳食的过量摄入关系密切6，当大量的能量被吸收后，未被消耗的能量会在脂肪组织中储存7，脂肪积累在现有的脂肪细胞中，从而增大细胞体积，然而脂肪细胞储存脂肪的能力有限，多余的脂肪无法被脂肪组织吸收，从而引起血液、肝脏等的功能紊乱，而脂肪组织的扩大会逐渐导致肥胖8-9。咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）是来源于蜂胶中的天然活性物质10，具有许多生物学特性，如抗氧化、免疫调节、抗肿瘤11-13等。Sun Lulu等14的研究表明，CAPE具有改善脂代谢紊乱的作用，其能够调节不同组织脂代谢的多个信号通路，改善高脂膳食脂肪合成调控的一系列关键基因的表达，抑制组织中的脂肪细胞分化，减少脂肪的积累。迟乐15研究发现，CAPE通过调节过氧化物酶体増殖物激活受体-（peroxisome proliferator activated receptor-，PPAR-）、CCAAT/增强子结合蛋白（enhancer binding protein，CEBP）和转化生长因子-（transforming growth factor，TGF-）信号通路影响3T3-L1细胞生成脂肪，抑制脂质合成相关转录因子和下游相关因子的表达，显著降低细胞中甘油三酯（triglyceride，TG）含量和甘油-3-磷酸脱氢酶的活性，具有潜在的抗肥胖作用。有研究显示，CAPE可通过抑制糖尿病小鼠和人肝脏肿瘤细胞（HepG2）模型的应激，活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和核转录因子-B（nuclear factor-B，NF-B）炎症信号通路，改善胰岛素抵抗16。目前这些研究都只集中于CAPE调节脂代谢的生化指标测定以及信号通路的验证，对于其直接作用的位点尚不明确。本研究用CAPE处理油酸诱导的HepG2细胞高脂肪模型，通过转录组测序，对2.5 mol/L CAPE及高脂肪组的细胞进行测序，拟从转录组水平分析CAPE处理后HepG2细胞的基因表达差异，进而对基因进行富集分析，同时筛选出与脂代谢相关的基因，以期揭示CAPE调节脂代谢的潜在机理，为改善由高脂膳食引起的脂代谢紊乱提供理论参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂CAPE、油酸、油红O 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MEM（minimum essential medium）培养基、HepG2细胞 武汉普诺赛生命科技有限公司；TRIzol试剂 南京诺唯赞生物科技股份有限公司；CCK-8细胞活力试剂盒、TG试剂盒、总胆固醇（total cholesterol，T-CHO）试剂盒、总蛋白定量试剂盒（BCA法）南京建成生物工程研究所。1.2 仪器与设备超净工作台、CO2细胞培养箱、Sorvall ST 8小型台式离心机 美国赛默飞世尔科技有限公司；CKX53倒置显微镜 日本Olympus公司；SpectraMax iD3多功能酶 标仪 北京众力挽生物科技有限公司。1.3 方法1.3.1 细胞处理将复苏后的HepG2细胞培养至细胞密度达80%90%，进行传代培养。HepG2细胞培养在10%（质量分数，下同）胎牛血清混合1%青霉素-链霉素试液的MEM完全培养基中，置于37、5%CO2培养箱中，常规换液、传代，当细胞处于对数生长期时取出进行实验。参考文献17 的结果，使用0.2 mmol/L的油酸诱导HepG2细胞形成高脂肪模型的效果最佳，因此将细胞分为正常组（NCD）、高脂肪组（HFD）、高脂肪处理组（包括HFD 7.5 mol/L CAPE（CAPE7.5）、HFD5 mol/L CAPE（CAPE5）、HFD2.5 mol/L CAPE（CAPE2.5）、HFD2 mol/L CAPE（CAPE2）、HFD1 mol/L 88 2023,Vol.44,No.17 食品科学 营养卫生CAPE（CAPE1），每组设置6 个平行对照，对处理后的细胞进行染色观察，在冰水浴条件下超声破碎细胞（300 W超声35 s/次，间隔20 s）后进行理化指标检测，选出降脂效果最优组别进行转录组水平分析。1.3.2 指标检测1.3.2.1 CCK-8细胞活力检测细胞按照正常组（NCD）、高脂肪组（HFD）、高脂肪处理组（包括HFD10 mol/L CAPE、HFD7.5 mol/L CAPE、HFD5 mol/L CAPE、HFD2.5 mol/L CAPE、HFD2 mol/L CAPE、HFD1 mol/L CAPE）分组，使用CCK-8试剂盒检测各处理组细胞活力。1.3.2.2 油红O染色观察及吸光度测定正常组、高脂组及高脂肪处理组细胞弃掉旧培养液并用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）润洗2 次后，加入200 L质量分数4%多聚甲醛溶液，将孔板转移到4 冰箱内固定20 min，弃废液，用PBS润洗2 次，24 孔板中每孔加入200 L 油红O染色10 min。待染色观察样品采用60%（体积分数，下同）异丙醇或70%乙醇溶液快速润洗，吸去废液，每孔加入1 mL PBS后在显微镜下观察拍照；待测吸光度样品使用60%异丙醇或70%乙醇溶液18萃取油红O，室温放置20 min，将萃取出的染液以500 L/孔转移至24 孔培养板中，测定其在490 nm波长处吸光度19。1.3.2.3 细胞内TG和T-CHO水平测定分别收集各处理组细胞并制备成匀浆液。参照相应试剂盒说明书，测定各组HepG2细胞内的TG、T-CHO水平，并通过定量细胞中的蛋白进行标准化处理。1.3.2.4 计算机预测靶点通 过 S w i s s Ta r g e t P r e d i c t i o n（h t t p:/swisstargetprediction.ch/）数据库20检索CAPE的作用靶蛋白及对应基因，通过GeneCards（https:/www.genecards.org/）数据库21检索脂代谢相关靶点基因，将结果导入STRING（https:/string-db.org/）数据库构建共有靶点基因的蛋白相互作用关系网络22。使用DAVID（https:/david.ncifcrf.gov）数据库23对共有的靶点基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。以核心靶点基因编码蛋白为受体、CAPE为配体，采用AutoDock4软件进行分子对接，模拟CAPE调节脂代谢靶点。1.3.2.5 细胞转录组样本处理及转录组测序分析根据实验结果，对调节脂代谢指标效果较显著的HFD2.5 mol/L CAPE组进行转录组水平分析。取对数生长期24的HepG2细胞，以5105 个/孔接种于6 孔细胞板中，每个条件设置3 组平行，即HFD-1、HFD-2、HFD-3（HFD组）和CAPE-1、CAPE-2、CAPE-3（HFD2.5 mol/L CAPE组）。待细胞密度达到80%左右25，加入0.2 mmol/L油酸将细胞诱导成高脂肪模型。培养24 h后，处理组弃去旧液，加入0.2 mmol/L油酸2.5 mol/L CAPE混合培养液。孵育24 h后，用移液枪吸去孔板中的细胞培养基，每孔加入质量分数0.25%胰酶1 mL，消化细胞35 min，吸取MEM完全培养基5 mL终止细胞消化，收集细胞后转入10 mL离心管中，4、200g离心5 min，弃上清液，再加入3 mL PBS重悬，重复离心步骤，细胞沉淀中加入5106 个/mL TRIzol试剂26，吹打混匀，1 mL/管分装入1.5 mL RNase-free离心管中，液氮速冻0.5 h，包埋在干冰中送样。细胞样品RNA质量检测及转录组分析由上海美吉生物医药科技有限公司完成。转录组测序步骤：利用Illumina测序平台对基因序列进行高通量转录组测序；通过Fastp软件对原始测序序列53的碱基质量及测序数据中A、T、G、C碱基含量进行评估，将与分析标准不符合的读数（reads）删除，保留对后续分析有帮助的高质量读数（clean reads）。1.3.2.6 差异表达基因功能注释及富集分析通过Hisat2软件进行基因序列比对分析，综合蛋白质直系同源簇（clusters of orthologous groups of proteins，COG）、非冗余蛋白库（non-redundant protein sequence database，NR）、基因本体（gene ontology，GO）、KEGG、蛋白质序列数据库（Swiss-Prot protein sequence database，Swiss-Prot）、蛋白质家族数据库（protein families database，Pfam）对所表达的基因进行注释；利用DESeq2、DEGseq和edgeR软件进行基因表达量差异分析。差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）筛选标准：|log2 FC|1（FC：实验组基因表达量/对 照组基因表达量）且P0.05。采用美吉生信云分析平台（https:/ 数据统计分析采用Origin 2019软件对数据进行分析与处理，并用GraphPad prism6软件作图，实验数据以平均值标准差表示，数据间比较采用单因素方差分析（ANOVA），以P0.05表示差异显著。2 结果与分析2.1 CAPE对油酸诱导HepG2细胞脂质代谢的影响根据文献28-29报道，CAPE在高于20 mol/L时具有一定细胞毒性，CCK-8细胞活力检测结果显示，10 mol/L CAPE显著降低细胞活力，而CAPE浓度为7.5、5、2.5、2、1 mol/L时，HepG2细胞的活力均保持在98%以上，因此，确定调节脂代谢的CAPE浓度为17.5 mol/L。采用油红O染色观察各组细胞脂滴积累情况，并于490 nm波长处测定其吸光度。和NCD组相比，HFD组油红O染色效果变化显著（图1），说明油酸诱导高脂肪模型建模成功。根据染色效果及吸光度结果分析，在CAPE浓度为2.5 mol/L时，营养卫生 食品科学 2023,Vol.44,No.17 89其对脂质积累的抑制效果最为显著。对改善脂肪积累效果最佳的处理组和高脂肪组（即2.5 mol/L CAPE组和HFD组）进行转录组分析，并对2 组细胞进行油红O染色以确定处理效果，结果如图2A、B所示。和HFD组相比，CAPE 2.5组细胞脂肪积累水平显著降低。进一步测定破碎细胞中TG及T-CHO水平，经过蛋白校准后的细胞TG和T-CHO水平变化如图2C、D所示。与HFD组对比，CAPE 2.5组细胞中TG水平有明显的下降趋势，但CAPE处理对于胆固醇代谢调节效果不显著，这进一步证明CAPE干预具有明显缓解高脂细胞模型中脂滴积累的效果。100 m100 m100 mA1A2A3100 m100 m100 mA4A5A6A490 nm0.00.1NCDHFDCAPE7.5CAPE5CAPE2.5CAPE2CAPE10.20.30.4Bbaababbbab?100 mA7A1A7.NCD组、HFD组及HFD分别与7.5、5、2.5、2、1 mol/L CAPE联合处理HepG2细胞组样品油红O染色观察；B.不同浓度CAPE处理HepG2细胞样品油红O染色吸光度。小写字母不同表示差异显著（P0.05）。图 1 经CAPE处理的HepG2细胞染色观察及吸光度Fig.1 Observation and absorbance of stained HepG2 cells treated with CAPE100 m100 m100 mA1A2A3A490 nm0.00.1NCDHFDCAPE2.50.20.3B*?TG?/?mmol/g pro?0.000.050.100.150.20NCDHFDCAPE2.50.25C*?T-CHO?/?mmol/g pro?0.000.010.02NCDHFDCAPE2.50.03Dnsns?A1A3.NCD、HFD、HFD2.5 mol/L CAPE组油红O染色结果；B.经2.5 mol/L CAPE处理HepG2细胞油红O染色吸光度；C.经2.5 mol/L CAPE处理HepG2细胞的TG水平；D.经2.5 mol/L CAPE处理HepG2细胞的T-CHO水平。*.组间差异显著（P0.05）；*.组间差异高度显著（P0.001）；ns.组间差异不显著（P0.05）。图 2 经2.5 mol/L CAPE处理HepG2细胞的染色及指标检测Fig.2 Observation and characterization of stained HepG2 cells treated with 2.5 mol/L CAPE 2.2 经CAPE处理的HepG2细胞转录组测序及DEGs分析对CAPE处理的HepG2细胞与高脂肪组细胞进行转录组测序及DEGs分析，CAPE组和HFD组经过过滤后的序列数量（即clean reads数目）分别有47 575 973 条和47 867 835 条，所占比例分别为96.07%和96.03%，根据经CAPE处理的HepG2细胞中基因表达的变化情况，共筛选出3 270 个DEGs。其中，表达上调的DEGs有1 351 个，表达下调的DEGs有1 919 个，DEGs表达模式聚类见图3。21012CAPE-1 CAPE-2 CAPE-3 HFD-2 HFD-1 HFD-3图 3 DEGs表达模式聚类Fig.3 Clustering analysis of DEGs expression pattern90 2023,Vol.44,No.17 食品科学 营养卫生2.3 经CAPE处理的HepG2细胞DEGs KEGG通路功能注释及富集分析为进一步明确DEGs的功能，对HFD组及CAPE组之间的DEGs进行KEGG功能注释分析。如图4所示，DEGs分别注释到代谢、遗传信息的处理、环境信息处理、细胞过程、有机系统和人类疾病中。经CAPE处理的HepG2高脂肪模型细胞的DEGs在脂代谢上有相关注释，说明脂代谢相关基因在CAPE的影响下产生差异性表达。?0102030405060708090100KEGG?-?262367525167111 102122929629 2912363871318196212239117672910 10377361356368图 4 KEGG通路功能注释分析Fig.4 Functional annotation analysis of KEGG pathways前15 条显著富集的KEGG通路如表1所示，表中比例表示相应KEGG通路在目标基因集中所占比例，分子为基因集中富集到该KEGG通路的基因或转录本数目，分母为该基因集中具有KEGG注释的基因或转录本总数目，将P0.05定义为该功能显著富集，可以发现显著富集的通路主要集中在代谢和信号转导上。对DEGs进行KEGG通路富集分析，发现DEGs主要参与果糖和甘露糖代谢（fructose and mannose metabolism）、糖酵解/糖 异生（glycolysis/gluconeogenesis）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、脂肪酸降解（fatty acid degradation）等。进一步分析KEGG通路中与脂质代谢和氧化应激相关的主要富集信号通路基因转录水平发现，在HIF-1信号通路上DEGs显著富集，推测CAPE通过HIF-1通路改善高脂诱导的HepG2细胞氧化应激，从而改善脂代谢紊乱和氧化应激压力；另外，多个脂肪酸降解通路相关关键基因表达量差异显著，脂肪酸代谢上游调控基因PPAR表达也发生上调，而PPAR信号通路与脂肪酸分解代谢30-31关系密切。与GeneCards数据库（https:/www.genecards.org/）21靶点预测结果一致，CAPE对肝脏细胞具有多个作用靶点，其通过与靶点的相互作用调节脂代谢相关的多个代谢通路。Sun Lulu等14 所进行的小鼠实验结果显示，CAPE能够调节不同组织脂代谢的多个信号通路以及脂肪合成的一系列关键基因的 表达，改善高脂膳食小鼠脂代谢紊乱，说明CAPE对脂代谢调节具有多靶点作用。表 1 CAPE影响的关键通路列表Table 1 List of key pathways affected by CAPE通路编号通路名称比例类别P值map00051果糖和甘露糖代谢14/1 137代谢0.000 000 1map00010糖酵解/糖异生25/1 137代谢0.000 000 5map04066HIF-1信号通路30/1 137信号转导0.000 004 7map05230癌症中的中心碳代谢17/1 137人类疾病0.000 020 0map04610补体和凝血级联18/1 137有机系统0.000 050 3map00260 甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢13/1 137代谢0.000 083 6map00053抗坏血酸和醛酸代谢11/1 137代谢0.000 146 0map00140类固醇激素生物合成17/1 137代谢0.000 131 0map00071脂肪酸降解9/1 137代谢0.001 162 4map03320PPAR信号通路12/1 137代谢0.008 760 0map00500淀粉和蔗糖代谢6/1 137代谢0.009 209 4map00561甘油酯代谢9/1 137代谢0.013 498 9map04668TNF信号通路12/1 137信号转导0.011 746 6map04152AMPK信号通路14/1 137信号转导0.016 089 4map00120初级胆汁酸生物合成4/1 137代谢0.017 690 42.4 CAPE调节HepG2细胞HIF-1通路改善氧化应激转录组DEGs分析显示，CAPE处理能上调高脂诱导细胞的HIF-1基因转录表达水平（提高了0.326 倍），并且显著调节HIF-1下游厌氧呼吸等通路基因PDK1、HK1、PFKP、PFKFB3、LDHA、ALDOC、ENO1、PGK1、EGLN3的表达（表2），表明CAPE处理能调节HIF-1通路。另外，CAPE组细胞RTK、MEK、elf4E相关基因表达相较于高脂肪组分别上升了1.5、1.37、1.2 倍，且4E-BP1表达量下降了42%，表明CAPE可能通过MEK-ERK-4E-BP1-elf4E通路上调HIF-1的表达（图5）。计算机辅助预测发现，mTOR和MAPK相关的蛋白激酶为CAPE的潜在作用靶点，表明CAPE分子能通过与潜在靶点相互作用，影响HIF-1蛋白翻译表达。进一步分析显示，CAPE组中参与HIF-1泛素化降解通路的基因PHD表达量降低，表明CAPE处理能抑制泛素化介导的HIF-1蛋白降解，提高HIF-1蛋白积累水平。因此，CAPE处理能调节HIF-1的翻译和泛素化降解，促进机体无氧呼吸的进程，缓解高脂处理细胞的氧化应激压力。氧化应激在脂代谢紊乱及相关疾病中的重要作用备受瞩目32。研究表明，机体氧化应激的增加常伴随脂质的异常堆积加剧以及脂质从头合成的显著改变33。另外，活性氧和炎症诱导的氧化应激能够导致脂质过氧化、线粒体和过氧化物酶体的脂肪酸氧化功能损伤，并促进细胞因子释放，进一步加剧炎症和肝细胞纤维化，这是酒精性脂肪肝和其他肝脏疾病的主要发展机制34。营养卫生 食品科学 2023,Vol.44,No.17 91表 2 HIF-1通路DEGs表达Table 2 Expression of DEGs associated with HIF-1 signaling pathwayDEGs基因编码蛋白CAPE/HFDlog2 FC（CAPE/HFD）P值MAP2K1丝裂原活化蛋白激酶激酶12.3711.2250.000 005 9PDK1丙酮酸脱氢酶激酶14.2152.0750.000 000 0HK1己糖激酶13.8381.9400.000 014 5PFKP磷酸果糖激酶2.4691.3040.000 013 1PFKFB36-磷酸果糖-2-激酶9.3493.2250.000 000 0LDHA乳酸脱氢酶A3.0671.6160.000 000 0ALDOC果糖二磷酸醛缩酶C2.9301.5510.000 000 0ENO1烯醇化酶3.4961.8060.000 000 0PGK1磷酸甘油酸激酶5.2742.3990.000 000 0EGLN3缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶2.3731.2460.000 005 4PGK1?PKF2Glut1DNALDHA?DNAMAPK?E3?HIF-1mRNA?MEKERKMNKVHLRbx1ElonginCCUL2uPI3K4E-BP1eIf4EElonginB?AKTmTORP70S6KrpS6?HKPFKLmTOR?PHD?GAPDHALDOAHIF-1PI3K-Akt?HIF-1ENO1?RTKPKCu.泛素（ubiquitin）。红色方框代表基因表达量上调；蓝色方框代表基因表达量下调。图6同。图 5 CAPE调节HIF-1通路的潜在机制分析Fig.5 Analysis of the underlying mechanism of CAPE regulation of HIF-1 signaling pathway2.5 CAPE调节HepG2细胞脂肪酸分解代谢通路经KEGG信号通路基因差异表达分析发现，CAPE能改善高脂HepG2细胞的脂肪酸分解代谢和PPAR信号通路相关多个基因的表达（表3）。PPAR通路参与调节脂肪酸转运、脂肪酸氧化35、脂肪酸降解及胆固醇代谢等重要脂代谢通路。如图6所示，相较于高脂肪组，CAPE组细胞PPAR下游与脂肪酸氧化代谢相关的蛋白表达量明显上升，如肉碱棕榈酰转移酶I（carnitine palmotoyltransferase I，CPT1）和肉碱棕榈酰转移酶II（carnitine palmotoyltransferase II，CPT2），其中调控CPT1、CPT2、PPAR表达的CPT1A、CPT2、PPAR基因分别上调了1.039、0.755、0.661 倍，调控脂肪酸结合蛋白5表达的FABP5基因上调了1.598 倍，表明CAPE处理促进了细胞内脂肪酸的活化进程。另外，CAPE组高脂诱导细胞脂肪酸氧化进程相关酶基因表达上调，在脂肪酸 氧化的氧化、水合、脱氢、硫解364 个过程中，调控酰基辅酶A脱氢酶（acyl-coenzyme A dehydrogenase，ACADM）合成的基因ACADM表达量上升了0.38 倍，编码长链酰基辅酶A脱氢酶（acyl coenzyme a dehydrogenase very long chain，ACADVL）合成的基因ACADVL表达量上升了0.39 倍；调控烯醇辅酶A水合酶S1（enoyl-coenzyme A hydratase S1，ECHS1）和烯酰辅酶A 水合酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHA）合成的基因ECHS1及HADHA表达量分别升高了0.2 倍和0.31 倍；调控L-羟脂酰CoA脱氢酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADH）合成基因HADH表达量提高了1.42 倍；编码脂酰CoA硫解酶（cetyl-coenzyme A acyltransferase，ACAA）合成的基因ACAA1和ACAA2表达量分别没有变化和提高了0.47 倍，促进了长链脂肪酸的氧化分解。由此可知，CAPE处理可能通过PPAR通路和脂肪酸氧化通路改善高脂诱导HepG2细胞内的脂代谢。表 3 PPAR通路DEGs表达Table 3 Expression of DEGs associated with PPAR signaling pathwayDEGs基因表述CAPE/HFDlog2 FC（CAPE/HFD）P值FABP5脂肪酸结合蛋白52.5981.1120.000 000 3CYP7A1胆固醇-7-羟化酶0.2781.8490.000 000 3CPT1A肉碱棕榈酰转移酶1A2.0391.0280.000 000 0HACD43-羟酰基-CoA 脱水酶46.1372.6170.001 560 0FADS6脂肪酸去饱和酶 62.4371.2890.014 368 3PCK1磷酸烯醇丙酮酸羧激酶2.1671.1160.000 893 9ACOT11酰基辅酶A硫酯酶112.1421.0980.000 178 0?ACBPLPL?FABP1FABP3ACADMACADVL?A?-2-?APPAR/RXRDNA?A?AECHS1HADHA?2?ACAA2ACAA1?-?AL-?AHADH?HMGCS2CPT-1、CPT-2图 6 CAPE调节脂肪酸分解的潜在通路分析Fig.6 Analysis of the underlying pathways of CAPE regulation of fatty acid breakdown对CAPE调节脂代谢作用具体机制的研究表明，可能存在多种作用靶点和调节通路以及组织和细胞特异性37。迟乐15对3T3-L1脂肪细胞研究发现，CAPE通过调节PPAR-、CEBP和TGF-信号通路影响脂肪合成，抑制脂质合成相关转录因子和下游相关因子的表达，发挥抗肥胖的作用。Nie Jiarui等16研究发现，CAPE可通过抑制糖尿病小鼠和HepG2细胞模型的JNK和NF-B炎症信号通路改善胰岛素抵抗和糖脂代谢。最近有研究表明，CAPE能显著抑制小鼠肠道菌群胆盐水解酶（bile salt hydrolase，BSH）活性，提高胆汁酸中牛磺-鼠胆酸含量，从而选择性抑制胆汁酸法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR），抑制高脂膳食引起的神经酰胺含量升高和脂肪生成，同时改善胰高血糖素样肽-1（glucagon-like pept