高效液相色谱-质谱联用法测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基.pdf

李志东，葛朝晖，张海娟.高效液相色谱-质谱联用法测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基J.中兽医医药杂志，2023，42（5）：57-59喉症丸是临床常用的中成药，可用于治疗疮疖、咽喉炎、扁桃体炎、牙周炎以及带状疱疹等1-3。兽医临床上，喉症丸还广泛应用于白喉型鸡痘的治疗4。喉症丸由蟾酥（酒制）、雄黄、板蓝根、牛黄等十味中药组成，其中蟾酥是主药之一，也是有毒中药。蟾酥的“治疗窗”窄，被列为特殊管理的毒麻中药材，同时蟾酥在中成药中应用广泛，有88个品种收录于2020年版 中华人民共和国药典 和 中华人民共和国卫生部药品标准。然而上述法典中仅有麝香保心丸、牙痛一粒丸和熊胆救心丸等少数几个品种对蟾酥中指标性成分华蟾酥毒基和脂蟾毒配基有含量要求，其他制剂均未针对蟾酥进行质量控制，为安全用药带来风险。近年来，刘册家等5-8利用高效液相色谱法探索了蟾酥及喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的质控方法。本研究参考有关文献9-11，采用高效液相色谱-质谱联用法对喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基进行靶向监测，为喉症丸的质量控制和后续喉症丸代谢组学的研究提供依据。1仪器与试药1.1仪器Finnigan Surveyor Plus-LCQ Deca XP 型色谱质谱联用仪（美国 Thermo 公司）；Thermo Hypersil BDS C18色谱柱（250.0 mm4.6 mm，5 m）；ME104E型电子分析天平（梅特勒-托利多公司，精度 0.01 mg）；SB-5200DTD型数控超声波清洗器（宁波新芝生物有限公司）；SPT-24A全自动氮吹浓缩仪（北京斯珀特公司）。高效液相色谱质谱联用仪所用试剂均为色谱纯，去离子水经优普纯水系统制备，其余为分析纯。1.2试药华蟾酥毒基对照品（C26H34O6，批号PJ0727RA13，上海源叶生物公司，纯度98%）。脂蟾毒配基对照品（C24H32O4，批号PJ0727RB13，上海源叶生物有限公司，纯度98%）。喉症丸（山东某制药有限公司，批号1704002、1709003、1704006、1704007、1708001，规格DOI：10.13823/ki.jtcvm.2023.087中图分类号：S853.7文献标识码：A文章编号：1000-6354(2023)05-0057-03高效液相色谱-质谱联用法测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基李志东1，葛朝晖2，张海娟2（1.济宁医学院科研处，山东日照276826；2.临沂大学医学院，山东临沂276000）摘要：建立高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量的方法。采用 HPLC-MS 正离子多反应监测模式进行测定，色谱柱为 Thermo Hypersil BDS C18（250.0 mm4.6 mm，5 m），流动相为乙腈-1%乙酸溶液（38 62），流速为 0.5 mL/min，检测波长为296 nm，柱温为20。质谱条件：鞘气流速40 arb，辅气流速5 arb，喷雾电压4.5 kV，毛细管温度300。结果显示，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的检测质量浓度线性范围均为50300 g/mL（r=0.999 2），重复性试验、精密度试验、稳定性（12 h）试验的 RSD 均小于 1.00%（n=5或 n=6），加样回收率分别为 101.8%（RSD为2.61%，n=6）和100.9%（RSD为3.20%，n=6）。该方法灵敏度高、重复性好，能准确测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，可用于喉症丸的质量控制。关键词：喉症丸；高效液相色谱-质谱联用法；华蟾酥毒基；脂蟾毒配基；含量测定收稿日期：2023-04-28；网络首发日期：2023-07-06网络首发链接：https：/ 57Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine2023年42卷第5期Vol.42 No.5 202390粒*2瓶，每克224粒；广州某药业股份有限公司，批号A06011，规格0.27 g*2瓶，每克224粒）。2方法2.1试验条件2.1.1色谱条件色谱柱Thermo Hypersil BDS C18色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m）；流动相为乙腈-1%乙酸溶液（38 62）；流速0.5 mL/min；检测波长296 nm；柱温20；进样量10 L。2.1.2质谱条件离子源模式ESI，正离子模式；干燥气和雾化气为高纯氮气；T 型管 1 1分流，喷雾电压4.5 kV，毛细管温度300，鞘气流速40 arb，辅气流速5 arb。2.2溶液的制备2.2.1对照品溶液精密称取各对照品适量，用甲醇溶解并稀释至质量浓度为500 g/mL的对照品溶液，用0.45 m滤膜过滤，取续滤液，即为对照品储备液。2.2.2供试品溶液精密称取药品粉末0.25 g，置于20 mL 量瓶中，加适量甲醇，超声（功率 240 W，频率40 kHz）提取30 min，静置至常温，用甲醇定容，摇匀，取上清液15 mL氮吹至干燥，加入2 mL甲醇将供试品复溶，混匀，经0.45 m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。2.3专属性试验取“2.2”项下对照品溶液和供试品溶液各适量，按照“2.1”项下试验条件进样分析，记录提取离子流色谱图。结果表明，两种待测成分在 12 min 内可良好分离，可被同时检测，专属性良好。2.4方法学考察2.4.1线性关系考察精密量取“2.2.1”项下对照品溶液，加入甲醇配制成质量浓度为300 g/mL、250 g/mL、200 g/mL、150 g/mL、100 g/mL、50 g/mL 的系列对照品溶液。取上述系列对照品溶液适量，按照“2.1”项下条件进样测定，记录峰面积。以对照品溶液质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。回归方程与线性关系见表1。2.4.2定量限与检测限考察精密量取“2.2.1”项下对照品储备液适量，倍比稀释，并按照“2.1”项下试验条件进样检测，取信噪比（S/N）为3和10时的浓度值分别为检测限和定量限。测得华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的定量限分别为0.82 ng/mL和1.80 ng/mL。2.4.3精密度试验取“2.2.1”项下对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积。测得华蟾酥毒基与脂蟾毒配基峰面积的RSD分别为0.40%和0.50%（n=6），表明仪器精密度良好。2.4.4重复性试验精密称取喉症丸样品（批号1704002）适量，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，按照“2.1”项下条件进样测定，记录色谱并计算含量。测得华蟾酥毒基与脂蟾毒配基含量RSD分别为0.50%和0.70%，表明该方法重复性良好。2.4.5稳定性试验取“2.2.2”项下同一供试品溶液适量，分别于室温下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h，按照“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积。计算华蟾酥毒基与脂蟾毒配基峰面积的RSD分别为0.80%和0.90%（n=5），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。2.4.6加样回收率试验取质量浓度为 500 g/mL的华蟾酥毒基和250 g/mL脂蟾毒配基的标准品溶液各1 mL，置6个具塞锥形瓶中，氮吹吹干，分别加入粉碎的喉症丸样品（批号1708001）约0.25 g。按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下试验条件进样检测，根据峰面积计算加样回收率，结果见表2。2.4.7样品含量测定取市售 6个批次的喉症丸样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下试验条件进样检测，根据峰面积计算样品含量，结果见表3。表1回归方程与线性关系Table 1Regression equations and linear ranges待测成分华蟾酥毒基脂蟾毒配基回归方程y=15.110 x-92.947y=14.748x+74.947r0.999 20.999 2线性范围/（gmL-1）5030050300表2加样回收率试验结果（n=6）Table 2Results of recovery tests(n=6)待测成分华蟾酥毒基脂蟾毒配基样品含量/mg1.4891.4851.4861.4911.4861.4870.7160.7150.7170.7140.7170.719对照加入量/mg0.500.500.500.500.500.500.250.250.250.250.250.25测得值/mg2.0111.9821.9911.9851.9942.0140.9720.9640.9770.9530.9770.969回收率/%104.499.4101.098.8101.6105.4102.499.6104.095.6104.0100.0平均回收率/%101.8100.9RSD/%2.613.20 58李志东，葛朝晖，张海娟.高效液相色谱-质谱联用法测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基J.中兽医医药杂志，2023，42（5）：57-593讨论3.1流动相的选择在喉症丸质量控制研究方面的文献中，流动相的选择主要有乙腈-水（1 1）混合溶液和乙腈-0.05%磷酸二氢钾（40 60）混合溶液，预试验以乙腈-水（1 1）为流动相，结果发现在该条件下华蟾酥毒基和脂蟾毒配基两种成分不能实现良好分离。磷酸二氢钾是非挥发性盐，不适宜在质谱测定时使用。尝试采用不同比例的乙腈-水混合溶液进行测定，并添加适当的乙酸来调节溶液pH值，最终选定流动相为乙腈-1%乙酸（38 62）混合溶液。3.2柱温及流速的选择通过不同柱温及流速筛选，最后确定流动相流速0.5 mL/min、柱温20的液相分离条件。在该条件下华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的分离度可达1.5。本试验所采用方法灵敏度高，重复性好，可以准确测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。由检测结果看，2个生产厂家6个批次的喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量相差很小，表明喉症丸质量保持相对稳定。为保证喉症丸的用药安全，建议有关部门尽快制定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的限度范围。参考文献1高清伟.喉症丸治疗急性扁桃体炎86例疗效观察 J.中国校医，2010，24（1）：69.2邵兴龙.喉症丸+食醋联合治疗带状疱疹36例 J.人民军医，2005（1）：60.3孟正英.耳穴贴压喉症丸加中频电疗仪治疗急性咽喉肿痛 J.护士进修杂志，2006（4）：373.4柳慧爽.鸡痘的分类及治疗 J.中国畜牧兽医文摘，2016，32（12）：212.5刘册家，王真，刁瑞丽，等.HPLC法测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量 J.亚太传统医药，2019，15（4）：51-546张力，梁记芯，朱金福.高效液相色谱法测定喉症丸中蟾酥的含量 J.今日药学，2013，23（11）：743-745.7刘京京，宋嬿，卞雪莲，等.蟾酥贮藏期间化学成分的变化 J.中成药，2022，44（11）：3545-2548.8周成美，胡晶红，任鑫，等.基于指纹图谱结合多成分定量分析的蟾酥药材质量评价研究 J.天然产物研究与开发，2022，34（11）：1846-1856.9程妍，承晨，薛平.LC-MS/MS法测定抗栓胶囊中蟾酥的两种成分含量 J.药学与临床研究，2022，30（4）：319-322.10石莉尧，房蕴歌，陈两绵，等.以蟾酥制剂为例探讨一测多评法在中成药质量评价和控制中的应用研究 J.中国中药杂志，2021，46（12）：2931-2941.11焦安妮，于敏，李蕾，等.高效液相色谱-串联质谱法测定干蟾皮中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基 J.中草药，2019，50（15）：3687-3690.Determination of cinobufagin and resibufogenin in Houzheng pills by highperformance liquid chromatography-mass spectrometryLI Zhidong1,GE Zhaohui2,ZHANG Haijuan1(1.Scientific Research Division,Jining Medical University,Rizhao Shandong 276826,China;2.School of Medicine,Linyi University,Linyi Shandong 276000,China)Abstract:To establish a method for simultaneous determination of cinobufagin and resibufogenin in Houzheng pills.The sample was separated by Thermo-BDS Hypersil C18(250.0 mm4.6 mm,5 m)and detected by liquid chromatography-mass spectrometry.The mobile phase was acetonitrile-1%acetic acid solution(38 62),the flow rate was 0.5 mL/min,thecolumn temperature was 20.Sheath gas flow rate was 40 arb and aux gas flow rate was 5 arb.Spray voltage was 4.5 kV,thecapillary temperature was 300.The linear range of cinobufagin and resibufogenin was 50-300 g/mL(r=0.999 2),theRSD of repeatability,precision and stability(12 h)experiments were all less than 1.00%(n=5 or n=6).The recovery rate ofsample addition were 101.8%(RSD=2.61%)and 100.9%(RSD=3.20%),respectively.The method is sensitive andreproducible,and can be used for the simultaneous determination of cinobufagin and resibufogenin in Houzheng pills.Keywords:Houzheng pills;HPLC-MS;cinobufagin;resibufogenin;content determination表3样品中华蟾酥毒基与脂蟾毒配基含量测定结果（n=3,mg/g）Table 3Results of sample determination(n=3,mg/g)批次A0601117040021709003170400617040071708001华蟾酥毒基1.8641.5601.6351.6131.4701.489脂蟾毒配基0.8020.7211.0690.7390.6730.716 59