VvmiR396及其靶基因VvGRF1在葡萄种子发育过程中的表达分析.pdf

南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:国家重点研发计划项目()国家自然科学基金项目()江苏省种业振兴“揭榜挂帅”项目()江苏省高等学校优势学科项目()作者简介:张晓雯硕士研究生通信作者:王晨教授博导研究方向为葡萄花果发育表观调控与分子设计育种:.张晓雯宣旭娴白云赫等.及其靶基因 在葡萄种子发育过程中的表达分析.南京农业大学学报():.():.及其靶基因 在葡萄种子发育过程中的表达分析张晓雯宣旭娴白云赫王霏吴伟民王壮伟董天宇张川房经贵王晨(.南京农业大学园艺学院江苏 南京.江苏省农业科学院果树研究所江苏 南京)摘要:目目的的 本文旨在鉴定葡萄 家族成员()及其靶基因 探究 在种子败育/发育中的作用模式 方方法法 通过、烟草共转化活体验证等方法鉴定 及其靶基因利用生物信息学分析其潜在功能与进化保守性利用 方法检测 在有核和无核品种中的时空表达差异及 相关性差异 结结果果 与葡萄品种魏可相比京可晶花后 时种子发育被严重抑制出现败育且种子萎缩而魏可种子正常发育 对、的前体及其成熟体序列进行鉴定其前体均可形成典型的茎环结构成熟体序列均位于茎环的 臂上 与烟草、番茄等物种的同源序列亲缘关系较近而与小麦的亲缘关系较远 预测到 的 条潜在靶基因利用、技术体外鉴定到 和 是 的真实靶基因且 对 的裂解位点及频度为(/、/)/(/、/)对 的裂解位点及频度为(/、/)/(/、/)进一步利用烟草共转化体系对它们的裂解作用进行活体验证发现 对 的裂解作用强于 同源保守性分析发现:与胡杨、毛白杨、荷花、烟草等物种的亲缘关系较近且不同物种的 蛋白均含有、两个结构域(的前体基因)和 的启动子上都有多种激素(生长素、赤霉素、脱落酸等)响应元件 定量结果表明:在京可晶种子败育过程中 的表达量逐渐升高且在败育关键期(花后 )表达量最高而 呈现相反表达模式在有核品种魏可种子发育中 表达量呈下降趋势在花后 表达量最低靶基因的表达模式相反表明 可能介导 正调控葡萄种子败育而负调控种子的发育 进一步相关性分析发现京可晶种子败育中 与 的负相关性最高 结结论论 在假单性结实葡萄京可晶中鉴定到、共 个成员 可能是参与调控葡萄种胚败育的重要模块关键词:葡萄假单性结实种胚败育中图分类号:.文献标志码:文章编号:()(.):()/.第 期张晓雯等:及其靶基因 在葡萄种子发育过程中的表达分析 .(/)/(/)(/)/(/).(.)().().:葡萄(.)是在全球范围种植的多年生高经济效益果树其广泛应用于鲜食、制干、饮料等方面因而在人们的饮食健康中扮演着重要角色 其中无核葡萄因食用方便或制干、制罐中无需去核等特点深受消费者和加工者青睐其相关研究也备受关注但其无核的分子机制目前尚不清楚 单性结实是形成无核葡萄的重要途径主要包括自然单性结实、刺激性单性结实和假单性结实(种子败育)种类型目前栽培的无核葡萄品种约 来自种子败育 近年来围绕葡萄种子败育的研究主要集中在生理机制、败育相关影响因子和胚挽救技术等方面而其败育的分子机制尚不明确 是一类新的内源非编码 其可通过调控靶基因表达参与植物生长发育、响应激素和胁迫等多种过程 据报道()模块的调控作用在种子植物中较为保守但其功能具有多样性 目前在水稻、烟草、番茄、拟南芥、小麦、杨树、苹果等多种物种上已有该模块的报道主要集中在 介导 调控植物生长发育和抗逆胁迫等方面 烟草 通过负调控 来介导叶形态发育并可提高烟草的抗旱性番茄 介导靶基因 参与调控果实质量、心室数、光泽度、果皮厚度、萼片长度和宽度杨树 通过介导微调细胞增殖和扩增进而调控叶片大小苹果 参与调控果实发育且在不定根诱导和根系伸长中也发挥关键作用 近期研究发现 可以通过生长素途径参与拟南芥种胚和葡萄花序结构的调控以及水稻籽粒大小与稻瘟病抗性的调控 研究表明 可能在种子籽粒发育中起着重要作用但有关其在葡萄种子发育/败育中的作用尚未见报道尽管已在多个物种上开展 研究但由于表达及其作用模式具有物种或时空特异性其在葡萄中的作用模式有待进一步鉴定 已有研究表明 在种子籽粒发育中起着重要作用但其在种子败育方面的作用并不清楚而我们前期初步研究发现其在葡萄种子败育的关键期具有高表达推测其可能参与该过程的调控 为了验证该假说本研究首先在葡萄中鉴定了 的精确序列预测并验证其真实的靶基因及其在种子败育中的裂解作用模式再通过生物信息学分析其序列的进化保守性并通过启动子作用元件分析预测其潜在的功能综合比较分析 及其靶基因 在有核和无核葡萄品种中的时空表达差异以及 表达相关性初步认识 及其靶基因在葡萄种子败育/发育的调控作用 材料与方法.试验材料种胚败育型葡萄品种京可晶和有核葡萄品种魏可取自江苏省农业科学院葡萄科研基地 选取南 京 农 业 大 学 学 报第 卷生长势基本相同的花序在花后()、()、()、()和 ()分别采集葡萄果实将种子/种子区(种胚败育果实中与对照组种子相对应的组织部位)剥离后立即放入液氮中速冻于 超低温冰箱保存备用.成熟体序列克隆及前体鉴定通过(:/./)数据库获取葡萄 家族()的成熟体序列用 (:/././)软件设计扩增引物(表)选择 技术进行基因扩增 产物经 琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收送公司测序表 引物序列及其用途 引物名称 引物序列 ()引物用途 /前体扩增 /前体扩增 /前体扩增 /前体扩增 /内参引物 /定量 引物 /定量 引物 /定量 引物 /定量 引物 /定量 引物 .的靶基因预测葡萄 的靶基因通过 (:/./)进行预测且提交的小/预载转录本中最大期望值()为.将预测到的序列在葡萄基因数据库(:/./.)进行比对和功能注释.的靶基因验证.和 定位 切割位点使用本课题组早期改良的 和开发的 技术确定 介导靶基因的 和 末端剪切产物 根据 等的方法将 添加到 ()并使用 连接酶连接到 衔接子()通过苯酚/氯仿提取乙醇沉淀回收()尾 和衔接子连接的 将()尾 和衔接子连接的 进一步反转录成 和 的 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和测序.烟草共转化活体验证 构建、(基因中 靶区前的基因片段)、(基因中 靶区前的基因片段)表达载体转化农杆菌备用 选取 周龄的本氏烟草植株进行农杆菌注射(于两叶脉之间侵染)注射完毕后黑暗培养第 天进行组织化学染色 用打孔器将烟草叶片打孔后浸泡到 染液中放入真空过滤器真空泵 取出样品放入 的培养箱中过夜染色 染色结束后将一部分烟草叶片放在液氮中研磨成粉使用 等的方法进行 活性检测 其余染色叶片剔除染色液加入足够的 乙醇溶液放入 水浴锅中脱色不断更换脱色液(乙醇溶液)直到样本变白观察脱色完成的样品并拍照.及其靶基因的生物信息学分析用 软 件 对 序 列 进 行 比 对 分 析 并 利 用 在 线 软 件 .第 期张晓雯等:及其靶基因 在葡萄种子发育过程中的表达分析(:/./.)预测分析 前体的二级结构用(:/././)绘制 的染色体定位图在 .软件中选择邻近法且 为 构建包括葡萄在内的 个植物 的系统进化树运用(:/./)对进化树进行优化 利用 .软件分析不同物种 成熟序列碱基的保守性 的系统进化与基因序列结构分析工具为 .软件和 ()(:/./.)蛋白的保守基序与保守结构域分析分别在(:/./)和(:/./)上完成.葡萄 及其靶基因 的启动子作用元件分析通过葡萄基因组数据库 (:/./.)和 (:/./)预测下载(前体基因)和 基因的启动子序列在 (:/./)上获取启动子作用元件分析结果.及其靶基因的表达特性及相关性分析采用 法提取不同时期魏可和京可晶种子区的 反转录为 以不同时期的 为模板采用实时定量()检测 前体基因和 的相对表达量 扩增体系及程序按照 试剂盒(宝生物工程有限公司)说明书进行每个样品 个重复 用.软件进行数据统计及差异显著性分析使用 软件绘图 结果与分析.京可晶和魏可葡萄果实发育过程中的形态学分析通过对比种胚败育型葡萄品种京可晶和有核品种魏可的果实(图)和胚珠(图)的外观形态和纵横径(图)发现花后 京可晶和魏可的胚珠均正常发育且大小相差无异花后 京可晶的胚珠仍可正常发育而在花后 后京可晶胚珠发育不良逐渐缩小退化未能形成正常的种子而魏可的胚珠发育正常最终形成成熟种子 推测京可晶的种胚败育自花后 开始花后 可能是胚败育的关键时期图 京可晶和魏可葡萄生长发育图 .京可晶和魏可葡萄浆果发育图.京可晶和魏可葡萄胚珠发育图.南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 京可晶和魏可葡萄果实及种子纵横径变化 图 序列鉴定和染色体分布 ./成熟体序列./前体基因扩增(.).前体的二级茎环结构及其在染色体上的定位././(.).及其前体基因序列的鉴定利用 共鉴定了、/条成熟体序列它们的序列与(:/./)中的数据序列相似性 除 为 以外其他均为、/比 在 末端多 个碱基且 的 末端碱基为/的 末端碱基为(图)进一步克隆鉴定了 家族 个成员的前体基因序列长度分别为、和 (图)通过 .软件预测 前体序 第 期张晓雯等:及其靶基因 在葡萄种子发育过程中的表达分析列的二级结构发现 条 的前体序列均可形成典型的茎环结构且其成熟体序列均位于茎环结构的 臂上这表明 在葡萄中可稳定存在(图)利用 软件对其染色体定位结果显示 家族 个成员分布在 条葡萄染色体上 和 分布于葡萄 号染色体上 位于葡萄 号染色体上 位于葡萄 号染色体上(图 )和 成熟体序列相同却分布在不同染色体上而 和 成熟体序列不同却分布在相同的染色体上表明 染色体位置保守性与其成熟体序列保守性并非完全一致.成熟体序列的同源保守性及进化分析对烟草、番茄、水稻、拟南芥等 种植物的 成熟体进行同源保守性及进化分析(图)发现不同物种的 具有保守性特别是在 端第、位碱基高度保守第 位碱基均为 第 和 位均分别为、的 端第 位比其他 多 个 并且除小麦()外其他 成熟序列 端碱基均以“”开头这意味着 生源合成机制在这些物种中保守/和/成熟体序列完全相同表明其可能具有相同的生物学功能 不同物种的 家族成员的数量也不同小麦 家族仅有 个成员拟南芥、番茄和桃等物种均有 个成员而烟草(个)、葡萄(个)、草莓(个)、甜瓜(个)、柑橘(个)、苹果(个)、毛果杨(个)、玉米(个)和水稻(个)等物种的 家族均有多个成员 从进化图谱(图)中发现、聚集在同一分支上 和烟草、番茄等物种同源序列的亲缘关系较近与小麦的亲缘关系较远图 成熟体序列比对及进化分析 ./成熟体序列比对 /./成熟体序列进化分析 /.:葡萄 :桃 :玉米 :小麦 :水稻 :烟草:番茄 :毛果杨 :柑橘 :苹果:甜瓜 :拟南芥 :草莓 .的靶基因预测与靶裂解验证.的靶基因预测及其序列匹配程度分析 利用 工具预测 的靶基因 家族不同成员均有相同的靶基因、且抑制方式均为裂解作用(表)进一步对 及其靶基因的匹配程度研究发现、与 的匹配程度均低于/对于不同的 匹配程度也不同 虽然 和 的成熟体序列不同但都与 存在 个错南 京 农 业 大 学 学 报第 卷配碱基且/与 存在 个错配碱基(图)同一个 对于不同的 靶裂解区可能完全相同 对于 和 的裂解区碱基相同且/也类似说明 家族成员与其靶基因之间的作用强度和裂解靶区都存在一定差异 我们前期初步研究发现 及其靶基因在假单性结实葡萄种子败育中有特异表达推测它们可能在假单性结实过程中发挥重要作用 本试验进一步对 对于 和 的裂解作用展开研究表 及其靶基因信息 名称 成熟体序列 靶基因编号 期望值 长度/靶区()/.().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().注:编码序列 .图 与靶基因 和 的匹配程度 直线连接完全互补配对的碱基其余用圆圈连接 .及其靶基因裂解验证通过、和活体验证鉴定 对 和 的裂解作用 和 分别鉴定 末端和 末端裂解产物(图)/均可裂解 裂解位点为 端的第 和第 位裂解频度为/和/裂解频度为/和/裂解 的位点 第 期张晓雯等:及其靶基因 在葡萄种子发育过程中的表达分析为 端的第 和 位 裂解频度为/和/裂解频度为/和/利用烟草瞬时共转化技术(载体示意图见图)研究了 与、之间的体内相互作用 烟草叶片、和 中均有 表达 而烟草叶片 中未检测到 表达 和 共转的叶片中 表达显著下调 和 共转的叶片中 表达也有所下调但下调程度不及 和 共转的叶片而 和 以及 和 共转的叶片中 表达无明显差异(图)这些结果表明 通过碱基互补配对抑制了 和 叶中的 表达 表达活性分析结果与组织化学观察结果一致(图)该试验结果从分子和生理两方面共同证明了 和 是 家族真实的靶基因而相比于 对于 的裂解作用更强故本试验重点对靶基因(.)开展研究分析 介导 的调控作用图 对靶基因 裂解的验证 .对靶基因 和 的裂解位点示意图.共转化的载体示意图.烟草共转化叶片 染色.烟草叶片 活性.南 京 农 业 大 学 学 报第 卷.的序列进化及保守性分析.序列结构及进化分析分别利用 .和 ()对 进行进化分析与内含子/外显子结构分析(图)发现、分布在第 主支上而其他 个物种的 聚集为一组 基因与、等物种的亲缘关系较近与、的亲缘关系较远 不同物种的 基因结构也存在一定差异除枣的()含有 个外显子和 个内含子外其他物种(包括葡萄在内)的 均含有 个内含子、个外显子.蛋白作用元件及保守结构域分析 分析 蛋白保守基序(图)发现 与其他 个物种 蛋白的作用元件有较高保守性且其排列顺序以及数量高度一致 利用 预测 蛋白保守结构域(图)发现 蛋白和其他 个物种 蛋白均含有 和 个保守结构域且 个结构域的排列顺序完全一致表明 蛋白与其他物种氨基酸序列和结构域保守性较高这为 蛋白在不同物种中存在相似功能提供了有力证据图 结构与进化保守性分析 .基因结构与进化分析 .蛋白 分析 .保守结构域分析 .:葡萄 :榴莲:山核桃 :枣 :毛果杨 :荷花 :胡杨 :桃 :樱桃 :苹果 :烟草.及其靶基因 的启动子顺式作用元件分析.的启动子顺式作用元件分析 通过对(的前体基因)启动子分析发现在 启动子中有 类主要作用元件分别是光响应作用元件、激素作用元件、胁迫相关作用元件和组织特异性元件(图)个成员中 启动子上的作用元件数量最多共有 个除 启动子含有组织(种子)特异性元件外其余成员的启动子均仅含有其余 类作用元件除 启动子外其余成员的启动子均有胁迫相关作用元件 启动子中都有较多的光响应作用元件:启动子中有 个 有 个 有 个 有 个这可能与植物进行光合作用密切相关 个 启动子上激素响应元件的种类和数量也各有差异 启动子上有 个赤霉素响应元件和 个脱落酸响应元件 启动子上的激素响应元 第 期张晓雯等:及其靶基因 在葡萄种子发育过程中的表达分析件为生长素(个)、赤霉素(个)、细胞分裂素(个)、脱落酸(个)、茉莉酸甲酯(个)启动子上只有 个生长素响应元件 启动子上有 个茉莉酸甲酯响应元件、个生长素元件和 个水杨酸元件说明 成员可能分别参与不同的激素信号通路调控而只有 启动子上含有 个种子特异性表达密切相关的顺式作用元件进一步说明 特别是 在种子发育过程中可能起着关键的作用图 启动子作用元件分析 .靶基因 的启动子顺式作用元件分析 通过 对 的靶基因 的启动子分析发现 的启动子中有 类主要作用元件:光响应作用元件、激素作用元件和胁迫相关作用元件(表)其中光响应作用元件 个胁迫相关作用元件 个激素作用元件 个 胁迫作用元件中包括 个低温响应元件和 个防御应激响应元件激素作用元件中脱落酸响应元件最多有 个生长素和赤霉素响应元件各 个茉莉酸甲酯响应元件 个 因此 可能通过响应不同激素信号进而参与生长发育等过程的调控综合 及其靶基因 启动子分析的结果推测 和 可能通过响应不同激素信号通路参与葡萄种子发育过程的调控 此外 可能也参与胁迫响应特别是对于低温胁迫的响应表 启动子作用元件分析 元件类型 元件名称 核心序列 数量功能激素响应元件 脱落酸响应元件 赤霉素响应元件 生长素响应元件 茉莉酸甲酯响应元件 茉莉酸甲酯响应元件 光响应元件 光响应元件 光响应元件 光响应元件 光响应元件 光响应元件 光响应元件 光响应元件 胁迫响应元件 防御应激响应元件 低温响应元件 .及靶基因在葡萄种胚败育/种子发育的时空表达特征及作用模式如图 所示:在京可晶种子败育过程中 表达量逐渐升高在种子败育关键时期 高表达靶基因 表现为相反的表达趋势在种子败育关键期呈现低表达在有核品种魏可种子中 的表达量逐渐降低而 的相对表达量逐渐升高(图)在京可晶和魏可中 的表达量与 均呈负相关且两者的相对表达量变化呈相反趋势这说明 可能在假单性结实品种种胚败育过程中起到重要的调控作用 对靶基因的作用模式分析(图)表明在京可晶和魏可中 都呈显著负相关但相关性系数存在差异表南 京 农 业 大 学 学 报第 卷明 的 作 用 强 弱 存 在 一 定 的 差 异 京 可 晶 中 的 模 块 有(.)、(.)、(.)、(.)其中 存在最大的负相关性表明其可能是参与葡萄种胚败育调控的重要模块图 和 在葡萄种子/种子区的时空表达分析及 对靶基因 的作用模式 /.及其靶基因 在京可晶葡萄种子区的时空表达分析.及其靶基因 在魏可葡萄种子的时空表达分析.对靶基因的作用模式:京可晶:魏可.:.讨论大量研究表明 在转录后通过与 靶标碱基匹配调控靶基因的表达 许多植物 可能靶向转录因子通过裂解其靶标从而调节靶基因的表达在植物各个发育阶段发挥调控作用据报道 能够靶向和转录后调节 基因且 模块在不同物种中的作用是保守的众多研究表明 参与籽粒大小调控 等研究表明 可以调控 进而调控水稻粒长相关基因 提高水稻颗粒重从而提高水稻产量 另外 可以调控 并编码与水稻籽粒大小相关的新的 在小麦籽粒发育过程中 的表达呈逐渐下降趋势靶基因、和 呈上升趋势验证了 通过调节 的表达参与籽粒发育而在我们的研究中也得到类似结果有核品种魏可种子中 的表达量逐渐降低而 的相对表达量逐渐升高 在蓖麻中的研究同样也表明 可能参与调控籽粒发育过程 本研究结果表明 第 期张晓雯等:及其靶基因 在葡萄种子发育过程中的表达分析 可能通过介导 表达负调控魏可种子的发育另有研究者发现在拟南芥中过表达 导致植株叶片变窄花柱头弯曲和角果结实率降低表明 在拟南芥叶片及花果发育过程中起着重要调控作用 通过生长素合成和信号传导参与早期花序的形成进而影响水稻的产量 番茄 及其靶基因、及 主要参与调控番茄果实的生长发育并且影响细胞壁代谢植物激素、及乙烯相关基因的表达 这些研究表明 可以通过应答激素信号通路调控植物花果及种子的发育 本研究也有类似的发现 及其靶基因 的启动子均含有多个激素响应的作用元件表明它们可能通过响应激素信号调控葡萄生长发育 此外火龙果中 及靶基因 在应对逆境时均做出了不同程度的响应 在本研究中我们发现 及其靶基因 的启动子也含有低温响应元件 火龙果 的表达量与 均呈负相关表明 在非生物胁迫过程中通过负调控 表达本研究通过裂解验证试验也证明了 对靶基因的负调控作用尽管 在拟南芥、番茄、水稻等模式植物上的研究不断深入但对于其在葡萄假单性结实方面的研究尚未见报道 我们前期的研究鉴定了许多已知葡萄浆果发育过程中的特异 其中很多 参与果实发育和种子形成的调控过程 本研究结果显示:在京可晶种子败育过程中 的表达量逐渐升高且在花后 表达量最高靶基因 呈现相反表达模式相比在有核品种魏可种子发育中 呈现下降的趋势在花后 表达量最低靶基因呈现相反的表达模式表明 可能介导 负调控种子的发育进一步相关性分析表明在京可晶种子败育中 与 的相关性最高表明 对 具有最强的负调控作用可能通过负调控 介导葡萄种胚败育 这不仅丰富了葡萄假单性结实表观调控的理论内容也为深入探讨 及其靶基因调控葡萄种胚败育分子机制提供了重要的参考参考文献:张玲瑞.在植物逆境胁迫应答中的作用.激光生物学报():.():().曹慧颖王可高何瑞等.植物激素相关 研究进展.植物生理学报():.():().王丽丽李利超孙化雨等.毛竹 前体的克隆及其在叶形态建成中的功能分析.植物科学学报():.():().():.刘玲童王台.模块:水稻分子育种的新资源.植物学报():.:.():().杨凤玺.在烟草中的功能分析.西双版纳:中国科学院研究生院(西双版纳热带植物园).:().曹东艳.在番茄果实生长发育中的功能研究.北京:中国农业大学.:().():.():.马铭赛.基于一种高效的/技术初步研究拟南芥 的功能.喀什:喀什大学./.:().刘立立杨进威姜如云等.小麦 的特征及其在温度胁迫中的表达分析.山东农业科学():.南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 .():().():.韦燕红刘桢李珂等.苹果 家族鉴定及在不定根发育过程中的表达分析.园艺学报():.():().():.:.():.():.():.张彦苹王晨于华平等.适于葡萄不同组织 提取方法的筛选.西北农业学报():.():().():.():.():.():.:.:.():.邢海彦.蓖麻/调控模块的鉴定及 基因编辑的初探.哈尔滨:东北林业大学./(.).:().刘冬梅杨凤玺余迪求.高表达 小分子导致拟南芥花柱头弯曲.云南植物研究():.():().李阿利.火龙果 对非生物胁迫的应答.贵阳:贵州大学.().:().():./.():.():.():.王文然王晨解振强等.及其靶基因 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