基于网络药理学和分子对接探讨香砂六君子汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的作用机制.pdf

山 东 科 学 第 卷 第 期 年 月出版.:./.【药理与毒理】收稿日期:基金项目:国家自然科学基金()山东省自然科学基金()泰安市科研课题()山东第一医科大学科技创新计划()作者简介:尹志鹏()男硕士研究生研究方向为致癌致畸病原体感染及其检测:.通信作者赵英会()女博士教授研究方向为致癌致畸病原体感染及其检测:.基于网络药理学和分子对接探讨香砂六君子汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的作用机制尹志鹏高云云刘文文郭蓬勃赵英会(山东第一医科大学(山东省医学科学院)基础医学院山东 济南)摘要:利用网络药理学和分子对接方法分析香砂六君子汤的有效活性成分及其治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的分子机制通过中药系统药理学数据库与分析平台、数据库和 数据库筛选香砂六君子汤的药物活性化合物、药物作用靶点基因及幽门螺杆菌相关性胃炎疾病相关靶点并对药物作用靶点和疾病相关靶点进行维恩分析应用 软件以及 数据库分别构建药物化合物潜在靶点相互作用网络及蛋白质蛋白质相互作用网络图 使用 数据库对交集靶点进行基因本体功能和京都基因与基因组百科全书通路富集分析 通过 等软件对关键成分和作用靶点进行分子对接 通过吉姆萨染色法和 法测定细胞凋亡率 检测相关靶蛋白表达 最终筛选出香砂六君子汤方中槲皮素、木犀草素和山柰酚等 种药物活性化合物可能通过作用于、等 个潜在靶点以及 样受体信号通路、信号通路、细胞受体信号通路等 条通路参与螺杆菌相关性胃炎的治疗 分子对接显示药物活性成分槲皮素、谷甾醇、木犀草素与靶点蛋白、有较好的亲和力 与模型组比较用香砂六君子汤处理后 细胞的细胞核深染加深细胞凋亡率显著下降 蛋白表达也显著降低 研究认为香砂六君子汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎以多成分、多靶点、多途径发挥其抑菌、抗炎的作用关键词:香砂六君子汤幽门螺杆菌相关性胃炎网络药理学分子对接作用机制中图分类号:文献标志码:文章编号:()开放科学(资源服务)标志码():()第 期尹志鹏等:基于网络药理学和分子对接探讨香砂六君子汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的作用机制 .幽门螺杆菌(.)是胃黏膜感染最常见的革兰氏阴性杆菌其主要的致病机制是产生多种毒力因子使宿主细胞内信号通路失调从而引起胃炎.阳性的胃炎称为幽门螺杆菌相关性胃炎(.相关性胃炎)京都全球共识报告首次明确提出.相关性胃炎是一种传染病无论患者是否有症状都需要治疗 目前经典的.相关性胃炎治疗多采用三联或四联的综合西医疗法但是随着抗生素耐药性的提升、重复感染和胃肠道副作用等问题三联疗法和四联疗法的疗效也不理想 而中医药在抑制与灭杀.方面具有耐药性低、副作用小等优势因此中医治疗.相关性胃炎成为该领域关注的热点香砂六君子汤由党参、白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏、砂仁、木香八味药组成 党参可健脾补气、白术可健脾去湿、茯苓可健脾养心、甘草可清热解毒、陈皮可健脾顺气、半夏可燥湿化痰、砂仁可化湿醒脾、木香可健脾消食 研究表明香沙六君子汤通过影响.相关性胃炎大鼠胃黏膜组织中、和 的蛋白表达量和血清中 和 的水平从而对大鼠临床症状及胃黏膜病理改变有所改善 然而对于香砂六君子汤在.相关性胃炎治疗中的药物成分和作用机制尚不明确网络药理学是一门基于人工智能和大数据时代药物系统性的新学科从系统角度和分子水平发现中药的网络靶点、多成分疗法从而进一步阐述中药的作用机制 因此本研究借助网络药理学和分子对接技术分析香砂六君子汤治疗.相关性胃炎的有效活性成分及作用机制为临床治疗.相关性胃炎提供理论依据 仪器与材料.细胞株与菌株人胃黏膜上皮细胞()购于中国北纳创联生物公司.国际标准菌株 由山东大学基础医学院病原生物学系孙允东教授惠赠.药物及主要试剂香砂六君子汤(丸)(仲景宛西制药股份有限公司批号)培养基(美国 公司山 东 科 学 年批号)胎牛血清(武汉普赛诺公司批号)吉姆萨染液(北京索莱宝科技公司批号)多聚甲醛(武汉赛维尔生物科技公司批号)试剂盒(北京索莱宝科技公司批号)(美国 公司批号)一抗(武汉三鹰技术有限公司批号)二抗 标记羊抗兔抗体(武汉三鹰技术有限公司批号)一抗 单克隆抗体(美国 公司批号)单克隆抗体(美国 公司批号)超敏发光液(上海雅酶生物科技有限公司批号).主要仪器电泳仪、电泳槽、电转槽、化学发光成像系统(美国 公司)荧光倒置显微镜(尼康株式全社)可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)二氧化碳孵育箱(益世科(江苏)生物科技有限公司)方法.获取香砂六君子汤活性成分及其靶点利用中药系统药理学数据库与分析平台()检索香砂六君子汤各成分(党参、白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏、木香、砂仁)的活性化合物 以药物口服生物利用度()化合物类药性().为标准筛选检索到的活性成分 在 数据库查询药物活性化合物所对应的蛋白靶点 再利用(:/./)数据库查找药物作用蛋白靶点对应的基因靶点.筛选香砂六君子汤治疗.相关性胃炎潜在靶点以“”为关键词在 数据库(:/./)查找.相关性胃炎疾病相关靶点 并与香砂六君子汤的活性成分靶点进行匹配获取交集靶点即香砂六君子汤治疗.相关性胃炎的潜在作用靶点 利用 .(:/./)软件绘制药物与疾病的交叉基因维恩图.构建药物活性成分潜在靶点网络通过 .软件构建药物活性成分潜在靶点网络并进行网络拓扑分析获得香砂六君子汤治疗.相关性胃炎的关键药物活性成分.构建蛋白质蛋白质相互作用网络将交集靶点导入(:/./)数据库中进行蛋白质蛋白质相互作用()分析并将文件以“”格式保存 运用.软件进行 网络构建.基因富集分析将交集靶点导入 数据库(:/./)进行基因本体()功能和京都基因与基因组百科全书()通路富集分析并运用微生信(:/.)对富集程度前 的 富集条目以及前 的 富集通路进行数据可视化处理.构建潜在靶点 网络通过 .软件对药物潜在靶点、功能分析中的生物过程()、分子功能()、细胞组成()进行富集分析以及 富集分析构建潜在靶点 网络.分子对接验证将 图中排名前 的靶基因和药物成分进行分子对接从 数据库(:/./)中下载蛋白结构应用 软件对靶点蛋白进行加氢、去水处理后进行分子对接将对接结果导入到 软件中进行可视化分析第 期尹志鹏等:基于网络药理学和分子对接探讨香砂六君子汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的作用机制.细胞培养、造模及分组给药将 胃黏膜细胞按 万个接种于 孔板中用 完全培养基(胎牛血清()进行培养并分为对照组、模型组和香砂六君子汤低、中和高质量浓度(、/)给药组香砂六君子汤给药组使用相应的药物浓度预先处理细胞置于 、培养箱中过夜至细胞融合率达 收集.用完全培养基 重悬后按感染复数 加入细胞中香砂六君子汤继续给药处理继续培养 中间换液 对照组不与.共培养对照组和模型组不加药.检测细胞活性在 孔板中细胞接种、培养箱中过夜然后向每孔加入 试剂放置 培养箱中孵育 后用酶标仪测定 处的吸光值.吉姆萨染色将 孔板中各组细胞处理 之后弃原培养基无菌(磷酸缓冲盐溶液)缓冲液洗涤细胞 次每孔加入 多聚甲醛室温固定细胞 然后弃去 多聚甲醛室温静置使其充分挥发 用无菌 缓冲液按适当比例稀释吉姆萨原液将稀释好的吉姆萨染液加到 孔板中室温静置 后用缓慢的流水将染液洗掉显微镜下观察细胞形态.蛋白印迹检测靶蛋白表达首先制备蛋白裂解液提取细胞蛋白 通过 法()将每组蛋白定量然后将蛋白用 、混匀在 的水浴锅中煮 将等量的蛋白质在 的 聚丙烯酰胺凝胶上电泳并电转到 膜(聚偏二氟乙烯膜)上 用的奶粉封闭液封闭 之后加入相应的一抗 孵育过夜次日 洗膜 次加入二抗孵育 洗膜 次 膜加 化学发光显影后保存照片并用 进行灰度值分析.统计学分析数据采用 .统计软件进行分析实验结果用平均值标准偏离()显示通过 检验可以进行二组之间的对比在多组组之间进行单因方差分析.认为差异存在统计价值 结果.香砂六君子汤活性化合物及药物作用靶点的筛选通过 数据库对党参、白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏、砂仁、木香的药物活性化合物按照 和.的检索条件进行检索共得到 种药物活性化合物 删除无效值和重复值后最终获得 种药物活性化合物党参、白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏、木香、砂仁的主要有效活性成分见 科学数据与内容附表 其中有 种为多药物共有成分(表)运用 数据库查询 种药物活性化合物所对应的药物作用靶点蛋白共获得 个合并重复后共保留 个药物作用靶点蛋白表 药物共有活性成分 药物 共有活性成分党参、半夏、砂仁、木香豆甾醇()党参、甘草甲氧基甲基异黄酮()半夏、砂仁乙基胆甾烯酮()半夏、砂仁谷甾醇()陈皮、甘草、木香谷甾醇()陈皮、甘草柚皮素()甘草、木香丁子香萜()山 东 科 学 年.香砂六君子汤治疗.相关性胃炎潜在靶点的筛选从 数据库中检索共获得.相关性胃炎相关靶点 个 将.相关性胃炎相关疾病靶点与香砂六君子汤的活性成分作用靶点应用 软件进行分析最终获得 个交集靶点作为香砂六君子汤治疗.相关性胃炎的潜在靶点(科学数据与内容附图).活性成分潜在靶点网络图将.中 种药物活性化合物所对应的药物作用靶点与 个交集靶点进行比对筛选删除无对应靶点的药物活性化合物 个将最终剩余的 个药物活性化合物与 个潜在靶点的数据集导入.软件建立药物化合物潜在靶点网络图(科学数据与内容附图).蛋白质互作网络图将交集靶点导入 数据库进行 分析得到 个节点、条边的 网络(科学数据与内容附图)网络图中 值 的节点共有 个由大到小分别为转录激活因子()、肿瘤抑制因子()、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶()、肿瘤坏死因子()、二聚化蛋白()、丝裂原活化蛋白激酶()、丝裂原活化蛋白激酶()、白细胞介素()、丝裂原活化蛋白激酶()、丝裂原活化蛋白激酶().和 通路富集分析使用 数据库进行 和 通路富集分析 功能富集分析后得到 个、个、个 根据.选取、和 排名前 的富集条目(科学数据与内容附图)通路富集分析获取 条通路结果显示香砂六君子汤治疗.相关性胃炎的关键通路主要涉及癌症相关通路、样受体信号通路、信号通路、细胞受体信号通路、样受体信号通路、信号通路等(科学数据与内容附图).潜在靶点 网络图的构建通过 .软件对药物潜在靶点、功能分析中的、富集分析以及 富集分析构建潜在靶点 网络(附科学数据与内容图)结果显示香砂六君子汤药效靶点主要位于细胞外隙物质和胞质并通过蛋白质融合等多重结合方法参与了药物反应、细胞凋亡过程负调节、缺乏配体的细胞外源性凋亡信息通路等在内的生物学过程.分子对接分析 网络中排名前 的靶点、与香砂六君子汤有效活性成分槲皮素、谷甾醇、木犀草素进行分子对接(表)结合自由能越低表示活性化合物与靶蛋白的结合能力越好 图 以 图的形式展示了靶点、和 分别与有效活性成分槲皮素、谷甾醇、木犀草素的结合表 分子对接结果 核心靶点有效活性成分结合自由能/()槲皮素().谷甾醇().木犀草素().槲皮素().谷甾醇().木犀草素().槲皮素().谷甾醇().木犀草素().第 期尹志鹏等:基于网络药理学和分子对接探讨香砂六君子汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的作用机制图 核心靶点与有效活性成分的对接图.吉姆萨染色验证香砂六君子汤对.的体外抑制作用如图 所示吉姆萨染色结果显示与对照组相比模型组的细胞数量明显减少而与模型组(.)相比香砂六君子汤给药组中的细胞数量有所增加细胞形态趋于正常图 香砂六君子汤处理对.感染的细胞凋亡的影响.香砂六君子汤对.感染 细胞凋亡的影响如图 所示与对照组相比 和 后模型组 细胞细胞活力明显下降与模型组(.)相比香砂六君子汤(/).组细胞活力在给药 和 后没有差异与模型组相比香砂六君子汤(/).组在给药 后细胞活力没有差异在给药 后细胞活力有明显差异而与模型组相比香砂六君子汤(/).组在给药 和 后细胞活力都有明显差异注:.与对照组相比.与模型组(.)相比图 试验检测香砂六君子汤对细胞活力影响.山 东 科 学 年.香砂六君子汤处理对.感染 细胞中靶点蛋白表达的影响如图 所示与对照组相比模型组 蛋白表达明显升高与模型组比较香砂六君子汤低、中和高质量浓度(、/)给药组的 蛋白表达都有明显的降低注:.与对照组相比.与模型组(.)相比图 检测不同药物质量浓度的香砂六君子汤处理对.感染 细胞中 靶蛋白表达的影响.讨论本研究运用网络药理学的方法分析了香砂六君子汤治疗.相关性胃炎的有效成分 种及 个药物靶点其中山柰酚和氨苄西林联用时能够显著降低氨苄西林的最小抑菌浓度增强氨苄西林的抗菌活性有较好的体外抗.的作用 槲皮素可以通过影响、和 水平来改善.感染引起的胃炎症和凋亡 木犀草素具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗癌和降尿酸的作用 杨晓晔等研究发现木犀草素可以通过/信号通路来抑制胃癌细胞的增殖和凋亡 川陈皮素除了有抗癌、抗真菌、抗炎、抗癫痫作用还具有抗血细胞凝集、抗血栓形成的作用 已有研究证明川陈皮素通过降低.感染 细胞中 的水平从而增加细胞活力对香砂六君子汤作用靶点和.相关性胃炎疾病相关靶点取交集得到潜在靶点 个 网络核心靶点分析显示香砂六君子汤可能通过、等靶点蛋白起作用 分子对接的结果显示该药的有效活性成分与.相关性胃炎的疾病靶点有很好的结合其中、与香砂六君子汤有效活性成分槲皮素、谷甾醇、木犀草素均有结合 信号转导和转录激活因子()是一种高度通用的信号蛋白和转录因子在胃黏膜上皮转化中发挥重要的作用激活的 与.相关性胃炎和人类癌症进展有关.感染通过 积累诱导了 的激活 是一种抑癌蛋白在.感染诱发胃癌发病机制中具有重要功能 即为蛋白激酶()的同源异构体/信号通路主要由、及下游相关分子组成/信号通路在调控细胞增殖与细胞生长代谢方面发挥重要作用.通过/信号通路介导/的活性来调控细胞凋亡 肿瘤坏死因子()家族指一组可以引起细胞死亡(凋亡)的细胞因子 水平的升高可能在.感染的消化性溃疡的发病机制中发挥关键作用研究发现感染.的个体中 等促炎细胞因子的表达或血清水平明显高于未感染的个体 是一种原癌基因有研究发现.感染后可能诱导 基因的激活从而诱导相关炎症的发生 丝裂原活化蛋白激酶第 期尹志鹏等:基于网络药理学和分子对接探讨香砂六君子汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的作用机制()级联激活是多种信号通路的中心 信号级联会导致基因表达的改变 细胞因子如白细胞介素()、白细胞介素()和 被认为在.感染相关的炎症和增殖反应中发挥激活丝裂原活化蛋白激酶()作用 已有研究证实.感染的胃组织中 活化的水平高于正常胃组织 大量的研究已经证实、等靶点蛋白与.感染密切相关表明本研究对香砂六君子汤对治疗.相关性胃炎分子网络调控机制的预测具有一定准确性为了进一步验证香砂六君子汤对治疗.相关性胃炎的有效性本研究还进行了体外细胞实验首先通过吉姆萨染色和 活性检测验证了在香砂六君子汤处理后 细胞受.感染的凋亡情况明显改善 接着使用 对 靶点蛋白进行检测结果显示.感染可以激活 细胞中 蛋白的表达 之后观察不同质量浓度的香砂六君子汤处理.感染的 细胞中 蛋白的表达 结果表明与.模型组相比香砂六君子汤给药组明显降低.感染 细胞中 蛋白的表达水平 研究结果表明香砂六君子汤能有效改善胃黏膜上皮细胞受.诱导的凋亡影响其作用机制可能与降低 蛋白的磷酸化有关综上所述本研究通过网络药理学方法和部分体外细胞实验对中药香砂六君子汤治疗.相关性胃炎进行了系统分析与验证为香砂六君子汤治疗.相关性胃炎的临床应用提供参考依据参考文献:.():.:./.:.():.:./.():.:./.:.():.:./.:.侯美彤 焦文渊 于智玥 等.门九章应用香砂六君子汤验案浅析.湖北中医杂志 ():.巩子汉 成映霞 付晓艳 等.香砂六君子汤化裁治疗萎缩性胃炎及验案举隅.西部中医药 ():.林志强王大璇洪珊珊等.香砂六君子汤对菌致慢性萎缩性胃炎 信号通路的影响.():.:./.世界中医药学会联合会.网络药理学评价方法指南.世界中医药 ():.:./.王子怡 王鑫 张岱岩 等.中医药网络药理学:指南引领下的新时代发展.中国中药杂志 ():.:./.:.():.:./().胡亚洁 赵晓锦 宋咏梅 等.基于网络药理学的中药复方研究探讨.时珍国医国药 ():.肖兰青 熊小虎.半枝莲中的黄酮抗幽门螺杆菌作用研究.第三军医大学学报 ():.:./.()():.:./.山 东 科 学 年 .:.():.:./.杨晓晔 豆发福 李恒.木犀草素基于/信号通路对 胃癌细胞的作用.中国现代普通外科进展():.:./.杨雪竹 张浩 崔西玉 等.川陈皮素抑制胃癌 细胞侵袭能力的机制探讨.现代肿瘤医学 ():.:./.:():.:.():.:./.:.():.:./.():.:./.江明礼 莫非 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