基于高效液相色谱指纹图谱及化学计量学的半枝莲质量分析.pdf

h t t p:/X B Y Z.c b p t.c n k i.n e t基于高效液相色谱指纹图谱及化学计量学的半枝莲质量分析窦锦明1,常跃兴2,荆汉卫3*,张天欣4,王振华1*1.潍坊市中医院药学部,潍坊 2 6 1 0 4 1;2.安徽理工大学医学院,淮南 2 3 2 0 6 3;3.潍坊市检验检测中心,潍坊 2 6 1 0 6 1;4.山东中医药大学,济南 2 5 0 3 5 5摘要:目的 建立半枝莲高效液相色谱(h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y,H P L C)指纹图谱联用化学计量学的质量分析方法。方法 用I n e r t S u s t a i n C1 8(2 5 0 mm4.6 mm,5 m),乙腈-1 m LL-1磷酸溶液梯度洗脱,梯度流速,进样量为1 0 L,波长为3 3 5 n m,柱温为3 0,用相似度评价法、聚类分析、主成分分析(p r i n c i p l e c o m p o n e n t a n a l y s i s,P C A)和偏最小二乘法判别分析(p a r t i a l l e a s t s q u a r e s d i s c r i m i n a n t a n a l y s i s,P L S-D A)评价。结果 1 2批样品相似度均大于0.9 0;聚类分析河南为一类,云南为一类,广东、广西为一类;P C A分类结果与聚类分析结果一致,差异大的色谱峰有1 0个;P L S-D A分类结果与聚类分析结果一致,差异大的色谱峰有1 4个;筛选半枝莲潜在质量标志物的色谱峰有7个,为1 0、1 1(木犀草苷)、1 2(野黄芩苷)、1 4、1 6、1 8、1 9号峰。结论 建立了半枝莲高效液相色谱指纹图谱联用化学计量学的质量分析方法,为半枝莲质量标准研究提供依据。关键词:半枝莲;相似度评价法;聚类分析法;主成分分析法;偏最小二乘法判别分析D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 4-2 4 0 7.2 0 2 3.0 5.0 0 4中图分类号:R 2 8 4.1 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 4-2 4 0 7(2 0 2 3)0 5-0 0 2 0-0 5Q u a l i t y a n a l y s i s o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n b a s e d o n H P L C f i n g e r p r i n t s a n d c h e m o m e t r i c sD OU J i n m i n g1,CHANG Y u e x i n g2,J I N G H a n w e i3*,Z HAN G T i a n x i n4,WAN G Z h e n h u a1*1.D e p a r t m e n t o f P h a r m a c y,W e i f a n g H o s p i t a l o f T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e,W e i f a n g 2 6 1 0 4 1,C h i n a;2.S c h o o l o f M e d i c i n e,A n h u i U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y,H u a i n a n 2 3 2 0 6 3,C h i n a;3.W e i f a n g I n s p e c t i o n a n d T e s t i n g C e n t e r,W e i f a n g 2 6 1 0 6 1,C h i n a;4.S h a n d o n g U n i v e r s i t y o f T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e,J i n a n 2 5 0 3 5 5,C h i n aA b s t r a c t:OO bb jj ee cc tt ii vv ee T o e s t a b l i s h a q u a l i t y c o n t r o l m e t h o d o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n b y h i p h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a-p h y(H P L C)f i n g e r p r i n t s c o m b i n e d w i t h c h e m o m e t r i c s.MM ee tt hh oo dd ss A n I n e r t S u s t a i n C1 8 c o l u m n(2 5 0 mm4.6 mm,5 m)w a s u s e d w i t h a c e t o n i t r i l e 1 m LL-1 p h o s p h o r i c a c i d s o l u t i o n a s t h e m o b i l e p h a s e f o r g r a d i e n t e l u t i o n.T h e i n j e c t i o n v o l u m e w a s 1 0 L,t h e d e t e c t i o n w a v e l e n g t h w a s 3 3 5 n m,a n d t h e c o l u m n t e m p e r a t u r e w a s 3 0.T h e s i m i l a r i t y,c l u s t e r a n a l y s i s,p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s(P C A)a n d p a r t i a l l e a s t s q u a r e s d i s c r i m i n a n t a n a l y s i s(P L S-D A)w e r e u s e d f o r e v a l u a t i o n.RR ee ss uu ll tt ss T h e s i m i-l a r i t y o f 1 2 b a t c h e s o f s a m p l e s w a s h i g h e r t h a n 0.9 0.T h e s a m p l e s w e r e d i v i d e d i n t o H e n a n,Y u n n a n,G u a n g d o n g a n d G u a n g x i h a b i t a t s b y c l u s t e r a n a l y s i s,s i m i l a r t o t h e r e s u l t s o f P C A c l a s s i f i c a t i o n w i t h 1 0 d i f f e r e n t c h r o m a t o g r a p h i c p e a k s,a n d a l s o s i m i l a r t o t h e r e s u l t s o f P L S-D A c l a s s i f i c a t i o n w i t h 1 4 d i f f e r e n t c h r o m a t o g r a p h i c p e a k s.S e v e n c h r o m a t o g r a p h i c p e a k s,i.e.1 0,1 1(l u t e-o l i n),1 2(b a i c a l i n),1 4,1 6,1 8 a n d 1 9 w e r e s c r e e n e d a s t h e q u a l i t y m a r k e r s o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n.CC oo nn cc ll uu ss ii oo nn T h e q u a l i t y c o n t r o l m e t h o d o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n f i n g e r p r i n t s c o m b i n e d w i t h c h e m o m e t r i c s w a s e s t a b l i s h e d,w h i c h p r o v i d e s a b a s i s f o r t h e s t u d y o f q u a l i t y s t a n d a r d o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n.K e y w o r d s:S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n;s i m i l a r i t y e v a l u a t i o n m e t h o d;c l u s t e r a n a l y s i s;p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s;p a r t i a l l e a s t s q u a r e s d i s c r i m i n a n t a n a l y s i s基金项目:山东省中医药科技项目(编号:2 0 2 1 M 0 9 4);潍坊市中医药科研项目(编号:WF Z Y Y 2 0 2 2-3-0 0 1)作者简介:窦锦明,男,主管中药师*共同通信作者:荆汉卫,男,主任中药师;王振华,女,主任药师 半枝莲为唇形科植物半枝莲S c u t e l l a r i a b a r b a-t a D.D o n的干燥全草,味辛、苦,性寒,归肺、肝、肾经,具有清热解毒、化瘀利尿的功效。用于疔疮肿毒、咽喉肿痛、跌扑伤痛、水肿、黄疸和蛇虫咬伤的治疗。现代药理研究结果表明,其具有解热、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、利尿、抑菌及抗病毒等作用,常用于治疗疔疮、肺痈、急性肾炎和癌症1-2。目前,大多数学者对半枝莲所含的化学成分已达成共识,其主要含有黄酮类、二萜类、生物碱、香豆素、多糖和甾醇等成分3-4,但半枝莲质量评价的方法不尽相同。有学者以黄酮、总黄酮含量评价半枝莲质量5-6,有学者以萜类评价半枝莲质量7-8,均无法全面反映半枝莲所含的化学成分。本文收集不同产地的1 2批半枝莲,用高效液相色谱(h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y,H P L C)指纹图谱9-1 1结合化学计量学1 2技术建立半枝莲的质量控制方法,旨在02西北药学杂志 2 0 2 3年9月 第3 8卷 第5期h t t p:/X B Y Z.c b p t.c n k i.n e t为半枝莲的质量控制提供参考。1 仪器与试药1.1 仪器L C-2 0 AT(S P D-M 2 0 A检测器)高 效液 相 色 谱仪、AUW 1 2 0 D型分析天平均购自岛津制作所;KQ-2 5 0型超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)。1.2 试药木犀草苷(批号1 1 1 7 2 0-2 0 2 1 1 1)、野黄芩苷(批号1 1 0 8 4 2-2 0 2 0 1 0)、芹菜素(批号1 1 1 9 0 1-2 0 2 0 0 4),木犀草素(批号1 1 1 5 2 0-2 0 2 1 0 7)、半枝莲对照药 材(批号1 2 1 2 9 3-2 0 2 1 0 5),均购自中国食品药品检定研究院;1 2批S 1(对照药材)、S 2(广西玉林)、S 3(广西南宁)、S 4(广西柳州)、S 5(广东梅州)、S 6(广东清远)、S 7(广东揭阳)、S 8(云南昆明)、S 9(云南普洱)、S 1 0(云南大理)、S 1 1(河南驻马店)、S 1 2(河南平顶山)、S 1 3(河南南阳)半枝莲经潍坊市检验检测中心荆汉卫主任中药师鉴定为唇形科半枝莲S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n的干燥地上部分。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱为I n e r t S u s t a i n C1 8(2 5 0 mm4.6 mm,5 m)。乙腈(A)-1 m LL-1磷酸溶液(B)梯度洗脱(0 1 5 m i n,1 5%1 8%A;1 53 0 m i n,1 8%A;3 04 5 m i n,1 8%2 5%A;4 56 0 m i n,2 8%3 8%A;6 06 5 m i n,3 8%9 0%A;6 57 0 m i n,9 0%A。梯度流速01 5 m i n,1.0 m Lm i n-1;1 53 0 m i n,0.8 m Lm i n-1;3 07 0 m i n,1.0 m Lm i n-1。进样量为1 0 L,检测波长为3 3 5 n m,柱温为3 0。2.2 溶液的配制2.2.1 对照品溶液 分别精密称取木犀草苷、野黄芩苷、木犀草素、芹菜素对照品适量,置于1 0 m L量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,得对照品溶液。2.2.2 供试品溶液 精密称取1 2批半枝莲样品粉末(过3号筛)约1.0 g,置于具塞三角瓶中,加体积分数5 0%甲醇5 0 m L,称定质量,超声处理4 0 m i n,放冷,再称定质量,用体积分数为5 0%的甲醇补足减失的质量,摇匀,经0.2 2 m微孔滤膜滤过,取续滤液,得供试品溶液。2.2.3 对照药材溶液 精密称取半枝莲对照药材粉末(过3号筛)约1.0 g,按照2.2.2项下方法制备。2.3 方法学考察2.3.1 精密度实验 取2.2.3项下制备的对照药材溶液,按照2.1项下的色谱条件进样6次,得共有峰的相对保 留时间和相 对峰面积 的R S D值 均 小 于1.0%,表明仪器的精密度良好。2.3.2 稳定性实验 取对照药材溶液,按照2.1项下色谱条件于0、2、4、8、1 2、2 4 h进样,得共有峰的相对保留时间和相对峰面积的R S D值均小于1.0%,表明供试品溶液在2 4 h内稳定性良好。2.3.3 重复性实验 取6份对照药材粉末,按照2.2.2项下的方法制备,按照2.1项下色谱条件进样,得共有峰的相对保留时间和相对峰面积的R S D值均小于1.0%,表明该方法的重复性良好。2.4 H P L C指纹图谱的建立取1 2个批次半枝莲供试品溶液,按照2.1项下的色谱条件测定。将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2 0 1 2年版”分析,以S 1对照药材的色谱图为参照图谱,生成半枝莲H P L C指纹图谱,见图1。1 2批半枝莲样品的相似度为0.9 9 40.9 7 2,表明不同产地半枝莲化学成分的种类相似。标定共有色谱峰3 0个,与对照品色谱图(保留时间)、紫外吸收光谱(特征吸收峰)比对,确认4个色谱峰,1 1号峰为木犀草苷,1 2号峰为野黄芩苷(参照峰),2 3号峰为木犀草素,2 8号峰为芹菜素。半枝莲H P L C指纹图谱共有峰的保留时间差别较小,但峰面积差异较大,表明不同产地半枝莲化学成分的种类相近,但含量有差异。2.5 化学计量学分析2.5.1 聚类分析(c l u s t e r a n a l y s i s,C A)将半枝莲各批次共有峰面积Z-S c o r e标准化,导入M e t a b o A n-a l y s t 5.0软件进行K-m e a n s聚类分析1 3和W a r d聚类分析1 4(组间连接,欧式平方距离),见图2、图3。由图2、图3可知,河南为一类,云南为一类,广东、广西为一类,表明各产地半枝莲的化学成分含量有显著差异。2.5.2 主成分分析(p r i n c i p l e c o m p o n e n t a n a l y s i s,P C A)将半枝莲各批次共有峰面积Z-S c o r e标准化,导入S P S S 2 6和M e t a b o A n a l y s t 5.0软件进行P C A分析1 5,得到3个主成分(特征值1),其方差贡献率为P C 1(4 2.7 0%)、P C 2(2 7.0 0%)、P C 3(1 2.3 0%),累积方差贡献率为8 2.0 0%,表明3个主成分代表原始色谱峰的大部分信息。P C A得分见图4。由图4可知,河南为一类,云南为一类,广东、广西为一类,与聚类分析结果一致,表明各产地半枝莲的化学成分含量有显著差异。将3个主成分矩阵结果(得分 0.8 0 0)求并集后,显示有差异的色谱峰为1、1 0、1 2、1 4、1 5、1 6、1 8、1 9、1 1、2 2号峰。见图5。2.5.3 偏最小二乘法判别分析(p a r t i a l l e a s t s q u a r e s d i s c r i m i n a n t a n a l y s i s,P L S-D A)将半枝莲各批次共有峰面积Z-S c o r e标准化,导入M e t a b o A n a l y s t 5.0软件进行P L S-D A分析1 6,置换检验法(1 0 0 0次)显示P=12西北药学杂志 2 0 2 3年9月 第3 8卷 第5期h t t p:/X B Y Z.c b p t.c n k i.n e t0.0 1 7,L O O C V交叉验证显示累积R2=0.9 7 1 5,Q2=0.6 3 9 6 5,A c c u r a c y=0.9 1 6 6 7,表明可靠度高。P L S-D A得分图见图6。由图6可知,河南为一类,云南为一类,广东、广西为一类,与聚类分析结果一致,表明各产地半枝莲的化学成分含量有显著差异。将3个C o m p o n e n t s V I P得分结果(V I P 值1.0)求并集后,结果显示有差异的色谱峰为1、2、3、6、8、1 0、1 1、1 2、1 3、1 4、1 6、1 8、1 9、2 8号峰。见图7。注:紫外吸收光谱图:波长1 9 04 0 0 n m;黑线为对照药材光谱;红线为对照品光谱。图1 半枝莲高效液相色谱指纹图谱F i g.1 H P L C f i n g e r p r i n t s o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n图2 不同产地半枝莲K-m e a n s聚类分析F i g.2 K-m e a n s c l u s t e r a n a l y s i s o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n f r o m d i f f e r e n t h a b i t a t s图3 不同产地半枝莲W a r d聚类分析热图F i g.3 W a r d c l u s t e r i n g a n a l y s i s h e a t m a p o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n f r o m d i f f e r e n t h a b i t a t s22西北药学杂志 2 0 2 3年9月 第3 8卷 第5期h t t p:/X B Y Z.c b p t.c n k i.n e t图4 不同产地半枝莲主成分分析得分图F i g.4 S c o r e c h a r t o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i s o f S c u t e l-l a r i a b a r b a t a D.D o n f r o m d i f f e r e n t h a b i t a t s 图5 不同产地半枝莲主成分分析的成分矩阵得分图F i g.5 S c o r e c h a r t o f c o m p o n e n t m a t r i x o f p r i n c i p a l c o m p o n e n t a-n a l y s i s o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n f r o m d i f f e r e n t h a b i t a t s图6 不同产地半枝莲偏最小二乘法判别分析得分图F i g.6 T h e p a r t i a l l e a s t s q u a r e s d i s c r i m i n a n t a n a l y s i s s c o r e s o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n f r o m d i f f e r e n t h a b i t a t s图7 不同产地半枝莲偏最小二乘法判别分析V I P得分图F i g.7 T h e p a r t i a l l e a s t s q u a r e s d i s c r i m i n a n t a n a l y s i s V I P s c o r e s o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n f r o m d i f f e r e n t h a b i t a t s2.5.4 质量标志物鉴别 对P C A的成分矩阵和P L S-D A的V I P值分析结果取交集,获得差异化学成分为1、1 0、1 1、1 2、1 4、1 6、1 8、1 9号峰。半枝莲的可能药效部位为黄酮类成分,1 0、1 1、1 2、1 4、1 6、1 8、1 9号峰均在2 5 02 8 0 n m和3 1 03 5 0 n m范围内有强吸收,符合黄酮类成分的特征紫外吸收带。各色谱峰标准化峰面积箱线图见图8。结果显示不同产地化学成分含量有显著性差异,因此,确定1 0、1 1(木犀草苷)、1 2(野黄芩苷)、1 4、1 6、1 8、1 9号峰为潜在质量标志物1 7。河南、广西、云南产地各质量标志物含量波动小于广东产地,表明河南、广西、云南产地半枝莲质量稳定性高于广东。河南产地各质量标志物含量高于广东、广西、云南,表明河南产地半枝莲质量优于广东、广西、云南。3 讨论考察提取溶剂(水,体积分数2 5%、5 0%、7 5%、1 0 0%甲醇)和提取时间(2 0、4 0、6 0 m i n)发现,体积分数5 0%甲醇超声4 0 m i n提取的色谱峰信息量丰富。考察色谱系统(甲醇-水、甲醇-1 m LL-1磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-1 m LL-1磷酸溶液)显示,乙腈-1 m LL-1磷酸溶液分离效果最佳。用P D A检测器对各色谱峰在1 9 04 0 0 n m波长范围内扫描,显示3 3 5 n m处色谱峰基线平稳,色谱峰信息量丰富。本研究建立了半枝莲H P L C指纹图谱联合化学计量学的质量分析方法,结果显示,不同产地半枝莲指纹图谱相似度均大于0.9 0 0,相对峰面积有差异,表明不同产地半枝莲所含的化学成分种类一致性高,但化学成分含量有差异。K-m e a n s和W a r d聚类分析、P C A和P L S-D A均显示不同产地半枝莲分3类。质量标志物鉴别显示各产地半枝莲化学成分的含量有差异,能分辨各产地半枝莲质量的优劣和稳定性,可作为半枝莲质量标志物的考察指标。分析原因,32西北药学杂志 2 0 2 3年9月 第3 8卷 第5期h t t p:/X B Y Z.c b p t.c n k i.n e t注:纵坐标为峰面积标准化值;横坐标为产地信息。A.1 0号峰(保留时间1 9.6 3 5 m i n);B.1 1号峰(保留时间2 0.8 8 9 m i n);C.1 2号峰(保留时间2 2.0 6 7 m i n);D.1 4号峰(保留时间2 5.2 6 5 m i n);E.1 6号峰(保留时间3 0.9 0 1 m i n);F.1 8号峰(保留时间3 9.9 3 7 m i n);G.1 9号峰(保留时间4 0.7 6 9 m i n)。图8 半枝莲潜在质量标志物的标准化峰面积箱线图F i g.8 T h e b o x p l o t o f n o r m a l i z e d p e a k a r e a o f p o t e n t i a l q u a l i t y m a r k e r s o f S c u t e l l a r i a b a r b a t a D.D o n可能与不同产区的气候、纬度、海拔、土壤和药材采收原则等有关1 8-2 0,有待进一步研究。半枝莲H P L C指纹图谱加化学计量学的质量评价方法能全面反映不同产地半枝莲的化学成分信息,为半枝莲饮片的质量标准研究和含半枝莲的中成药质量标准研究提供依据。参考文献:1 金顺琪,张露蓉.半枝莲药理效应及临床应用研究进展J.辽宁中医药大学学报,2 0 2 1,2 3(8):1 9 4-1 9 8.2 刘新杨,商亚珍.半枝莲提取黄酮类化合物药理学研究进展J.承德医学院学报,2 0 2 1,3 8(5):4 2 1-4 2 6.3 严威.半枝莲的化学成分及生物活性研究D.昆明:昆明理工大学,2 0 2 0.4 汪茂林.半枝莲化学成分及其抗肿瘤作用机制初 探D.南京:南京中医药大学,2 0 2 0.5 王斌,林钦贤,梁伟龙,等.灰色关联度分析法评价半枝莲药材质量J.中医药信息,2 0 2 1,3 7(5):6-1 0.6 夏云岭,张振凌,张洪坤,等.H P L C法同时测定半枝莲饮片中4种黄酮类成分的含量及主成分分析J.中国药房,2 0 1 9,3 0(2 0):2 8 3 9-2 8 4 4.7 宋彤昕.中药半枝莲化学成分及质量评价方法研 究D.天津:天津中医药大学,2 0 2 0.8 张华北.半枝莲、夏枯草萜类生物合成相关基因的鉴定及功能研究D.北京:中国中医科学院,2 0 1 9.9 张畅然.指纹图谱在中药质量控制中的应用探讨J.内蒙古中医药,2 0 2 2,4 1(6):1 2 4-1 2 5.1 0 吴梦苑,樊强强,王梅,等.生地黄汤H P L C指纹图谱的建立及1 0种成分的含量测定J.西北药 学 杂志,2 0 2 2,3 7(4):7-1 4.1 1 肖会敏,杨旭,黄新文,等.基于H P L C指纹图谱及多成分含量的化学模式识别法评价小血藤质量J.西北药学杂志,2 0 2 2,3 7(5):1-7.1 2 久欣,张慧文,刘宏,等.化学计量学方法在中药质量标志物中的应用J.中成药,2 0 2 1,4 3(1 2):3 4 1 6-3 4 2 1.1 3 郝荣丽.基于属性值权重的k-m o d e s聚类分析及应用D.太原:太原科技大学,2 0 2 1.1 4 靳炳辉.基于分层聚类分析的视频集体行为识别算法研究D.郑州:郑州大学,2 0 1 5.1 5 张林平.基于主成分分析与聚类算法的汽车行驶工况研究D.银川:宁夏大学,2 0 2 1.1 6 林燕.偏最小二乘变量筛选法及其应用研究D.厦门:厦门大学,2 0 1 8.1 7 彭任,陆兔林,胡立宏,等.中药饮片质量标志物(Q-m a r k e r)研究进展J.中草药,2 0 2 0,5 1(1 0):2 6 0 3-2 6 1 0.1 8 刘锦芮,赖长江生,梁嫌,等.中药采收期的机理与控制方 法 的 研 究 进 展 J.中 药 材,2 0 2 2,4 5(8):2 0 1 7-2 0 2 31 9 康传志,吕朝耕,黄璐琦,等.基于区域分布的常见中药材生态种植模式J.中国中药杂志,2 0 2 0,4 5(9):1 9 8 2-1 9 8 9.2 0 夏梅梅,钟宛凌,张子龙,等.论气候变化对中药资源的影响及应对策略J.中华中医药杂志,2 0 1 9,3 4(2):6 7 7-6 8 0.(修订日期:2 0 2 3-0 3-1 1)42西北药学杂志 2 0 2 3年9月 第3 8卷 第5期