发酵优化绿针假单胞菌GP72-ND3ΔphzO高产吩嗪-1-羧酸.pdf

doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.04.020发酵优化绿针假单胞菌 GP72-ND3phzO高产吩嗪-1-羧酸刘桢桢,王 威,黄显清,张雪洪(上海交通大学 生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室,上海 201100)摘 要 对绿针假单胞菌 GP72-ND3phzO 的发酵条件进行优化并在 5 L 反应器中进行放大培养。在摇瓶水平通过单因素实验、正交实验、最陡爬坡实验和中心组合设计实验,优化得到最佳培养基组成为甘油 49.55 g/L、大豆蛋白胨 37.34 g/L、KCl 1.5 g/L、MgSO4 0.75 g/L、K2HPO4 0.225 g/L,发酵 60 h 后吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)的最大产量为(6.010.17)g/L,是优化前的 2.6 倍。在 1 L 反应器中优化发酵 pH,当培养过程 pH 值维持在 6.8 时,PCA 的产量最高,为(7.160.04)g/L,是优化前的 1.2 倍。在最优培养基和 pH 条件下,对菌株在 5 L反应器中进行放大培养,发酵 60 h 后 PCA 的最大产量为(6.840.53)g/L。研究为提高 PCA 的生物合成速率和工业化应用提供支持。关键词 绿针假单胞菌 GP72-ND3phzO;吩嗪-1-羧酸;发酵优化;中心组合设计;反应器中图分类号 Q93文献标识码 A文章编号 2095-1736(2023)04-0020-07Enhancement of phenazine-1-carboxylic acid production for Pseudomonas chlororaphis GP72-ND3phzO by fermentation optimizationLIU Zhenzhen,WANG Wei,HUANG Xianqing,ZHANG Xuehong State Key Laboratory of Microbial Metabolism School of Life Sciences and Biotechnology Shanghai Jiao Tong University Shanghai 201100 China Abstract The fermentation conditions of this strain were optimized and scaled up in a 5 L bioreactor.First through single factor ex-periment orthogonal experiment steepest climbing experiment and central composite design experiment at the shake flask level the optimal medium composition was obtained as 49.55 g/L glycerol 37.34 g/L soy peptone 1.5 g/L KCl 0.75 g/L MgSO4 and 0.225 g/L K2HPO4 and the maximum production of phenazine-1-carboxylic acid PCA after 60 h fermentation was 6.010.17 g/L which was 2.6 times as that before optimization.Then the fermentation pH was optimized in 1 L bioreactors.When the pH was main-tained at 6.8 during the culture process the PCA production was the highest at 7.160.04 g/L which was 1.2 times as that before optimization.Finally under the optimal medium and pH conditions the strain was scaled up cultured in 5 L bioreactors and the max-imum PCA production after 60 h of fermentation was 6.840.53 g/L.This study provided support for improving the production and industrial application of PCA.KeywordsPseudomonas chlororaphis GP72-ND3phzO phenazine-1-carboxylic acid fermentation optimization central composite design bioreactor吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)是重要的吩嗪类次级代谢产物,具有广谱抗菌和环境友好等特点1。研究发现多种假单胞菌可以合成 PCA,如荧光假单胞菌 2-79、铜绿假单胞菌 M18、绿针假单胞菌 GP72 等1-2。野生菌株中 PCA 的产量通常较低,一般在 1 g/L 以下3-4。提高 PCA 产量的研究多集中在02第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023收稿日期:2022-04-18;最后修回日期:2022-05-07基金项目:国家重点研发计划项目(2019YFA0904302)作者简介:刘桢桢,硕士研究生,研究方向为微生物发酵,E-mail:haibara-4869 通信作者:王威,博士,副教授,研究方向为微生物代谢工程与合成生物学、生物物质的分离纯化、农业生物药物等,E-mail:对野生菌株的改造方面,Fang 等5在铜绿假单胞菌PA1201 中敲除负调控 PCA 合成的基因 mvaU,将 PCA的产 量 提 高 了 0.5 倍,Song 等6在 针 假 单 胞 菌GP72ANO 中过表达甘油代谢途径的基因 glpF 和 glpK并阻断分流途径,将 PCA 的产量提高了 2.1 倍。关于PCA 合成菌株的发酵优化策略的研究则较少,Bedoya等7优化铜绿假单胞菌 LV 的发酵培养基组分、温度和 pH 值,将 PCA 的产量提高为 113 mg/L,Du 等8优化铜绿假单胞菌 M18UMS1 的碳氮源种类及浓度,将PCA 的产量提高为 4 771 mg/L。绿针假单胞菌 GP72 是本实验室从甜椒根际土壤分离得到的一株生防菌株,能合成 PCA、2-羟基-吩嗪-1-羧酸(2-hydroxy-phenazine-1-carboxylic acid,2-OH-PCA)、2-羟基-吩嗪(2-hydroxyphenazin,2-OH-PHZ)3 种吩嗪类化合物4。本实验室参与研究开发的以 PCA为主要成分的生物源农药“申嗪霉素”,对水稻纹枯病、西瓜枯萎病、辣椒疫病等都具有良好的防治效果,已注册获得农药准证9。该菌株中的单加氧酶基因phzO,可催化 PCA 羟基化生成 2-OH-PCA,而 2-OH-PCA 可以自发脱羧生成 2-OH-PHZ4,10-11。前期研究中,通过敲除菌株 GP72 中的 phzO 基因以及负调控吩嗪类化合物合成的基因 pykF、rpeA、rsmE 和 lon,获得了工程菌株 GP72-ND3phzO,在摇瓶发酵中 PCA 的产量由 22 mg/L 提升至 2 300 mg/L,是野生菌株的 90 多倍4,11。本文以菌株 GP72-ND3phzO 为研究对象,在摇瓶水平通过单因素实验、正交实验、最陡爬坡实验和中心组合设计(central composite design,CCD)实验优化PCA 的发酵培养基;于 1 L 反应器中在优化的培养基基础上优化发酵 pH 值,并在 5 L 反应器中进行放大培养。研究结果为该菌株应用于工业化生产 PCA 奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与培养基绿针假单胞菌 GP72-ND3phzO,由本实验室构建并保藏。KB 液体培养基:胰 蛋白胨 20 g/L,甘油18.92 g/L,K2HPO4 0.514 g/L,MgSO4 0.732 g/L。KB固体培养基:在 KB 液体培养基中添加 12 g/L 琼脂。1.1.2 主要仪器紫外分光光度计 UV-7504 购自上海精密仪器有限公司;高效液相色谱系统购自安捷伦科技(中国)有限公司;1 L 反应器及 5 L 反应器购自迪必尔生物工程(上海)有限公司。1.2 方法1.2.1 培养方法固体种子培养:将保存于-80 的菌株划线在 KB固体培养基上,28 倒置培养 36 48 h 后,用接种环挑取单菌落,再次划线在 KB 固体培养基上,28 倒置培养 16 h。液体种子培养:用接种环挑取固体种子单菌落,接种于含有 60 mL KB 液体培养基的 250 mL 凹角三角瓶中,200 r/min、28 恒温条件下培养 12 h。摇瓶发酵:将液体种子按照 1%的接种量接种于含有 60 mL KB 液体培养基的 250 mL 凹角三角瓶,200 r/min、28 恒温条件下培养,每隔 12 h 取样,每个条件设置 3 个平行样。1 L 反应器发酵:将液体种子培养基按照 6%的接种量接种于含有 600 mL 优化培养基的 1 L 反应器中,设置转速 700 r/min、通气量 2 vvm,28 恒温培养,每隔 12 h 取样,每个条件设置 3 个平行样。5 L 反应器发酵:将液体种子培养基按照 6%的接种量接种于含有 3 L 优化培养基的 5 L 反应器中,设置通气量 3 vvm、转速 460 r/min,pH 根据优化结果设置,28 恒温培养,每隔 12 h 取样,每个条件设置 3 个平行样。1.2.2 培养基优化(1)碳源对 PCA 产量的影响。以 KB 培养基为基准,考察碳源种类和浓度对 PCA 产量的影响。在18.92 g/L 的碳源起始浓度下,考察葡萄糖、甘油、淀粉和乙醇等 4 种碳源对 PCA 产量的影响;在 15、20、25、30、35 g/L 起始浓度下,考察碳源浓度对 PCA 产量的影响。(2)氮源对 PCA 产量的影响。以 KB 培养基为基准,考察氮源种类和浓度对 PCA 产量的影响。在20 g/L 的氮源起始浓度下,考察大豆蛋白胨、胰蛋白胨、棉籽粕、棉籽饼粉、黄豆饼粉、冷榨棉籽、牛肉膏、鱼粉蛋白胨、热榨棉籽、棕榈粕、玉米浆、黄豆粉等 12 种氮源对 PCA 产量的影响;在 10、20、30、40、50 g/L 起始浓度下,考察氮源浓度对 PCA 产量的影响。(3)无机盐对 PCA 产量的影响。根据预实验确定KCl、MgSO4、K2HPO4 等 3 种考察对象和浓度范围。去除 KB 培养基所有无机盐,在 0、3、6、9 g/L 起始浓度下,考察 KCl 浓度对 PCA 产量的影响。去除 KB 培养基所有无机盐,在 0、0.5、1、1.5 g/L 起始浓度下,考察MgSO4浓度对 PCA 产量的影响。去除 KB 培养基所有无机盐,在 0、0.3、0.6、0.9 g/L 起始浓度下,考察K2HPO4浓度对 PCA 产量的影响。(4)正交实验。根据单因素实验结果,以 X1-甘油(15 25 g/L)、X2-大豆蛋白胨(10 20 g/L)、X3-KCl(03 g/L)、X4-MgSO4(01.5 g/L)和 X5-K2HPO4(00.3 g/L)等 5 个因素为自变量,以发酵液中 PCA含量为响应值,选用 L8 正交表设计作为正交实验筛12第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023选的变量,从中筛选显著影响因素。其中每个因素取 2 水平:高水平“1”为范围区间最大值,低水平“-1”为范围区间最小值。正交实验的具体因素和水平见表 1。(5)最陡爬坡实验。根据正交实验的一阶模型,筛选出大豆蛋白胨、甘油、KCl 和 K2HPO4共 4 个显著因素,在考虑交叉项的基础上根据显著因素的系数值确定最陡爬坡方向及步长12。最陡爬坡的方向是响应值增长最迅速的方向,爬坡路径的步长与回归系数成正比。显著因素的爬坡路径从正交实验的中心点开始并沿着爬坡方向和步长移动,非显著因素的浓度保持在中心点,找出 PCA 产量最大时的显著因素的浓度,作为中心组合设计实验的起始中心点。最陡爬坡实验的具体因素和水平见表 3。(6)中心组合设计实验。利用响应面实验可以评价显著因子之间的交互作用,以最陡爬坡实验结果作为中心点,以甘油、大豆蛋白胨和 K2HPO4为自变量,以 PCA 产量为响应值,设计中心组合设计实验。三因素的中心 组合设计中 各因素的水 平点共有 5 个(-1.682、-1、0、1、1.682),实验组共 20 组,具体因素和水平见表 4。1.2.3 pH 对 PCA 产量的影响根据中心组合设计实验得到的最佳发酵培养基组分,在 1 L 反应器中,设置恒定 pH 值分别为 6.4、6.8、7.2、7.6,考察发酵 pH 值对 PCA 产量的影响。1.2.4 5 L 反应器的放大培养根据 1 L 反应器 pH 的优化结果,在 5 L 反应器中进行放大培养,同时与 1 L 反应器中的进行比较,考察不同规模反应器中菌株生长和 PCA 合成的情况。1.2.5 PCA 产量的测定发酵液中 PCA 的提取和含量测定参照文献6的方法。取发酵液 1 mL,加入 50 L 6 mol/L 盐酸酸化后,加入 9 mL 乙酸乙酯振荡萃取 5 min,取 1 mL 萃取液吹干后加入 2.5 mL 乙腈溶解,以 HPLC 检测。HPLC 检测条件:使用 Agilent C18(2504.6 mm,5 m)色谱柱,流动相为乙腈和 0.1%甲酸水,流动相比例:04 min,20%乙腈-80%甲酸水,4.0120 min,乙腈浓度由 20%升至 40%,甲酸水浓度由 80%下降至60%,20.0125 min,20%乙腈-80%甲酸水。检测波长254 nm,柱温 25,流速 1.0 mL/min。1.3 数据统计分析每个实验独立重复 2 次以上,每次实验中每个实验组平均重复 3 次,以“平均值标准差”形式表示结果。在单因素实验中,使用 Graphpad Prism 8.0 软件处理分析实验数据并作图,正交实验及中心组合实验设计使用 R-4.0.3 及 minitab 19 处理分析。使用单向方差分析(one-way ANOVA)分析组间差异性,使用 F 检验(P=0.01 或 P=0.05)确定显著差异。2 结果与分析2.1 碳源对 PCA 产量的影响菌株 GP72-ND3phzO 用不同碳源发酵 60 h 后,PCA 的产量见图 1(a)。可以看出,以甘油作为碳源时,PCA 的产量最高达到(2.440.09)g/L;以葡萄糖作为碳源时,PCA 的产量低于甘油为(1.870.06)g/L;以淀粉和乙醇作为碳源时,PCA 的产量极低仅为(0.270.03)g/L 和(0.170.03)g/L。菌株 GP72-ND3phzO以不同甘油浓度发酵 60 h 后,PCA 的产量见图 1(b)。结果显示,随着甘油添加量的增加,PCA 产量先升高后降低,且甘油的添加量为 30 g/L 时,PCA 产量达到最高为(4.150.38)g/L,但进一步提高甘油浓度 PCA产量下降,因此选择添加量为 30 g/L 的甘油为最佳碳源。为显著差异(P0.05);为较显著(P0.01)。图 1 碳源种类和甘油浓度对 PCA 产量的影响Figure 1 Effects of carbon sources and glycerol concentration onPCA production2.2 氮源对 PCA 产量的影响菌株 GP72-ND3phzO 用不同氮源发酵 60 h 后,PCA 的产量见图 2(a)。结果显示:以大豆蛋白胨作为氮源时,PCA 的产量最高达到(3.030.03)g/L;以胰蛋白胨作为氮源时,PCA 的产量低于大豆蛋白胨为(2.440.09)g/L;以棉籽粕、棉籽饼粉、黄豆饼粉、冷榨棉籽、牛肉膏、鱼粉蛋白胨、热榨棉籽、棕榈粕、玉米浆及黄豆粉作为氮源时,PCA 的产量均不足 2 g/L。因此选择大豆蛋白胨作为最优氮源。菌株 GP72-ND3phzO 以不同大豆蛋白胨浓度发酵 60 h 后,PCA的产量见图 2(b)。结果显示,大豆蛋白胨的添加量为 10 g/L 时,PCA 产量仅 1 g/L,可能是氮源不足导致菌株合成 PCA 受限,而当大豆蛋白胨的添加量为20 g/L 时,PCA 产量达到最高为(3.440.08)g/L,随着大豆蛋白胨的添加量进一步增加 PCA 产量逐渐降低,因此选择添加量为 20 g/L 的大豆蛋白胨为最佳氮源。22第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023(a)中 1:大豆蛋白胨;2:胰蛋白胨;3:棉籽粕;4:棉籽饼粉;5:黄豆饼粉;6:冷榨棉籽;7:牛肉膏;8:鱼粉蛋白胨;9:热榨棉籽;10:棕榈粕;11:玉米浆;12:黄豆粉。图 2 氮源种类和大豆蛋白胨浓度对 PCA 产量的影响Figure 2 Effects of nitrogen sources and soy peptone concentrationon PCA production2.3 无机盐对 PCA 产量的影响菌株GP72-ND3phzO以不同KCl浓度发酵60 h后,PCA 的产量见图 3(a)。结果显示,KCl 的添加对菌株合成 PCA 产量具有显著影响,且 KCl 的添加量为3 g/L 时,PCA 产量达到最高为(1.990.02)g/L,因此选择添加量为 3 g/L 的 KCl 进行后续优化。菌株GP72-ND3phzO 以不同 MgSO4浓度发酵 60 h 后,PCA的产量见图 3(b)。结果显示,MgSO4的添加有利于提高菌株合成 PCA 产量,且 MgSO4的添加量为 1.5 g/L时,PCA 产量达到最高为(2.010.08)g/L,因此选择添加量为 1.5 g/L 的 MgSO4进行后续优 化。菌株GP72-ND3phzO 以不同 K2HPO4浓度发酵 60 h 后,PCA 的产量见图 3(c)。结果显示,K2HPO4对菌株合成 PCA 产量具有显著影响,且 K2HPO4的添加量为0.3 g/L 时,PCA 产量达到最高为(2.850.07)g/L,因此选择添加量为 0.3 g/L 的 K2HPO4进行后续优化。(a)KCl 浓度对 PCA 产量的影响;(b)MgSO4浓度对 PCA 产量的影响;(c)K2HPO4浓度对 PCA 产量的影响。为显著差异(P0.05);为较显著(P0.01);为极显著(P0.000 1)。图 3 不同无机盐的添加及浓度对 PCA 产量的影响Figure 3 Effects of addition and concentration of different inorganic salts on PCA production2.4 正交实验正交实验设计及结果见表 1。对正交结果进行分析,X4-MgSO4的 P 值为 0.011 56,大于 0.01,说明其对 PCA 产量无明显影响;其余 4 个因素的 P 值均小于 0.001,说明这 4 个因素对 PCA 的产量具有显著影响。为得到更准确的影响作用,在考虑交叉项的情况下对具有显著作用的 4 个因素进行回归分析(表 2),结果表明该模型能够较为显著地拟合实验数据(P 0.001),且 R2=0.948 2 表 明 Y 的 变 化 有94.82%能被回归方程解释,该模型拟合度较好。X1-甘油,X2-大豆蛋白胨和 X5-K2HPO4等 3 个因素对 PCA 产量有显著促进作用,X3-KCl 对 PCA 产量有显著作用但影响因子为负,对结果进行拟合得到回归方程。表 1 正交实验设计及结果Table 1 Design and results of orthogonal design experiment序号Serial numberX1-甘油/(g/L)X2-大豆蛋白胨/(g/L)X3-KCl/(g/L)X4-MgSO4/(g/L)X5-K2HPO4/(g/L)Y-PCA/(g/L)115100001.210.0321510300.31.480.093152001.501.740.184152031.50.32.330.125251031.500.990.026251001.50.31.250.06725203002.850.0782520000.32.500.1332第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023表 2 正交实验结果的回归分析Table 2 Regression analysis results of orthogonal designexperiment results参数Parameter系数EstimateP 值P value显著性Significance常量1.204 10 X10.402 30 X20.891 30 X3-0.355 60 X50.276 20.004 3 注:R2=0.948 2;R2Adj=0.933 8。为较显著(P0.01);为极显著(P0.000 1)。2.5 最陡爬坡实验根据正交实验拟合曲线方程中各显著因素系数计算最陡爬坡方向和步长。由于 KCl 的系数为负值,在爬坡过程中添加量逐渐降低至 0,且通过预实验对比发现 KCl 以单因素最优值添加时 PCA 产量更高,故KCl 以 1.5 g/L 恒定添加,爬坡实验考察甘油、大豆蛋白胨和 K2HPO4等 3 个影响因素。最陡爬坡以(1.46,3.23,1)为编码方向,即 K2HPO4每爬坡 1 步,对应着甘油爬坡 1.46 步、大豆蛋白胨爬坡 3.23 步。各因素的初始值分别是甘油 20 g/L、大豆蛋白胨 15 g/L、K2HPO4 0.15 g/L,爬坡一步分别增加 7.28、16.14、0.15 g/L,爬坡实验设计及结果见表 3。爬坡 1.5 步时PCA 的产量达到最高,为(5.490.44)g/L,因此选择该组每个因素的水平作为响应面实验的中心点,即甘油30.92 g/L、大豆蛋白胨 39.20 g/L、K2HPO4 0.38 g/L。表 3 最陡爬坡实验设计及结果Table 3 Design and results of steep climbing experiment步骤 Step编码值 Coded level实际值 Real level/(g/L)甘油大豆蛋白胨K2HPO4甘油大豆蛋白胨K2HPO4PCA/(g/L)1.463.2317.2816.140.15Center00020150.153.30.15Center+0.250.370.810.2521.8219.030.194.180.16Center+0.50.731.620.5023.6423.070.234.690.25Center+0.751.102.420.7525.4627.100.264.770.13Center+1.463.231.0027.2831.140.304.720.21Center+1.251.834.041.2529.1035.170.344.870.33Center+1.52.194.851.5030.9239.200.385.490.44Center+1.752.565.651.7532.7443.240.415.190.38Center+22.926.462.0034.5647.270.454.720.22 注:代表爬坡一步;Center 代表爬坡实验中心点。2.6 中心组合设计实验基于响应面实验方法,通过中心组合设计实验对3 个主要因素甘油(X1)、大豆蛋白胨(X2)和 K2HPO4(X3)进一步优化,中心组合设计实验设计及结果见表 4,分析结果见表 5。表 4 中心组合设计实验设计及结果Table 4 Design and results of center combination design experiment序号Serial number编码值 Coded level实际值 Real level/(g/L)PCA/(g/L)x1x2x3X1X2X3实际值 Actual预测值 Predicted1-1-1-122.9229.200.233.530.183.7621-1-138.9229.200.235.710.105.553-11-122.9249.200.232.960.402.69411-138.9249.200.232.980.773.185-1-1122.9229.200.533.290.363.1461-1138.9229.200.535.250.525.587-11122.9249.200.532.830.323.06811138.9249.200.534.370.074.209-1.6820017.4639.200.382.700.392.66101.6820044.3839.200.385.260.205.13110-1.682030.9222.380.384.910.834.931201.682030.9256.020.383.180.792.871300-1.68230.9239.200.124.280.353.7314001.68230.9239.200.634.290.594.061500030.9239.200.384.090.273.901600030.9239.200.384.700.033.901700030.9239.200.383.170.443.901800030.9239.200.384.330.263.901900030.9239.200.383.990.653.902000030.9239.200.384.070.213.9042第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023表 5 中心组合设计回归分析结果Table 5 Regression analysis results of central combination design方差来源Source of variance平方和Sum of squares自由度Free degree均方Mean squareF 值F valueP 值P value显著性Significance模型42.4067.0628.410.000 1significantX122.00122.0088.550.000 1X215.40115.4061.740.000 1X30.4010.401.610.212X1X22.5312.5310.160.002 8X1X30.6410.642.560.117 2X2X31.4511.455.820.020 6残差9.95400.25失拟项1.5480.190.732 30.662 3not significant纯误差8.41320.26总离差52.3046 注:R2=0.809 9;R2Adj=0.781 4。由表 5 可知,模型的 F 值为 28.41,P0.05,失拟项不显著。模型 R2为 0.809 9,表明 Y 的变化有 80.99%能被回归方程解释,表明该模型拟合度较高。应用 R 语言进行预测确定甘油、大豆蛋白胨和 K2HPO4的最优值分别为 49.55 g/L、37.34 g/L和 0.225 g/L,PCA 产量预测值为 5.79 g/L;发酵验证得 PCA 产量为(6.010.17)g/L,符合模型预测。2.7 pH 对 PCA 发酵产量的影响发酵 pH 会影响 PCA 的生物合成,因此在最优培养基下,探究菌株 GP72-ND3phzO 以不同 pH 值在 1 L反应器中发酵时的菌株生长状况和 PCA 产量。菌株生长曲线见图 4(a),发酵恒定 pH 值由 6.4 升高至7.2 过程中,随着 pH 值升高菌株生长更快,且前 48 h菌株 OD 值不断升高,48 h 后菌株 OD 值缓慢降低;发酵恒定 pH 值为 7.6 时,较其他实验组菌株生长明显更缓慢,且菌株 OD 值不存在先升高后降低的现象。菌株 PCA 的产量见图 4(b),当 pH 值为 6.4 时,前 24 h菌株合成 PCA 速率与 pH 值为 6.8 和 7.2 时相当,随后菌株合成 PCA 速率变缓,发酵 72 h 后 PCA 最终产量为(4.260.41)g/L;当 pH 值为 6.8 和 7.2 时,前48 h 菌株合成 PCA 速率相当且在所有实验组中最快,且 pH 值为 6.8 时菌株在 72 h 时 PCA 积累量达最高,为(7.150.04)g/L,较 pH 值为 7.2 时 PCA 产量提高了 1.12 g/L;当 pH 值为 7.6 时,菌株合成 PCA 速率及积累量显著低于其他实验组,可能是碱性环境限制了菌株生长从而导致 PCA 产量较低。2.8 5 L 反应器放大培养以优化培养基为基础,控制发酵 pH 值恒定为6.8,探究菌株 GP72-ND3phzO 在不同反应器水平发酵的情况,菌株生长及 PCA 产量曲线见图 5。结果显示,随着反应器的放大,菌株生长更慢,PCA 开始合成的时间延迟。但 48 h 时二者 PCA 产量几乎持平,并且均在 60 h 达到 PCA 最高产量,其中,5 L 反应器中的产量为(6.840.55)g/L,1 L 反应器中产量(6.710.07)g/L。5 L 反应器中产量略高于 1 L 反应器中产量,表明该发酵优化策略的放大培养可以有效进行。(a)菌株生长;(b)PCA 产量。图 4 不同 pH 值菌株生长和 PCA 产量的动态曲线Figure 4 Effect of different pH on strain growth and PCAproduction(a)菌株生长;(b)PCA 产量。图 5 1 L 和 5 L 反应器中菌株生长和 PCA 产量的动态曲线Figure 5 Strain growth and PCA production in 1 L and 5 Lbioreactors3 讨论与结论假单胞菌以其能分泌多种抗菌作用物质而广泛运52第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023用于农业生产中,目前研究对假单胞菌分泌的吩嗪类物质 PCA 合成与调控机制深入研究,并采用多种策略从基因调控水平进行了优化,而涉及发酵水平的优化不多,因此探究假单胞菌发酵条件对提高 PCA 产量及工业化具有重要意义。本文研究绿针假单胞菌 GP72-ND3phzO 生产PCA 的最优发酵条件。首先,在摇瓶水平进行培养基成分的优化。通过单因素实验确定大豆蛋白胨、甘油、KCl、MgSO4和 K2HPO4等 5 种组分作为 PCA 发酵培养基,并研究各因素的最优添加量。随后,通过正交实验筛选了对 PCA 合成具有显著影响的 4 个因素:大豆蛋白胨、甘油、KCl 和 K2HPO4,正交实验最优组 PCA 产量为(2.850.07)g/L;通过最陡爬坡实验确定 PCA 增长最迅速的方向并进一步优化显著因素的添加量,最优组 PCA 产量大幅提高为(5.490.44)g/L。接着,通过中心组合设计实验确定了显著因素的最优添加量:甘油 49.55 g/L、大豆蛋白胨 37.34 g/L 和 K2HPO4 0.225 g/L。菌株最优发酵培养基组分:甘油 49.55 g/L、大豆蛋白胨 37.34 g/L、KCl 1.5 g/L、MgSO4 0.75 g/L和 K2HPO4 0.225 g/L。以最优培养基进行摇瓶发酵,60 h 时 PCA 产量达到(6.010.17)g/L,较优化前的2.30 g/L 提高了 1.6 倍。完成摇瓶水平优化后,在 1 L反应器中以最优培养基为基础对菌株发酵过程的 pH进行优化,当培养过程 pH 值维持在 6.8 时,PCA 的产量最高,为(7.160.04)g/L,是优化前的 1.2 倍。最后,在最优培养基和 pH 条件下,对菌株在 5 L 反应器中进行了放大培养,发酵 60 h 后 PCA 的最大产量为(6.840.53)g/L,和 1 L 反应器中的产量相当,约为优化前摇瓶产量的 3 倍。在前期报道中,大多研究通过菌株改造提高 PCA产量,如 Askitosari 等13构建恶臭假单胞菌 14.phz2 将PCA 产量提高为 79.79 mg/L,Sun 等14改造铜绿假单胞菌 PA1201 将 PCA 产量提高为 300 mg/L。进行发酵优化的研究主要针对铜绿假单胞菌,本研究的优化产量为 6.84 g/L,高于大多数研究7-8,仅低于 Jin 等3改造的铜绿假单胞菌工程株 PA-IV 在 5 L 反应器中优化的 9.88 g/L。与 Jin 等3的研究相比,本研究优化后摇瓶产量与其相当,且 PCA 产量达到最大值时间提前为60 h,因此后续可以通过分批补料等发酵策略提升在5 L 反应器中生产效率。此外,本研究出发菌株为生防菌株绿针假单胞菌,生物安全性较高。本研究为绿针假单胞菌 GP72-ND3phzO 工业化生产 PCA 提供支持,促进其在农业领域的应用发展。参考文献 1 WANG S Y SHI X C CHEN X et al.Biocontrol ability of phena-zine-producing strains for the management of fungal plant pathogens a review J.Biological Control 2021 155 104548.2 ZHANG J B MAVRODI D V YANG M M et al.Pseudomonas synxantha 2-79 transformed with pyrrolnitrin biosynthesis genes has improved biocontrol activity against soilborne pathogens of wheat and canola J.Phytopathology 2020 110 5 1010-1017.3 JIN K M ZHOU L JIANG H X et al.Engineering the central bio-synthetic and secondary metabolic pathways of Pseudomonas aerugi-nosa strain PA1201 to improve phenazine-1-carboxylic acid produc-tion J.Metabolic Engineering 2015 32 30-38.4 LIU K Q HU H B WANG W et al.Genetic engineering of Pseud-omonas chlororaphis GP72 for the enhanced production of 2-hydroxy-phenazine J.Microbial Cell Factories 2016