丁苯酞通过上调海马IGF1R表达改善APP_PS1_Tau小鼠认知功能.pdf

第 卷第 期 年 月江 苏 大 学 学 报(医 学 版)().丁苯酞通过上调海马 表达改善/小鼠认知功能徐嫚 于明(江苏大学附属医院神经内科江苏 镇江)摘要 目的:观察丁苯酞()对/小鼠海马胰岛素样生长因子 受体()表达的影响探讨 在 治疗阿尔茨海默病()中的作用机制 方法:只 月龄雄性/小鼠随机分为 组、干预组和 抑制剂干预组每组 只另取 只 月龄/雄鼠作对照组 对照组和 组每日灌胃给予植物油.干预组每日灌胃给予 /的 抑制剂干预组在 干预组基础上每日腹腔注射 /的 抑制剂()各组连续给药 周后通过 迷宫实验、新物体识别实验和水迷宫实验检测认知行为 采用蛋白质印迹法检测海马、和 表达尼氏染色评估海马神经元损伤免疫荧光检测海马 表达结果:与 组相比 干预组自主交替率、认知指数明显增高(.)水迷宫逃避潜伏期变短、穿越平台次数明显增多(.)与 组相比 干预组海马 和 表达显著降低(.)、海马神经元凋亡显著减少(.)、海马 表达显著升高(.)与 干预组相比 抑制剂干预组海马 和 表达明显升高(.)自发交替率、认知指数显著降低(.)水迷宫逃避潜伏期明显延长(.)、穿越平台次数明显减少(.)结论:可以通过上调海马 的表达对 发挥认知保护作用关键词 丁苯酞阿尔茨海默病海马神经元胰岛素样生长因子 受体认知功能中图分类号.文献标志码 文章编号 ():./.引用格式徐嫚于明.丁苯酞通过上调海马 表达改善/小鼠认知功能.江苏大学学报(医学版)():.基金项目江苏省卫生健康委 年度医学科研重点项目()江苏省卫生健康委老年健康引进新技术项目()作者简介徐嫚()女硕士研究生于明(通讯作者)教授博士生导师:./():()()/().:/././().:(.)(.).()(.)(.).(.)(.)(.)(.).:.阿尔茨海默病()是以 淀粉样蛋白()沉积、蛋白过度磷酸化为主要病理特征的慢性神经退行性疾病好发于老年人群表现为进行性不可逆性认知功能减退严重影响患者的生活质量 致病因素复杂发病机制至今尚未阐明 近年来丁苯酞()作为我国自主研发的一类新药已在缺血性脑卒中、帕金森等多种神经疾病中证实了其具有神经保护作用其在 中的作用也越发受到关注研究显示 可以通过降低 动物模型中的 和磷酸化()蛋白表达从而改善认知功能 然而 对 中 和 表达的调控机制目前仍在探索中 胰岛素信号转导的损害在 的发病中具有至关重要的作用 研究表明患者大脑组织中胰岛素样生长因子 受体()表达明显下调且其下降程度与神经变性的严重程度显著相关 等研究发现 在老年鼠海马中表达降低与海马依赖性学习功能降低存在密切关联本研究以/小鼠为 动物模型观察 治疗后海马 的表达及其对海马、和认知行为的影响 材料和方法.实验动物分组和给药选取 月龄雄性/()转基因小鼠 只并选取同月龄的 只雄性/小鼠作对照 所有实验动物饲养于江苏大学实验动物中心允许小鼠自由饮水和进食 环境温度()湿度 光/暗 /交替 实验动物分为 组包括对照组、组、干预组、抑制剂干预组每组 只小鼠 其中对照组和 组每日灌胃给予植物油.干预组每日灌胃给予 /的 抑制剂干预组在 干预组基础上每日腹腔注射 /的 抑制剂()各组小鼠均连续给药 周 本研究通过江苏大学附属医院医学伦理委员会批准 伦理批准文 号:.主要药物和试剂丁苯酞胶囊:每粒 石药集团恩必普药业有限公司生产 兔抗小鼠 多克隆抗体、兔抗小鼠 多克隆抗体、兔抗小鼠 多克隆抗体、兔抗小鼠 多克隆抗体(美国 公司)(美国 公司批号:).方法.迷宫实验检测自主交替率将迷宫放置在一个单独的房间里光线充足 迷宫的地板上覆盖着锯末每次实验后混合以消除嗅觉刺激 迷宫由 条臂组成每条臂长 、宽 、高 它们与中心点成 度角按顺时针顺序将 条臂分别标记为、在每条臂中贴上不同形状的图形作为标记 将小鼠从 臂末端放入让其自由活动 记录小鼠进入每条臂的顺序统计其连续交替次数如、和最大交替次数(总交替次数 )计算其自主交替次数将进入迷宫总臂数不足 次的小鼠排除 自主交替率()连续交替次数/最大交替次数.新物体识别实验检测认知指数将实验小鼠置于新物体辨别活动箱适应期将小鼠单独置于第 期徐嫚等.丁苯酞通过上调海马 表达改善/小鼠认知功能测试箱中 自由活动适应环境随后将小鼠放回原饲养笼中 训练期于测试箱中对称安放 个大小、形态和规格相同的物体(、)和 距离测试箱壁约 两者间距约 将小鼠在距离 和 等距离处放入箱中放任其自由探索 记录小鼠在此阶段对 和 的总探索时间 后进入检测期选用大小、形状、颜色与 完全不一样的物体 取代 分别记录小鼠对新物体和旧物体的探索次数计算认知指数 认知指数()探索物体 的次数/(探索物体 的次数 探索物体 的次数).水迷宫实验检测逃避潜伏期和穿越平台次数水迷宫是一个直径为 高为 的圆形水池水温维持约 将水迷宫随机平均分为 个象限在第二象限设置一距水面约 的平台以其为目标象限 随机将小鼠放入不同象限寻找平台时间的训练为 每日 次每次 实验间隔时间为 相邻 的入水顺序不同 如果小鼠在 内找不到平台则终止训练最高分配 并手动将小鼠引导到隐藏的平台 允许小鼠在平台上停留 然后将它从池中移出 记录水迷宫实验小鼠逃到平台时间(逃避潜伏期)第 天撤除平台记录 内小鼠穿越原平台所在位置的次数每日 次记录平均值.蛋白质印迹检测海马、蛋白表达 将小鼠处死后于冰台断头取脑分离出海马组织 将取出的脑组织充分研磨后加组织裂解液离心管中裂解过夜、/离心 取上清液以 法进行蛋白定量调整为 蛋白分装冻存于 冰箱 接下来完成灌胶加样电泳转膜封闭分别加入一抗(、肌动蛋白)冰箱孵育过夜次日 漂洗后加入羊抗兔二抗()反应 洗膜 次显色数分钟双蒸馏水终止显色信号检测采用化学发光检测系统 使用 软件分析灰度值.免疫荧光染色检测海马 表达 小鼠处死后取全脑对小鼠大脑的冷冻冠状切片进行免疫荧光染色 固定和浓缩脱水后将大脑切成 厚的切片 然后将切片在 中洗涤 次在室温下用 牛血清白蛋白和.封闭 封闭后切片与()在 孵育过夜然后在室温下与二抗依次孵育 用荧光显微镜(日本 公司)拍照观察 使用 软件分析平均荧光强度.尼氏染色检测海马神经元凋亡将 冠状冷冻切片用尼氏染色溶液在 下染色 然后用 乙醇洗涤样品 并干燥将切片在二甲苯中洗涤 次每次 用中性香脂密封后在光学显微镜下拍照观察计算神经元中的尼氏体数量使用 软件分析.统计学分析采用 .和 .软件进行分析 计量资料以均数 标准差()表示多组间比较采用单因素方差分析水迷宫逃避潜伏期比较采用重复测量方差分析组间两两比较均采用 检验双侧检验以 .为差异有统计学意义 结果.对 小鼠认知行为的影响与对照组相比 组的自主交替率、认知指数明显降低(值分别为.和.)水迷宫第、天逃避潜伏期均显著延长(值分别为.、.和.)第 天穿越平台次数降低(.)与 组相比干预组自主交替率、认知指数显著增高(值分别为.和.)水迷宫第、天逃避潜伏期均明显变短(值分别为.、.和.)第 天穿越平台次数明显增多(.)见图:迷宫实验:新物体实验:水迷宫逃避潜伏期:水迷宫穿越平台次数:.与对照组相比:.与 组相比图 对照组、组和 干预组的认知行为比较 江苏大学学报(医学版)第 卷.对 小鼠海马、蛋白和神经元凋亡的影响与对照组相比 组表现出海马 和 蛋白的显著升高(值分别为.和.)而 干预组海马 和 蛋白较 组显著降低(值分别为.和.)尼氏染色显示 组的海马神经元凋亡较对照组明显增多(.)而 干预组海马神经元凋亡较 组明显改善(.)见图 :海马、表达 :海马尼氏染色(比例尺:):.与对照组相比:.与 组相比图 对照组、组和 干预组的海马、表达和尼氏染色分析.对 小鼠海马 表达的影响为探索 对 小鼠认知功能改善与 的关联对小鼠海马进行了 染色结果显示 组海马 表达较对照组明显降低(.)而 干预组海马 表达较 组显著升高(.)见图 比例尺:.与对照组相比:.与 组相比图 对照组、组和 干预组海马 免疫荧光比较.和 抑制剂联合使用对 小鼠海马、蛋白和认知行为的影响为进一步验证 对 的调控作用使用 对 的作用进行抑制 结果显示在使用 干预后 抑制剂干预组海马 和 蛋白的表达较 干预组显著升高(值分别为.和.)另外认知行为学检测结果显示与 干预组相比 抑制剂干预组自主交替率、认知指数显著降低(值分别为.和.)而水迷宫第、天均表现出逃避潜伏期明显延长(值分别为 、和 )第 天穿越平台次数明显减少()见图 第 期徐嫚等.丁苯酞通过上调海马 表达改善/小鼠认知功能 :免疫印迹检测海马、表达:迷宫实验:新物体识别实验:水迷宫逃避潜伏期:水迷宫穿越平台次数:.与 组相比:.与 干预组相比图 组、干预组和 抑制剂干预组海马中、表达和认知行为比较 讨论本研究以/三转基因小鼠为 模型揭示了 小鼠海马 表达降低而 治疗后可通过上调海马 表达从而抑制 和 表达改善神经元凋亡进而对 小鼠发挥认识保护作用 另外研究显示 的特异性抑制剂可以显著缓解 对海马 和 表达的抑制降低对认知行为的保护作用 由此可见可特异性调控海马 表达对 小鼠发生神经保护作用为 在 中的保护机制提供了新的理论支持和证据 是从天然植物芹菜籽中提取的脂溶性物质是一种多靶点神经元保护剂可改善脑缺血微循环减少神经元凋亡 大量研究已围绕 与 的治疗展开 等从神经炎症的角度出发在 细胞模型中证实了 可以通过 轴抑制 炎症小体并减轻 样病理 等在/双转 小鼠中研究发现 可改善 小鼠模型和培养的海马神经元的突触和树突棘可塑性并改善神经突起病理在本研究中为了更好地模拟 的病理变化选取了更契合 的 沉积和 磷酸化神经病理改变的/三转基因小鼠证实了 可以通过降低海马 和 的表达对 发挥认知保护作用与此同时越来越多的证据表明 通路的激活对 的神经保护作用具有重要价值 信号通路激活后可通过抑制 蛋白磷酸化或淀粉样蛋白神经毒性来调节 清除从而维持认知功能 由此本研究探索了 对 是否具有调节作用 结果显示在 治疗后海马 的表达显著上调、和 表达显著降低提示 可以通过上调 改善 的神经病理 而 抑制剂则逆转了 对 和 的改善作用为 和 的特异性调节作用提供了佐证同时也为 对 多靶点的干预疗效提供了有力的支持证据而 具体是如何调控 表达也需要进一步的动物实验研究综上所述本研究证实了 可以通过上调 的表达对 发挥神经和认知保护作用为 治疗 的机制研究提供了良好的动物实验层面支持进一步证实了 作为 未来治疗药物的潜力参考文献 .():.():.(下转第 页)江苏大学学报(医学版)第 卷:.():.():.:.():.:.():.:.():.:.:.():.:.:.():.:.():.():.收稿日期 编辑 刘星星(上接第 页).():.刘文君 史厚珍 翟鸿儒 等.调控 改善阿尔茨海默病的机制研究.江苏大学学报(医学版)():.:.:.():.:.():.():.:.():.():.:.收稿日期 编辑 郭 欣 江苏大学学报(医学版)第 卷