线粒体靶向抗氧化剂SKQ1对糖尿病小鼠肾损伤的治疗作用与机制.pdf

书书书基础医学论著基金项目：国家自然科学基金（）通信作者：王明霞，：线粒体靶向抗氧化剂 对糖尿病小鼠肾损伤的治疗作用与机制高治巩永凤王明霞滨州医学院基础医学院生理学教研室山东 烟台 【摘要】目的本文旨在研究线粒体靶向抗氧化剂 对糖尿病（）小鼠肾损伤的影响，以阐明 对肾脏的保护作用及机制。方法选取野生型雄性 小鼠 只，行右侧肾切除术后注射诱导 模型，分成对照组、组、组各 只。用药组每天饮用 水溶液，对照组和 组正常饮水。连续饲养 周后，收集尿液测尿微量白蛋白的变化；通过 和 染色法观察小鼠肾脏病理结构和肾脏纤维化的变化；通过 和免疫荧光法检测小鼠 、表达情况。结果与对照组比较，组小鼠尿微量白蛋白明显增加；与 组小鼠比较，组小鼠尿微量白蛋白降低。和 染色结果显示，与对照组比较，组小鼠肾小球系膜细胞增多，细胞外基质增生，有明显的胶原纤维沉积；与 组比较，组小鼠肾小球系膜细胞数量减少，细胞外基质增生减轻，胶原纤维沉积明显减轻。和免疫荧光结果显示，与对照组比较，组小鼠足细胞相关分子 、明显降低，、表达量增加；与 组比较，组小鼠足细胞相关分子 、表达明显增加，但 、表达量下降。结论 可上调 、的表达及下调 、的表达来减轻足细胞损伤，改善小鼠尿微量白蛋白排泄和肾小球纤维化，进而延缓糖尿病肾病（）的进展。【关键词】；糖尿病肾病；足细胞【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】（）：，【】（），滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，【】；糖尿病肾病（，）是糖尿病（，）的一种严重并发症。随着 发病率的增加，已成为慢性肾脏疾病发展的重要致病因素 。全球约 的终末期肾病患者是 患者 。症状包括蛋白尿、足细胞损伤和肾纤维化 。足细胞作为高度分化的细胞，构成肾小球滤过屏障的最外层。由于足细胞的再生能力有限，足细胞的损伤和丢失可能导致肾小球滤过膜的破坏 。因此，足细胞损伤与蛋白尿的发展密切相关 。临床上评估 的进展和严重程度时，通常使用足细胞损伤和肾纤维化的程度作为指标 。因此，保护足细胞和减轻肾纤维化的治疗被认为对 具有重要意义。是质体醌的衍生物，是一种靶向线粒体的抗氧化剂，对比其他线粒体靶向抗氧化剂（，），的促氧化活性低于 ，其“抗氧化”活性范围大于 ，这为 的临床应用提供了潜在的优势 。已证实 在治疗疾病过程中发挥着关键作用，包括干眼病、阿尔茨海默病、伤后愈合和衰老过程 。同时研究发现，不仅可以预防缺血再灌注损伤、顺铂或叶酸等导致的急性肾损伤 ，还可以延长肾缺血再灌注损伤后的寿命 。鉴于此，对 是否具有防治作用，是否可以通过抑制足细胞损伤和肾纤维化进而减轻 的肾损伤，引起我们的浓厚兴趣。本研究应用 干预 型 模型小鼠，探讨 对 模型肾脏足细胞损伤和肾纤维化的影响，进一步阐明 对 疾病进展过程中的作用和机制。材料与方法 实验动物 野生型小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，选取 周龄的雄性小鼠进行实验，体质量为 左右，每组小鼠 只。所有动物实验均遵守实验动物伦理学规范，饲养于 级动物房，每笼不超过 只小鼠，饲养环境温度、湿度适宜，自由饮食摄水，维持昼夜交替，每 天更换一次垫料，保证环境整洁。饮用水和鼠笼及其他物品均经过高压蒸汽灭菌后使用，限制人员进出饲养间频率，以减少动物产生应激反应。主要试剂与药品 （）；链脲佐菌素（，）（）；肌酐、尿素氮等试剂盒（南京建成科技有限公司）；试剂盒（美国 公司）；（北京索莱宝科技有限公司）；足突蛋白（）抗体（）、肾母细胞瘤基因（，）抗体（）、结蛋白（）抗体（）、平滑肌肌动蛋白（，）抗体（）、标记的二抗（，美国 公司）。单侧肾切除术为加速小鼠糖尿病肾脏损伤，本研究采用单侧肾切除手术联合 注射诱导型糖尿病模型。手术方法腹腔注射 水合氯醛（）麻醉小鼠，在右侧背部做切口，暴露出小鼠右侧肾脏，微血管夹夹闭肾门血管和输尿管，在近心端用缝合线进行结扎，在远心端剪断血管及输尿管，缝合伤口，水浴锅上保持小鼠体温，手术结束后补充 生理盐水。诱导 型 模型单侧肾切除术恢复一周后，用 进行腹腔注射（），连续注射 。注射前需禁食，第一天禁食 ，后四天禁食 ，造模后 周后测血糖，随机血糖 为糖尿病小鼠。对照组注射等量的生理盐水。治疗方法 组小鼠每天自由饮用 （）水溶液 ，对照组和 组正常自由饮水。组持续处理 周。尿液取材代谢笼接取 尿液，将尿液 、离心 后转移至新的离心管中，冻于 保存。根据 试剂盒中的说明书方法进行检测。肾脏取材腹部解剖小鼠，摘取小鼠肾脏，去除被膜，小鼠肾脏沿纵轴切开，一半肾脏加到 中、提取 ，一半肾脏加入 固定，待做组织学染色，或一半肾脏 包埋后冻存于 待做免疫荧光。提取以及 实验按照 试滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，剂盒说明书的步骤提取肾组织总 ，使用反转录试剂盒进行反转录得到 ，用于 。结果采用 设计与分析 软件 获得。表 包含本研究中使用的引物序列。与 归一化后，计算各 的表达水平。表 引物序列 免疫荧光染色将 包埋的肾组织取出，环境下切 的切片，使用甲醇 固定 ；胎牛血清（）室温封闭 ；一抗均以 稀释，孵育过夜，洗 遍；二抗以 稀释，室温避光孵育 ，洗 遍；加 室温避光孵育 ，洗 遍后 封片，使用 激光共聚焦显微镜（德国蔡司）观察拍照。组织学染色取出固定好的肾组织，梯度脱水后用石蜡包埋，切 石蜡切片，进行 和 染色，使用光学显微镜观察各组肾脏组织病理结构变化的情况。统计学方法使用 软件进行统计分析。呈正态分布的计量数据以均数 标准差（珋）表示。组间比较采用 检验，以 表示差异有统计学意义。结果 减轻 小鼠尿微量白蛋白水平血糖结果（图 ）显示，组和 组 诱导成功，两组血糖均高于对照组。结果（图 ）显示，与对照组相比，组小鼠后期尿微量白蛋白均显著升高（）；而与 组小鼠相比，组小鼠后期尿微量白蛋白显著降低（）。小鼠空腹血糖；小鼠蛋白尿 肌酐的相对值。与对照组相比，；与 组相比，。图 小鼠血糖和蛋白尿 对 小鼠肾脏病理结构的影响对不同组别小鼠肾组织进行 染色，观察肾脏病理结构改变。染色结果（图 ）显示，与对照组相比，组小鼠肾小球系膜细胞增多，细胞外基质增多；与 组比，组小鼠肾小球系膜细胞数目减少，细胞外基质增生减轻。染色（，），上图比例尺 ，下图比例尺 。图 改善 小鼠的肾脏病理结构滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，对各组小鼠足细胞相关蛋白表达的影响 结果（图 ）显示，组 、等小鼠肾脏足细胞相关 表达量均较对照组减少（），的表达量较对照组增多（）；组小鼠肾脏足细胞相关转录因子 、表达量均较 组增多（），的表达量较 组减少（）。免疫荧光结果（图 ）显示，小鼠肾脏足细胞相关蛋白变化与 的结果一致；并统计 阳性细胞数代表足细胞数量（图），结果显示，与正常组比较，组小鼠肾小球足细胞数量减少，组小鼠肾小球足细胞数量增加。：、表达水平（实时荧光定量 ，）；，：、荧光强度；：阳性细胞数；：、蛋白表达（免疫荧光 ，），比例尺 ，染核；与对照组相比，；与 组相比，。图 减轻糖尿病小鼠足细胞的损伤滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，改善 小鼠肾脏纤维化 （图 ）和免疫荧光（图 、）结果显示，与对照组相比，组 小 鼠 表 达 量 明 显 增 多（），组 小 鼠 表 达 减 少（）。（图 ）染色结果显示，与对照组相比，组小鼠肾小球有明显的胶原纤维沉积，组小鼠肾小球胶原纤维沉积明显减轻。表达水平（实时荧光定量 ，）；荧光强度、蛋白表达（免疫荧光 ，），比例尺 例尺；染色（，），上图比例尺 ，下图比例尺 。与对照组相比，；与 组相比，。图 改善糖尿病小鼠肾脏纤维化 讨论随着 发病率的迅速上升，已成为慢性肾脏疾病发展的重要致病因素 。本研究旨在阐明线粒体靶向抗氧化剂 对 相关肾损伤的保滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，护作用及机制。通过雄性 小鼠行右侧肾切除术后，腹腔注射 构建 模型，然后通过饮用 水溶液进行治疗 ，连续饮用 周。结果显示，状态下尿微量白蛋白水平明显增加，在饮用 水溶液后明显降低。在一侧肾切除后进行肾缺血 再灌注，发现 通过利尿、血 肌酸酐 和 重吸收部分正常化等方面发挥保护作用 。发现，可以降低肾缺血再灌注后血尿素氮和肌酐水平。这些结果均说明 可以在一定程度上改善蛋白尿及肾功能。尽管近几十年来进行了大量研究 ，但 的确切机制尚未完全阐明。关于 的发展，一种被广泛接受的观点是，是高血糖条件下多个肾靶点损伤的综合结果 。在这些靶点中，足细胞被公认为是早期损伤部位，且多个肾脏信号通路的破坏在这些病理损伤的进展中至关重要 。本研究发现，状态下 、等蛋白的表达量明显下降，足细胞的损伤标志物 表达上调；在饮用 水溶液后，足细胞标志物 、和 等蛋白的表达量增加，足细胞的损伤标志物 表达下降，这也说明饮用 水溶液治疗可以保护足细胞免受损伤。可以维持裂隙膜的正常滤过功能，是 家族表面糖基化的唾液酸激酶，其能将足突和狭缝膈膜蛋白正确定位到膜结构域并维持超滤结构的完整性 ，并且也是肾小球疾病中的足细胞损伤特定标志物 。也是足细胞的特异标志之一，肾脏组织中 表达的变化可以反映足细胞损伤程度 。是慢性肾小球病时足细胞损伤的早期标志物之一，当足细胞损伤时 表达增强。研究显示，肾脏上皮细胞与 预孵育可在缺氧 再复氧 后提高上皮细胞的存活率 。这与本研究的结果一致，可以保护足细胞，减少足细胞的死亡。和 研究发现 在肾缺血再灌注模型中发挥了肾脏保护功能 。同时也有研究发现，预处理可以减轻肾缺血再灌注后小鼠的死亡率 。在本次研究中也发现，组死亡率为 （只鼠死亡），组的死亡率 （只鼠死亡），干预明显提高 鼠的存活率，并延长了小鼠的寿命（此数据没有展示）。这些研究发现与本研究的结果一致，在病理状态下，具有肾脏保护功能。肾脏纤维化是 病进展为终末期肾病（，）的重要原因，是全球医疗保健的主要负担 。肾纤维化发生的机制较为复杂，多种细胞信号通路共同参与调节肾纤维化的形成。本研究发现，病小鼠足细胞数量减少的同时还伴有肾纤维化。之前就有研究发现，足细胞损伤是局灶性节段性肾小球硬化发生发展的主要因素。肾脏纤维化的主要特征是成纤维细胞和细胞外基质过量累积，同时有肾小球硬化等现象发生 ，这些病理变化最终会发展为 。足细胞受到损伤后，肌成纤维细胞分泌 ，是肾纤维化发生的关键。本实验结果显示，组小鼠肾小球可见大量细胞外基质沉积，蛋白表达增多，足细胞数量减少，肾组织出现病理损害。经 治疗后，蛋白表达显著减少，肾间质沉积的细胞外基质明显降低，足细胞数量增多，肾组织病理变化也有所改善。本研究结果表明，可以改善糖尿病状态下小鼠的肾小球纤维化情况。综上所述，可以减轻足细胞损伤，改善小鼠尿微量白蛋白排泄和肾小球纤维化，进而延缓 的进展。参考文献 ，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：（），（）：滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，：，（），（）：，：，（，）（），（）：，（）：，（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，：，（）：（收稿日期：）（本文责编：于腊梅）滨州医学院学术科研喜报！我校精准医学研究团队在国际顶级期刊发表最新研究成果近日，我校精准医学团队最新研究成果被国际顶级期刊 （中科院 一区、期刊，影响因子 ）录用。该研究成果题为“”。首次揭示胰高血糖素（，）在抑制肿瘤血管生成和血管拟态中的重要作用。为了解决结直肠癌治疗过程化疗药物的耐药性和不良反应，团队在前期蛋白质组学研究基础上，深度挖掘了 在结直肠癌治疗中的新作用。实验证明 可同时抑制内皮细胞和肿瘤细胞的迁移与成管能力，能增强传统化疗药物的肿瘤抑制作用。其机制是 增加了肿瘤血管的渗透性，导致血管形态的显著破坏，同时通过调控 信号通路抑制血管生成。在此基础上团队开发了脂质体介导的 药物递送系统，靶向肿瘤血管与血管拟态双重破坏肿瘤的血管系统，从而增强化疗疗效。这些发现证明了 在抑制肿瘤血管网络中的显著作用，具有重要的临床应用前景。我校药学院徐玉雪副教授与 级硕士研究生倪飞雪为文章的并列第一作者，田梗教授、张寅教授和魏鹏飞教授为该文章的共同通讯作者。该工作是我校精准医学研究团队继在 ，等中科院一区期刊发表后的又一个高水平研究成果，这项研究得到了国家自然科学基金、泰山学者工程、山东省重点研发计划、山东省自然科学基金、烟台市科技创新发展计划项目等项目的支持。论文信息：滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，