组蛋白去乙酰化酶3对外周CD4-+T细胞分化的影响_郭晗.pdf

Research Papers研究报告生物化学与生物物理进展Progress in Biochemistry and Biophysics2023，50（3）：组蛋白去乙酰化酶3对外周CD4+T细胞分化的影响*郭晗1）李文婷2）张 婷1）张爱红3）郑爱华3）田 枫2）*郑全辉1）*（1）华北理工大学基础医学院，河北省慢性疾病基础医学重点实验室，唐山 063210；2）北京大学医学部实验动物科学部，北京 100083；3）唐山市工人医院重症医学科，唐山 063000）摘要 目的探讨组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）对外周CD4+T细胞分化及功能的调控作用。方法采用CD4cre酶介导Hdac3杂合基因缺失小鼠（Hdac3fl/flCD4cre+/-）及其野生型正常对照小鼠（Hdac3fl/fl，WT），流式细胞术检测HDAC3缺失对外周CD4+和CD8+T细胞比例和数量的影响；在体外佛波酯（PMA）和离子霉素（Ionomycin）刺激条件下，流式细胞术检测HDAC3缺失对CD4+T细胞中IFN-、IL-4和IL-17A的表达以及Tfh细胞产生的影响；采用ELISA检测HDAC3缺失对小鼠血清IFN-、IL-4和IL-17表达的影响；分选Hdac3fl/flCD4cre+/-和WT小鼠外周初始CD4+T细胞，分别在Th1和Th2分化条件下培养，细胞内染色检测HDAC3缺失对Th1、Th2以及Th17相关细胞因子及其特异转录因子表达的影响；采用Microarray检测HDAC3缺失对CD4+T细胞分化亚群相关基因表达的影响；采用链脲佐菌素（STZ）处理小鼠构建I型糖尿病（TIDM）疾病模型，检测HDAC3缺失对T1DM发病的影响。结果与WT小鼠相比，Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠外周CD4+和CD8+T细胞的比例和数量显著降低。Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠CD4+T细胞及血清中IFN-的表达显著降低，而IL-4和IL-17A的表达显著增加，Tfh细胞比例也显著增加；HDAC3缺失抑制体外培养CD4+T细胞向Th1分化但促进其向Th2分化；Microarray检测发现HDAC3缺失导致Th1型细胞谱系基因表达降低，而Th2、Th17以及Tfh细胞谱系基因表达增加；在STZ诱导条件下，HDAC3缺失抑制小鼠T1DM的发生和CD4+T细胞向Th1分化。结论HDAC3促进外周CD4+T细胞向Th1细胞分化并加重T1DM的发生。关键词 组蛋白去乙酰酶3，CD4+T细胞，细胞分化中图分类号 R392.3DOI：10.16476/j.pibb.2022.0045CD4+T细胞的发育、分化与多种免疫相关疾病（如肿瘤、自身免疫病、超敏反应性疾病）的发生、发展密切相关。在内外因素作用下，CD4+T细胞可进一步分化为不同亚群，进而发挥不同的免疫功能1-2。其中，Th1细胞主要发挥抗细胞内病毒或细菌感染以及抗肿瘤免疫等，病理状态下参与炎症性疾病的发生及发展3。Th2细胞分泌的细胞因子可激活肥大细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞，参与过敏反应和抗寄生虫感染的发生，而Th1型细胞因子对Th2反应具有拮抗作用4-5。Th17细胞可通过产生细胞因子IL-17参与抗细胞外细菌和真菌感染，过度或持续活化时参与了各种炎症性疾病的病理过程6。滤泡辅助 T 细胞（T follicular helper cells，Tfh cells）是一类独特的亚群，促进免疫球蛋白亲和力成熟和重链类别转换，并最终促进长寿命浆细胞和记忆B细胞的高亲和力抗体的产生。Tfh细胞的异常分化也会引起自身抗体的产生和自身免疫病的发展7-8。目前研究表明，表观遗传调控在T细胞的发育、分化过程中发挥重要作用9。组蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）是一种重要的表观遗传调控蛋白，通过催化组蛋白或非组蛋白特异性赖氨酸的去乙酰化来调节染色质结构或基因表达10。HDAC3在机体广泛表达，参与多种组织细胞发育、分化的调控作用11-12。近年来，HDAC3在T细胞发育分化过程中的作用已被广泛研究。胸腺细胞发育过程中需要HDAC3进行阳性选择，并且 HDAC3 是外周 T 细胞成熟所必需的13-14。HDAC3对小鼠外周CD4+T细胞的激活以 河北省卫健委（20190105）和国家自然科学基金（81373111）资助项目。通讯联系人。郑全辉 Tel：[phone]，E-mail：田枫 Tel：[phone]，E-mail：收稿日期：2022-02-08，接受日期：2022-06-06 574 2023；50（3）生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.抑制胆固醇流出也至关重要15。此外，HDAC3是调节 CD8+T 细胞发挥效应功能和分化的关键因子16。HDAC3在活化早期抑制CD8+T细胞的细胞毒性，并且是急性感染消退后活化CD8+T细胞持续存在所必需的。最近有研究表明17，HDAC3通过抑制miR-296-5p启动子活性介导的Bcl-xl上调增强了淋巴细胞的抗凋亡能力，从而加速了1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）的发生。T1DM是一种自身免疫性疾病，冠心病是导致与胰岛素抵抗密切相关的 T1DM 患者死亡的主要因素18。因此，研究HDAC3对外周CD4+T细胞分化和功能的调控作用对开发新型有效的自身免疫病治疗手段具有重要意义。以往的研究采用CD4cre酶介导的Hdac3 T细胞特异基因敲除小鼠，结果发现，HDAC3敲除导致外周免疫器官中 CD4+T 细胞极度降低，同时iNKT以及CD8+T细胞几乎完全缺失19-20。为进一步明确HDAC3在外周T细胞分化及功能中的作用，本研究采用了CD4cre酶介导的Hdac3杂合基因缺失小鼠，深入探讨在HDAC3表达降低条件下对外周不同CD4+T细胞亚群分化及功能的影响。1材料与方法1.1小鼠选取68周龄雄性Hdac3基因外显子47两侧插入floxp序列的C57BL/6背景小鼠（Hdac3fl/fl，购自美国Jackson实验室）与CD4基因启动子/增强子驱动cre酶表达的C57BL/6背景小鼠（CD4cre+，购自美国 Jackson 实验室）连续杂交筛选 3 代以上，获得 Hdac3 在 CD4+T 细胞的杂合基因缺失小鼠（Hdac3fl/flCD4cre+/-），将Hdac3fl/fl小鼠（WT）作为正常对照。所有小鼠均在华北理工大学实验动物中心SPF级动物房饲养、繁殖。1.2小鼠基因型鉴定采用鼠尾组织，提取DNA并进行PCR扩增。所用引物如下：HDAC3 MF，5-TGG TGG TGA ATG GCT TTA ATC-3；HDAC3 MR，5-TAA CGG GAG CAG AAC TCG AA-3。CD4cre Com，5-GTT CTT TGT ATA TAT TGA ATG TTA GCC-3；CD4cre WT，5-TAT GCT CTA AGG ACA AGA ATT GAC A-3；CD4cre Mu，5-CTT TGC AGA GGG CTA ACA GC-3。1.3流式细胞术选取68周龄雄性Hdac3fl/flCD4cre+/-和WT小鼠，每组35只，分离脾脏和淋巴结并制备成单细胞悬液，用于细胞表面或细胞内染色。使用荧光素标记的单克隆抗体如下：Anti-mouse-CD4-APC antibody（BD Biosciences，553051）、Anti-mouse-CD4-PerCP antibody（Biolegend，100433）、Anti-mouse-CD8-PerCP antibody（BD Biosciences，551162）、Anti-HDAC3 antibody（Abcam，ab32369）、Goat anti-rabbit-IgG-PE antibody（Santa Cruz Biotechnology，A1314）、Anti-mouse-IFN-FITC antibody（eBioscience，E00862-1632）、Anti-mouse-IL-4-APC antibody（Biolegend，504105）、Anti-mouse-IL-17A-FITC antibody（eBioscience，4291420）、Anti-mouse-CXCR5-APC antibody（Biolegend，145505）、Anti-mouse-PD-1-PE antibody（Tonbo Biosciences，C9985072420503）、Anti-mouse-T-bet-PE antibody（BD Biosciences，561265）、Anti-mouse-GATA3-PE antibody（BD Biosciences，560074）。为 检 测 WT 和 Hdac3fl/fl CD4cre+/-小鼠CD4+T细胞中HDAC3的表达，先对T细胞进行CD4表面染色，细胞经固定、打孔后首先加入兔抗小鼠HDAC3抗体（一抗），再加入荧光标记的羊抗兔IgG（二抗）进行染色和流式细胞术检测，以不加HDAC3一抗，但加入荧光标记二抗 的 CD4+T 细 胞 作 为 非 特 异 荧 光 本 底 对 照（Control）。为了检测细胞因子的产生，分别分离Hdac3fl/fl CD4cre+/-和WT小鼠脾脏并制备成单细胞悬液，按2106/孔加入6孔板中，在37C、5%CO2条件 下 用 佛 波 酯（PMA，50 g/L，Cayman-No.10008014）和离子霉素（Ionomycin，500 g/L，Cayman-No.11932）在体外充分刺激5 h，离心收集细胞，首先采用抗小鼠CD4抗体进行细胞表面染色，然后用Cytofix/Cytoperm固定/渗透溶液试剂盒（BD Biosciences，554722）固定和渗透细胞后进行不同细胞因子染色。采用Beckman流式细胞仪收集标本，采用 Summit 5.2软件进行数据分析。1.4酶联免疫吸附实验（ELISA）分别分离Hdac3fl/flCD4cre+/-和WT小鼠血清，采用细胞因子 ELISA 检测试剂盒，Mouse IFN-ELISA Kit（MultiSciences，70-EK280/3-96）、Mouse IL-4 ELISA Kit（MultiSciences，70-EK204/2-96）、Mouse IL-17A ELISA Kit（MultiSciences，70-EK217/2-96），按 100 l/每 孔 加 入 Hdac3fl/fl CD4cre+/-和WT小鼠血清及倍比稀释的标准血清至相应ELISA板中，每个样品做3个复孔，室温孵育郭晗，等：组蛋白去乙酰化酶3对外周CD4+T细胞分化的影响2023；50（3）575 2 h。PBS洗涤后加入底物显色，在450 nm处测定吸光度值，并根据标准曲线计算血清中 IFN-、IL-4及IL-17的含量（g/L）。1.5小鼠CD4+T细胞体外培养流式细胞仪分选Hdac3fl/flCD4cre+/-和WT小鼠外周初始CD4+（CD4+CD62+CD44-）T细胞，加入预先 包 被 抗 CD3 抗 体（1 mg/L，BioXcell，145-2 C11）和 抗 CD28 抗 体（3 mg/L，BioXcell，BE0015）的6孔细胞培养板中，1106/孔，然后分别在Th0、Th1和Th2分化条件下培养。Th0：不再加入其他细胞因子和抗体；Th1：IL-12（5 g/L，PeproTech，Cat#210-12）、抗 IL-4 抗体（5 mg/L，BD Biosciences，554433）；Th2：IL-4（5 g/L，PeproTech，Cat#214-14）、抗IL-12抗体（5 mg/L，BD Biosciences，551219）、抗IFN-抗体（5 mg/L，BD Biosciences，554409）。置于37、5%CO2培养箱中进行培养，72 h后收集细胞，采用流式细胞仪进行分析。1.6基因表达谱分析采用流式细胞仪分选Hdac3fl/flCD4cre+/-和WT小鼠外周 CD4+T 细胞，加入预先包被抗 CD3 抗体（1 mg/L）和抗CD28抗体（3 mg/L）的6孔细胞培养板中，3106/孔，培养 24 h，分别提取细胞总RNA（QIAGEN，74536），采 用 Microarray（Illumina，RS-122-2001）检 测 HDAC3 缺 失 后CD4+T细胞分化亚群基因表达谱变化。实验重复3次。采用GraphPad Prism v8.0软件绘图并进行数据分析。1.7STZ诱导小鼠T1DM选取 68 周龄雄性 Hdac3fl/flCD4cre+/-和 WT 小鼠，分别分为溶剂对照组和链脲佐菌素（STZ，150 mg/kg，Sigma，18883-66-4）处理组。STZ溶于柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH=4.5），腹腔注射以诱导T1DM。每两天监测一次小鼠随机血糖浓度，连续监测两周后分离小鼠脾脏用于流式细胞仪检测。以连续两次小鼠末梢血糖浓度13.9 mmol/L作为T1DM的判断标准。1.8统计分析采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。计量资料以xs表示且均符合正态分布，两组间比较采用两独立样本t检验。P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1Hdac3杂合基因缺失小鼠鉴定Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠鼠尾DNA采用HDAC3引物经PCR扩增产生700 bp扩增片段，WT小鼠产生534 bp扩增片段（图1a左）。Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠Fig.1Identification of Hdac3 heterozygous gene deficiency mice(a)PCR identification of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice using HDAC3 primer(left)and CD4cre primer(right).(b,c)The proportion of HDAC3 positive cell in CD4+T cells of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice was analyzed by intracellular staining and flow cytometry.(d,e)The expression of HDAC3 in CD4+T cells of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice was analyzed by intracellular staining and flow cytometry.*P0.01.576 2023；50（3）生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.鼠尾DNA采用CD4cre引物经PCR扩增产生153 bp和336 bp两条扩增片段，WT小鼠产生153 bp扩增片段（图1a右）。分离Hdac3fl/flCD4cre+/-和WT小鼠脾脏细胞，采用流式细胞术检测 CD4+T 细胞中HDAC3的表达变化。结果发现，与WT小鼠相比，Hdac3fl/fl CD4cre+/-小鼠CD4+T细胞中HDAC3阳性细胞比例显著降低（图1b，c），且HDAC3的表达显著降低（图1d，e），差异具有统计学意义。2.2HDAC3缺失导致外周免疫器官T细胞比例和数量减少分离 Hdac3fl/flCD4cre+/-和 WT 小鼠脾脏和淋巴结，采用抗小鼠CD4、CD8抗体染色，流式细胞仪检测Hdac3fl/flCD4cre+/-和WT小鼠外周免疫器官中T细胞变化。结果发现，与WT小鼠相比，Hdac3fl/fl CD4cre+/-小鼠脾脏和淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例（图2a，b）和数量显著降低（图2c），差异具有统计学意义。2.3HDAC3缺失影响外周CD4+T细胞分化分离Hdac3fl/flCD4cre+/-和WT小鼠脾脏并制备成单细胞悬液，采用PMA和Ionomycin在体外充分刺激5 h，离心收集细胞，首先采用抗小鼠CD4抗体进行表面染色，固定和渗透细胞后采用细胞内染色和流式细胞仪分析 Hdac3fl/flCD4cre+/-和 WT 小鼠CD4+T 细胞中 Th1、Th2 及 Th17 相关细胞因子 IFN-、IL-4及IL-17A的表达。结果发现，与WT小鼠相比，Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠 CD4+T 细胞中IFN-表达显著降低（图3a），而IL-4及IL-17A表Fig.2HDAC3 deletion resulted in a decrease in the proportion and number of T cells in peripheral immune organs(a,b)The proportion of CD4+and CD8+T cells in the spleen and lymph nodes of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice were analyzed by flow cytometry.(c)The number of CD4+and CD8+T cells in the spleen and lymph nodes of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice.*P0.01.郭晗，等：组蛋白去乙酰化酶3对外周CD4+T细胞分化的影响2023；50（3）577 达显著增加（图3b，c）。采用细胞表面染色和流式细胞仪分析 Hdac3fl/flCD4cre+/-和 WT 小鼠 CD4+T细胞中 CXCR5+PD-1+Tfh 细胞比例变化。结果发现，与 WT 小鼠相比，Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠外周Tfh细胞比例显著增加（图3d）。采用ELISA检测Hdac3fl/flCD4cre+/-和 WT 小鼠血清中 IFN-、IL-4 及IL-17 表达水平，结果发现，与 WT 小鼠相比，Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠血清中 IFN-表达显著降低，而IL-4及IL-17表达显著增加（图3e）。差异均具有统计学意义。Fig.3HDAC3 deletion affected the differentiation of peripheral CD4+T cell(a,b,c)The expression of IFN-、IL-4 and IL-17A in peripheral CD4+T cells of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice was analyzed by intracellular staining and flow cytometry after in vitro stimulation with PMA and Ionomycin for 5 h.(d)The proportions of Tfh cell in peripheral CD4+T cells of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice were analyzed by flow cytometry.(e)The expression of IFN-,IL-4 and IL-17 in serum of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice was analyzed by ELISA.*P0.05,*P0.01.578 2023；50（3）生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.2.4体外HDAC3促进CD4+T细胞向Th1细胞分化接下来检测HDAC3缺失在体外对CD4+T细胞分化的影响。采用流式细胞仪分选Hdac3fl/flCD4cre+/-和WT小鼠外周初始CD4+T细胞，在用抗CD3和抗CD28抗体活化基础上，分别采用Th1、Th2分化培养基体外培养72 h，采用细胞内染色检测细胞因子IFN-、IL-4以及Th1、Th2细胞特异转录因子T-bet、GATA3表达变化。结果发现：在Th1分化培养条件下，与WT小鼠相比，Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠CD4+T细胞IFN-和T-bet表达显著降低（图4a，b）；而在Th2分化培养条件下，与WT小鼠相比，Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠CD4+T细胞IL-4和GATA3表Fig.4HDAC3 promotes the differentiation of CD4+T cells to Th1 in vitro(a,b)The expression of IFN-and T-bet in naive CD4+T cells of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice was analyzed by intracellular staining and flow cytometry after culture in Th1 differentiation conditions for 72 h.(c,d)The expression of IL-4 and GATA3 in naive CD4+T cells of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice was analyzed by intracellular staining and flow cytometry after culture in Th2 differentiation conditions for 72 h.(e)The expression of IFN-and IL-4 in naive CD4+T cells of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice was analyzed by intracellular staining and flow cytometry after culture in Th0 differentiation conditions for 72 h.*P0.05,*P0.01.郭晗，等：组蛋白去乙酰化酶3对外周CD4+T细胞分化的影响2023；50（3）579 达显著增加（图4c，d）；即使在中性培养条件下（Th0），与 WT 小鼠相比，Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠CD4+T细胞也表现为IL-4表达增加，IFN-表达降低（图4e）。差异均具有统计学意义。2.5HDAC3缺失导致CD4+T细胞分化亚群相关基因表达变化采用Microarray检测HDAC3缺失对活化CD4+T细胞分化亚群相关基因表达的影响（图5a）。与WT小鼠相比，Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠CD4+T细胞中Th1相关基因Il2、Tbx21、Tnf等表达显著降低（图5b）；Th2相关基因Il4、Il5、Il10等表达显著增加（图5c）；Th17相关基因Il17a、Il17f、Il23a、Batf等表达显著增加（图 5d）；Tfh 相关基因 Cxcr5、Bcl6、Icos等表达显著增加（图5e）。差异均具有统计学意义。以上结果进一步表明，HDAC3缺失导致活化CD4+T细胞向Th1分化减弱，而向Th2、Th17及Tfh分化增强。2.6HDAC3促进Th1细胞分化并加重T1DM取小鼠末梢血，从STZ注射第0天起，每2 d监测一次小鼠随机血糖水平，连续监测2周。结果发现，与对照组相比，STZ处理组小鼠血糖浓度从第4天开始显著升高。STZ处理的Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠随机血糖浓度始终低于STZ处理的WT小鼠（图6a），表明HDAC3缺失对STZ诱导的T1DM有抵抗作用。分离T1DM小鼠脾脏，采用细胞内染色Fig.5HDAC3 deletion resulted in the expression changes of genes related to CD4+T cell differentiation subsets(a)Microarray gene expression analysis of CD4+T cells in spleen of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice.(b-e)The expression of Th1,Th2,Th17 and Tfh associated genes in CD4+T cells of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice.*P0.05,*P0.01.580 2023；50（3）生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.Fig.6HDAC3 promotes Th1 cell differentiation and aggravates T1DM(a)Random blood glucose levels in STZ-treated and control group of WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice.(b)The proportion of HDAC3 positive cell in CD4+T cells of STZ-treated WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice was analyzed by intracellular staining and flow cytometry.(c-e)The expression of IFN-,IL-4 and IL-17A in peripheral CD4+T cells of STZ-treated WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice was analyzed by intracellular staining and flow cytometry after in vitro stimulation with PMA and Ionomycin for 5 h.(f)The proportions of Tfh cell in peripheral CD4+T cells of STZ-treated WT and Hdac3fl/flCD4cre+/-mice were analyzed by flow cytometry.*P0.05,*P0.01.郭晗，等：组蛋白去乙酰化酶3对外周CD4+T细胞分化的影响2023；50（3）581 和流式细胞仪检测 Hdac3fl/flCD4cre+/-和 WT 小鼠CD4+T细胞中HDAC3阳性细胞比例。结果发现，与WT小鼠相比，Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠CD4+T细胞中 HDAC3 阳性细胞显著降低（图 6b）。分离T1DM小鼠脾脏并制备成单细胞悬液，采用PMA和Ionomycin在体外充分刺激5 h，离心收集细胞，首先采用抗小鼠CD4抗体进行表面染色，固定和渗透细胞后采用细胞内染色和流式细胞仪分析Hdac3fl/flCD4cre+/-和 WT 小鼠 CD4+T 细胞中 Th1、Th2以及Th17相关细胞因子IFN-、IL-4及IL-17A的 表 达 水 平。结 果 发 现，与 WT 小 鼠 相 比，Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠CD4+T细胞中IFN-表达显著降低（图6c），而IL-4及IL-17A表达显著增加（图6d，e）。采用细胞表面染色和流式细胞仪分析Hdac3fl/flCD4cre+/-和 WT 小 鼠 CD4+T 细 胞 中CXCR5+PD-1+Tfh 细胞比例变化。结果发现，与WT小鼠相比，Hdac3fl/flCD4cre+/-小鼠外周Tfh细胞比例显著增加（图6f）。3讨论以往研究发现，Hdac3基因纯合缺失导致小鼠外周T细胞活化诱导的细胞凋亡显著增强和细胞数量极度减少14，19。为获得足够外周 T 细胞进行HDAC3对T分化和功能影响的研究，本研究采用了 Hdac3 在 CD4+T 细胞中的杂合基因缺失小鼠。研究结果发现，Hdac3 杂合基因缺失也可导致HDAC3在CD4+T细胞中的表达降低，同时导致小鼠外周CD4+和CD8+T细胞比例和数量下降。本研究还发现，HDAC3缺失可导致CD4+T细胞中Th1分化相关基因、细胞因子及特异转录因子的表达显著降低，而Th2和Th17分化相关基因和细胞因子的表达以及Tfh细胞比例显著增加。更为重要的是，HDAC3缺失对小鼠TIDM的发病具有明显抑制作用，这可能与HDAC3缺失导致的CD4+T细胞向Th1分化显著降低有关。而Th2、Th17和Tfh尽管在HDAC3缺失的CD4+T细胞中所占比例增加，由于总CD4+T细胞在HDAC3缺失小鼠中数量的降低，Th2、Th17和Tfh在HDAC3缺失小鼠中的数量变化可能并不明显。因此，与Th1相比，Th2、Th17和Tfh在HDAC3缺失导致的TIDM发病抑制中可能不发挥主要作用。有关不同效应性CD4+T细胞亚群在HDAC3缺失小鼠TIDM发病中的确切调控机制仍需在以后研究中进一步阐明。CD4+T细胞分化依赖多种表观遗传机制的调控21。有研究表明，Hdac1基因的T细胞特异敲除导致小鼠对胶原诱导关节炎（CIA）具有抵抗作用，并且血清中炎性细胞因子IL-17和IL-6的表达显著降低，表明HDAC1在炎症条件下调节Th17相关通路22。Tfh细胞依赖Tcf1固有的HDAC活性来抑制 CTLA4 的表达并辅助 B 细胞功能的发挥23。此外，Philips 等13研究表明，在缺乏HDAC3的情况下，RORC启动子乙酰化增加，导致外周 CD4+T 细胞过度分化为 RORt+的 Th17 细胞，并发展为炎症性肠病。本研究发现，HDAC3在小鼠外周CD4+T细胞分化和功能中发挥关键作用，HDAC3缺失导致Th1分泌的细胞因子IFN-及其特异性转录因子T-bet表达显著降低。同样，基因表达Microarray分析发现，HDAC3缺失导致活化CD4+T细胞中Th1相关基因表达显著降低。以上结果表明，外周CD4+T细胞的分化依赖HDAC3的表观遗传调控，HDAC3通过促进外周CD4+T细胞向Th1细胞分化，从而影响外周CD4+T细胞的效应功能。CD4+T 细胞通过激活和辅助其他免疫细胞，在感染、炎症和自身免疫性疾病中发挥重要作用。其中Th2细胞介导的免疫反应在过敏性气道疾炎症和炎症性关节炎中起重要作用24-25。Tfh细胞的异常活化和分化可扰乱生发中心对于B细胞的选择，从而影响自身抗体的分泌，参与多种自身免疫病的发生8，26。而Th1 和Th17 细胞与炎症和自身免疫病的发病机制密切相关。有研究报道27，EriB通过抑制Th1和Th17细胞分化在自身免疫性脑脊髓炎中发挥有效的抗炎作用。另有研究表明28，SAA蛋白诱导Th17细胞分化并促进炎症性疾病的发生。T1DM的发生与自身反应性T细胞介导的胰岛细胞破坏，以及Th1和Th2细胞分化不平衡介导的胰岛素分泌受损密切相关29。Hu等17实验表明，HDAC3可通过限制miR-296-5p在T细胞中的表达加重T1DM的发生。本研究也发现，HDAC3可通过促进外周CD4+T细胞向Th1分化加重T1DM的发生。此外，本文还分析了其他效应性 CD4+T 细胞亚群变化，结果表明HDAC3对Th2、Th17和 582 2023；50（3）生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.Tfh 细胞分化具有抑制作用，但这些细胞亚群对HDAC3相关T1DM发病的影响目前未知。HDAC3是组织中炎症基因表达调控所必需的，HDACs的药理学抑制已经成为治疗各种过敏和炎症反应的有效手段30-32。这与本文的研究结果相似，降低HDAC3表达可抑制小鼠外周CD4+T细胞向Th1细胞 分 化，并 对 T1DM 的 发 展 具 有 抵 抗 作 用。HDAC3调控不同效应性CD4 T细胞亚群分化的具体分子机制仍有待进一步研究。4结论本研究探讨了HDAC3在外周CD4+T细胞分化和功能中的作用，表明HDAC3促进外周CD4+T细胞向Th1细胞分化并加重T1DM的发生，研究结果为开发以HDAC3为靶点的自身免疫病治疗手段提供了新的理论依据。参考文献1Zhu J.T helper cell differentiation,heterogeneity,and plasticity.Cold Spring Harb Perspect Biol,2018,10(10):a0303382Caza T,Landas S.Functional and phenotypic plasticity of 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