桃红四物汤中5种主要成分在脑缺血再灌注模型大鼠体内组织分布的研究.pdf

方药研究桃红四物汤中种主要成分在脑缺血再灌注模型大鼠体内组织分布的研究戴文涛，武瑞，张亚南，侯欣宇，彭代银，（安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 ；中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 ；安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥 ）摘要 目的研究脑缺血再灌注模型大鼠在灌胃桃红四物汤（，）后，种主要活性成分（藁本内酯、苦杏仁苷、芍药苷、羟基红花黄色素、阿魏酸）在体内组织分布的差异和规律。方法采用线栓法构建大鼠大脑中动脉闭塞（，）模型，然后再灌注 建立脑缺血再灌注大鼠模型；将模型复制成功的大鼠灌胃 （）后，于不同时间点采集组织（心、肝、脾、肺、肾、脑），样品处理后采用 技术检测各组织中待测成分的含量。结果各成分在模型大鼠各组织中分布广泛，在肝、肾组织中浓度较高，其中藁本内酯在脑组织中有较高浓度；苦杏仁苷在肺部具有组织分布特异性；芍药苷、羟基红花黄色素在大鼠肝、脾、肺组织具有较高分布比例，阿魏酸在脑组织中未检出。结论 中种主要活性成分在各组织中分布广泛，各组织不同时间点的分布趋势也存在较大差异。关键词 桃红四物汤；脑缺血再灌注损伤；苦杏仁苷；芍药苷；羟基红花黄色素；阿魏酸；藁本内酯；组织分布 中图分类号 桃 红 四 物 汤（，）出自清代吴谦等所著的 医宗金鉴，全方由桃仁、红花、熟地黄、当归、白芍、川芎味药组成。桃仁、红花是辛润通络药，熟地黄为补血要药，当归补血活血，川芎活血行气，白芍养血益阴。四物汤四味药配伍桃仁、红花使用，共奏活血化瘀、祛瘀生新的功效。临床和实验研究表明，对脑缺血疾病损伤有显著的治疗作用。课题组前期研究 发现，具有增强脑缺血再灌注大鼠的抗氧化能力，抑制神经细胞凋亡，促进脑内缺血区的血管新生，改善脑损伤等多种效应。的成分复杂，药物靶点众多，体内过程尚缺乏研究。体内过程是药物发挥疗效的基础，脑卒中的病位虽在于脑，但其病机是多个脏腑相互影响的结果，因此对组织分布的研究有助于阐明其物质作用基础与方剂组方原理 。课题组前期分析了 入血和入脑的原型成分和代谢产物，发现黄酮类、芳香有机酸类和挥发油类等化合物可能是 治疗脑卒中的主要物质基础，藁本内酯、苦杏仁苷、芍药苷、羟基红花黄色素、阿魏酸等主要活性成分均可在血中被检出。本实验基于大脑中动脉闭塞（基金项目：国家自然科学基金项目（）作者简介：戴文涛（），男，硕士研究生通信作者：彭代银（），男，教授，博士研究生导师，）模型，建立 分析方法，检 测 中种 主 要 活 性 成 分 在 模型大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑组织的分布特征，为进一步明确 的作用机制和药效物质基础提供依据。材料 药材桃仁为蔷薇科植物桃（犘 狉 狌 狀 狌 狊狆 犲 狉 狊 犻 犮 犪（）或 山 桃（犘 狉 狌 狀 狌 狊犱 犪 狏 犻 犱 犻 犪 狀 犪（）的干燥成熟的种子（批号 ），红花为菊科植物红花（犆 犪 狉 狋 犺 犪 犿 狌 狊 狋 犻 狀 犮 狋 狅 狉 犻 狌 狊）的干燥花（批号 ），川芎为伞形科植物川芎（犔 犻 犵 狌 狊 狋 犻 犮 狌 犿 犮 犺 狌 犪 狀 狓 犻 狅 狀 犵 ）的 干 燥 根 茎（批 号 ），熟地黄为玄参科植物地黄（犚 犲 犺 犿 犪 狀 狀 犻 犪犵 犾 狌 狋 犻 狀 狅 狊 犪 ）的干燥块根（批号 ），当归为 伞 形 科 植 物 当 归 犃 狀 犵 犲 犾 犻 犮 犪狊 犻 狀 犲 狀 狊 犻 狊（）的干燥根（批号 ），白芍为毛茛科植物芍药（犘 犪 犲 狅 狀 犻 犪犾 犪 犮 狋 犻 犳 犾 狅 狉 犪 ）的 干 燥 根（批 号 ），以上药材均购自安徽省亳州市沪谯药业有限公司，并经安徽中医药大学中药资源教研室鉴定，符合 年版 中华人民共和国药典 一部相关规定。仪器 超高效液相色谱仪：日本 ；三重四极杆线性离子肼串联质谱仪：美国 ；型十万分之一电子分析天平：德国 公司；分析天平：上海越平科学仪器有限公司；台式高速离心机：长沙湘仪离心机仪器 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 有限公司；超纯水仪：美国 公司；组 织 匀 浆 机：德 国 公 司；型氮吹仪：天津金贝尔科技有限公司。试剂芍药苷、苦杏仁苷、藁本内酯、阿魏酸、羟基红花黄色素均购于成都德思特生物技术有限公司，批号分别为 、；其 他 试剂均为分析纯。动物 只 级健康雄性 大鼠，体质量（），购自济南朋悦实验动物繁育有限公司 生产许可证号：（鲁）。饲养室温度为（），相对湿度为 ，通风良好，所有大鼠均给予标准饲料进行喂养，自由饮水。方法 乙醇提取物的制备各药材按 方剂学 教材中复方配伍比例，即犿（熟地黄）犿（当归）犿（白芍）犿（川芎）犿（桃仁）犿（红花），加入 乙醇回流提取（乙醇加入量为所加药物质量总和的 倍量），过滤，收集滤液，滤渣加入 乙醇回流提取（乙醇加入量为所加药物质量总和的倍量），过滤，将次滤液合并，旋转蒸发，浓缩制成生药含量 的浓缩液，保存备用。脑缺血再灌注大鼠模型的建立取 只雄性 大鼠适应性饲养后准备实验，大鼠于模型建立前一晚禁食，参照线栓法 构建 模型，再灌注 后，参照 评分法，对大鼠进行神经功能学评分，验证模型是否成功。动物分组、给药与组织样品采集取脑缺血再灌注大鼠模型建立后的大鼠 只，分为组，每组只，单次给药（），给药容积按 ，给药前 禁食不禁水，于给药后、个时间点进行腹主动脉取血，然后分批取出组织（心、肝、脾、肺、肾、脑），将组织放入生理盐水中洗去血液，再置于干净滤纸上吸干水分，放入塑封袋中，于 冰箱冷冻保存。色谱条件 色谱柱（，），流速 ，柱温 ，进样量为，进样时间 ，流动相为 甲酸水溶液（）乙腈（）。梯度洗脱：，；，；，；，；，。质谱条件采用电喷雾电离源（，），正、负离子模式同时扫描；喷雾电压 ；离子化温度 ；为 ，为 ，为 。另外对碰撞电压（，）、去簇电压（，）以及检测离子对优化处理，优化后的条件参数见表。表种成分及内标的质谱条件化合物母离子（犿狕）子离子（犿狕）芍药苷 苦杏仁苷 阿魏酸 藁本内酯 羟基红花黄色素 原儿茶酸 对照品溶液、内标溶液的制备精密称量种标准品：羟基红花黄色素 、苦杏仁苷 、芍药苷 、阿 魏 酸 、藁 本 内 酯 ，分别用甲醇溶解在 容量瓶中并定容，用甲醇梯度稀释至所需浓度。准确称取原儿茶酸 ，用甲醇溶解在 容量瓶中并定容，取内标储备液适量，再用甲醇稀释，得最终质量浓度为 的内标溶液。样品的处理取大鼠组织样本 ，加入生理盐水 制成匀浆液，置于 管中。加入 的甲醇和 内标进行萃取，振荡 后，离心 ，吸取上层萃取液置于 管中，置于通风橱中氮气吹干。用 甲醇溶解残留物，混匀后以 离心 ，膜过滤器过滤准备进样。质控样品的制备取空白组织按“”项下操作，制备含羟基红花黄色素、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、藁本内酯的低浓度（、）、中浓度（、）、高浓度（、）质量控制（，）样品用于组织分布研究。结果 方法学考察 专属性取空白肝组织样品，加有混标溶液的空白肝组织样品，以及灌胃 后的肝组织样品，按照“”项下生物样品处理方法处理后，按“”项下色谱条件进样。结果表明该方法专属性良好，空白组织中的内源性成分不干扰待测成分的检测。见图。标准曲线和线性范围取空白组织样品，按 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 注：空白组织；空白组织加对照品；实测样品；苦杏仁苷；芍药苷；羟基红花黄色素；阿魏酸；藁本内酯；原儿茶酸图种成分和内标的专属性色谱图照“”项下方法处理，加入个不同浓度的混标溶液，最后每个浓度样品平行进样次。以各分析物的溶液浓度为横坐标（狓），分析物与内标峰面积的比值为纵坐标（狔），进行线性回归，制作标准曲线。结果表明，种成分在各自线性范围内线性关系良好，满足体内药物分析方法的要求。见表。准确度和精密度取空白组织样品按“”项下方法处理，制备高、中、低个不同浓度的 样品各份，在同日内连续进样次计算日内精密度，连续测定计算日间精密度。见表。结果表明，种成分在各组织中的准确度和精密度均小于，符合生物样品测试要求。提取回收率和基质效应取空白组织样品，加入高、中、低个浓度的混标溶液，按“”项下方法处理，进样分析得到各分析物的色谱峰面积；另取空白组织样品按“”项下方法处理后，加入与上述浓度相同的混标溶液，同法操作得到各分析物的色谱峰面积；再取与上述浓度相同的混标溶液直接进样分析，得到各分析物的色谱峰面积。以“”计算回收率，以“”计算基质效应。见表。结果显示，种成分在各组织中的提取回收率为 ，均小于，基质效应为 ，均小于，符合生物样品测试要求。表组织中种成分的回归方程、相关系数、定量下限和线性范围化合物组织标准曲线方程狉值定量下限（）线性范围（）苦杏仁苷心狔 狓 肝狔 狓 脾狔 狓 肺狔 狓 肾狔 狓 脑狔 狓 芍药苷心狔 狓 肝狔 狓 脾狔 狓 肺狔 狓 肾狔 狓 脑狔 狓 阿魏酸心狔 狓 肝狔 狓 脾狔 狓 肺狔 狓 肾狔 狓 脑狔 狓 藁本内酯心狔 狓 肝狔 狓 脾狔 狓 肺狔 狓 肾狔 狓 脑狔 狓 羟基红花黄色素心狔 狓 肝狔 狓 脾狔 狓 肺狔 狓 肾狔 狓 脑狔 狓 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 表组织中种成分的精密度、准确度、提取回收率和基质效应（珚狓狊，狀）化合物组织浓度（）精密度日内日间准确度日内日间提取回收率基质效应苦杏仁苷心 肝 脾 肺 肾 脑 芍药苷心 肝 脾 肺 肾 脑 阿魏酸心 肝 脾 肺 肾 脑 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 续表化合物组织浓度（）精密度日内日间准确度日内日间提取回收率基质效应藁本内酯心 肝 脾 肺 肾 脑 羟基红花黄色素心 肝 脾 肺 肾 脑 稳定性取大鼠空白组织按“”项下方法处理，配置高、中、低个浓度的个重复 样品，考察在室温放置、冰箱放置个月、冻融次条件下的稳定性。结果表明，各样品在种条件下 值均小于，符合生物样品测定要求。见表。表组织中种成分的稳定性（狀）化合物组织浓度（）室温 个月次冻融循环苦杏仁苷心 肝 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 续表化合物组织浓度（）室温 个月次冻融循环苦杏仁苷脾 肺 肾 脑 芍药苷心 肝 脾 肺 肾 脑 阿魏酸心 肝 脾 肺 肾 脑 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 续表化合物组织浓度（）室温 个月次冻融循环藁本内酯心 肝 脾 肺 肾 脑 羟基红花黄色素心 肝 脾 肺 肾 脑 组织分布结果大鼠灌胃 后，被测成分在 模型组大鼠体内不同时间点各组织中的浓度见图。结果显示，各成分在组织中 或左右快速达到最高浓度。藁本内酯在各组织中均有分布，存在时间长，肝、肾组织中浓度较高，脑中也有较高分布。阿魏酸在肾组织中浓度最高，肝组织次之，脾、肺、心组织中浓度较低，存在时间短，脑组织中未见分布。苦杏仁苷在肺组织具有较高分布比例，肾组织中浓度最高，心、肝、脾组织浓度较低，脑组织中可见分布。芍药苷在肝、脾、肺组织浓度较高，肾组织中浓度最高，心、脑组织中浓度较低，脑组织中可见分布。羟基红花黄色素在肝、脾、肺组织浓度较高，肾组织中浓度最高，心组织后未见分布，脑组织中可见分布。讨论本研究结果表明，经灌胃给药后各成分可快速吸收并分布至组织内，在给药 后多数组织中的成分基本代谢完全。藁本内酯是川芎和当归主要的挥发油成分，分子 量小，穿透力强，能通过血脑屏障，在体内分布广 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 图种主要成分的组织分布特征泛，肝脏是其主要的代谢器官，脑组织中有较高分布，具有抗氧化、抗炎、降低血脑屏障通透性等多种药理活性，是 治疗缺血性脑卒中的重要物质基础。研究 表明，藁本内酯通过下调大鼠水通道蛋白以及紧密连接蛋白 和 的表达水平，降低血脑屏障通透性，发挥治疗脑缺血的功效。藁本内酯还可以通过激活 信号通路、抑制 通路减少氧化应激反应，减少脑梗死体积，发挥神经保护作用。研究表明藁本内酯可能透过血脑屏障，发挥对脑缺血的治疗作用。阿魏酸是川芎和当归活血祛瘀生新的主要活性成分，具有很强的抗氧化活性和抗血栓作用，可用于治疗心脑血管疾病，保护神经细胞损伤等。肾脏是其主要的代谢器官，在除肝、肾的组织中分布较少，存在时间短，且难以透过血脑屏障，说明阿魏酸在体内吸收、分布、消除快，起效迅速。羟基红花黄色素和苦杏仁苷是桃仁、红花发挥活血化瘀功效的主要活性成分，在各组织中均有分布，其中肝、肾、肺组织中浓度较高，说明其对血流丰富的组织具有亲和性。其发挥药理作用的机制涉及抗氧化、抗血栓、保护心脑血管等。其中苦杏仁苷在肺部浓度较高，可能与桃仁镇咳平喘的药理作用有关。白芍养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛，其主要活性成分芍药苷在体内分布广泛，在各组织中浓度均较高，其中肝、脾、肺组织中浓度最高，可能与白芍养血益阴柔肝的功效有关，有药理研究 表明，芍药苷可以调节血虚肝郁模型大鼠的信号传导，通过抗炎，防止血小板凝聚、自由基损伤等途径发挥柔肝解郁的作用。中医学认为，脑卒中是由于肝风内动、肝阴虚所致，脑卒中的发生与肝密切相关，然而这种效应机制是否与脑缺血的治疗有关仍需要进一步研究。本研究首次建立了 同时测定 中种主要成分在大鼠组织中的含量分析方法，并研究了口服 后，种主要成分在脑缺血再灌注模型大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑组织中的分布情况，种成分在体内吸收迅速，在不同时间点的器官的分布趋势存在较大差异。参考文献：韩岚，季兆洁，陈卫东，等桃红四物汤含药血清对缺糖缺氧损伤 细胞的保护作用安徽中医药大学学报，（）：王飞龙，韩岚，樊玲，等桃红四物汤对实验性脑缺血大鼠血清中 ，的影响中国实验方剂学杂志，（）：吴欢茹，韩岚，彭代银，等脑缺血再灌注大鼠海马区神经营养因子的表达及桃红四物汤的干预安徽中医药大学学报，（）：，（）：，：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 ，（）：李双双，郭春燕桃红四物汤化学成分及药理作用研究进展神经药理学报，（）：孙浠哲，吴倩倩，马文保，等中药药代动力学研究进展河北中医药学报，（）：段贤春基于网络药理学与转录组学探索桃红四物汤治疗缺血性中风主要物质基础及作用机制合肥：安徽中医药大学，王慧卓，彭代银，陈卫东，等 鉴定大鼠血浆中桃红 四 物 汤 有 效 成 分 安 徽 中 医 药 大 学 学 报，（）：，（）：，犻 狀狏 犻 狋 狉 狅 ，（）：，：，犻 狀狏 犻 狋 狉 狅 犻 狀狏 犻 狏 狅 ，（）：，（）：杨玉妃，谢冰晶，黄瑞林大鼠口服苦杏仁苷组织分布和血浆药物代谢动力学研究 按 摩 与康 复医 学，（）：朱映黎，张建军，王景霞，等芍药苷对血虚肝郁证模型大鼠海马 含量及其合成与水解酶的影响中华中医药杂志，（）：（收稿日期：）犜 犻 狊 狊 狌 犲犇 犻 狊 狋 狉 犻 犫 狌 狋 犻 狅 狀狅 犳 狋 犺 犲犉 犻 狏 犲犕 犪 犻 狀犆 狅 犿 狆 狅 狀 犲 狀 狋 狊狅 犳犜 犪 狅 犺 狅 狀 犵犛 犻 狑 狌犇 犲 犮 狅 犮 狋 犻 狅 狀犻 狀犪犚 犪 狋犕 狅 犱 犲 犾 狅 犳犆 犲 狉 犲 犫 狉 犪 犾 犐 狊 犮 犺 犲 犿 犻 犪犚 犲 狆 犲 狉 犳 狌 狊 犻 狅 狀 ，（，；，；，）犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋犗 犫 犼 犲 犮 狋 犻 狏 犲 （，）（）犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊 （），（），犚 犲 狊 狌 犾 狋 狊 ，；，；犆 狅 狀 犮 犾 狌 狊 犻 狅 狀 ，犓 犲 狔狑 狅 狉 犱 狊 ；：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月