miR-101-5p通过靶向ATAD2抑制肺鳞癌细胞的侵袭.pdf

第 卷第期年月西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)J o u r n a l o fX ia nJ i a o t o ngU n i v e r s i ty(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l N o M a r 本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版基础研究m i R p通过靶向A T A D 抑制肺鳞癌细胞的侵袭刘浩杰,王德才,李树斌(新乡市中心医院/新乡医学院第四临床学院心胸外科,河南新乡 )摘要:目的探讨微小R NA p(m i R p)影响肺鳞癌(l u n gs q u a m o u s c e l l c a r c i n o m a,L U S C)细胞增殖、侵袭的分子机制.方法从癌症基因组图谱(T h eC a n c e rG e n o m eA t l a s,T C G A)数据库下载肺鳞癌T C GA L U S C的m i R NA成熟体表达数据和总R NA的测序数据,鉴定差异表达基因;分析富集于A TA D 的信号通路.培养L U S C细胞,q R T P C R检测细胞中m i R p和A T A D 的mR NA表达,MT T实验、克隆形成实验和侵袭实验检测m i R p对L U S C细胞增殖和侵袭的影响,流式细胞术检测A T A D 对L U S C细胞周期的影响,W e s t e r nb l o t t i n g检测A T A D 蛋白的表达.双荧光素酶实验验证m i R p能否与A T A D 靶向结合,最后通过L U S C细胞共转染o e A TA D 和m i R p模拟物(m i m i c),检测细胞增殖、克隆、侵袭能力的变化,进一步探究m i R p能否通过A T A D 调节L U S C细胞的生物学功能.结果m i R p在L U S C组织及培养L U S C细胞中显著下调.过表达m i R p的L U S C增殖和侵袭能力显著抑制.其下游调控靶基因A TA D 在L U S C中显著上调,且m i R p和A T A D 表达呈负相关,单基因富集分析(G S E A)结果显示A T A D 显著富集于细胞周期信号通路.双荧光素酶实验结果显示,m i R p靶向结合A T A D,并通过MT T和侵袭实验发现m i R p通过靶向结合A TA D 调控L U S C细胞的增殖和侵袭.结论m i R p在L U S C中低表达,m i R p通过靶向抑制A T A D 降低L U S C细胞的增殖、侵袭.关键词:微小R NA p(m i R p);A T P酶家族AAA域(A T A D);肺鳞癌(L U S C);增殖;侵袭中图分类号:R 文献标志码:AD O I:/j d y x b 收稿日期:修回日期:通信作者:李树斌,主任医师 E m a i l:l i s s b i n c o m网络出版地址:h t t p s:/l i n k c n k i n e t/u r l i d/R ()M i R p i n h i b i t s t h ep r o l i f e r a t i o na n d i n v a s i o no f l u n g s q u a m o u s c e l lc a r c i n o m ac e l l sb y t a r g e t i n gA T A D L I U H a o j i e,WANGD e c a i,L IS h u b i n(D e p a r t m e n to fC a r d i o t h o r a c i cS u r g e r y,T h eF o u r t hC l i n i c a lC o l l e g eo fX i n x i a n gM e d i c a lC o l l e g e;X i n x i a n gC e n t r a lH o s p i t a l,X i n x i a n g ,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v e T oi n v e s t iga t et h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fm i c r o RNA p(m i R p)a f f e c t i ngt h epr o l i f e r a t i o na n di n v a s i o no fl u ngsqu a m o u sc e l lc a r c i n o m a(L U S C)c e l l s M e t h o d sW ed o w n l o a d e dt h em i RNA m a t u r ee xpr e s s i o nd a t aa n dt o t a lRNAs equ e n c i ngd a t ao fT C GA L U S Cf r o m T C GAd a t a b a s et oi d e n t i fyd i f f e r e n t i a l lye xpr e s s e dge n e s T h e s ign a lpa t h w aye n r i c h e d i nA T AD w a s a n a lyz e d T h emRNAe xpr e s s i o n s o fm i R pa n dA T AD i nt h eL U S Cc e l l sw e r ed e t e c t e dbyqR T P C R T h ee f f e c t so fm i R po nt h epr o l i f e r a t i o na n d i n v a s i o no fL U S Cc e l l sw e r ed e t e c t e dbyMT Ta s s ay,c l o n i nga s s ay,a n di n v a s i o na s s ay T h ee f f e c t so fA T AD o nt h ec e l l cyc l eo fL U S Cc e l l sw e r ed e t e c t e dbyf l o wcyt o m e t ry W e s t e r nb l o t t i ngw a su s e dt od e t e c t t h ee xpr e s s i o no fA T AD pr o t e i n D o u b l el u c i f e r a s ee xpe r i m e n tw a su s e dt ov e r i fyw h e t h e rm i R pc o u l db i n dt oA T AD t a rge t F i n a l ly,w ed e t e c t e dt h ec h a nge si nt h epr o l i f e r a t i o n,c l o n i nga n di n v a s i o na b i l i tyo fL U S Cc e l l sbyc o t r a n s f e c t i o nw i t ho e A T AD a n dm i R pm i m i c,a n df u r t h e re xpl o r e dw h e t h e rm i R pc o u l dr egu l a t et h eb i o l ogi c a l f u n c t i o no fL U S Cc e l l st h r o ughA T AD R e s u l t sT h em i R pw a ss ign i f i c a n t lyd o w n r egu l a t e di nL U S Ct i s s u e sa n dc e l l s O v e r e xpr e s s i o no fm i R pc o u l ds ign i f i c a n t lyi n h i b i tt h epr o l i f e r a t i o na n di n v a s i o no fL U S Cc e l l s A T AD,i t sd o w n s t r e a mr egu l a t o ryt a rge tge n e,w a s s ign i f i c a n t lyupr egu l a t e di nL U S C,a n dm i R pa n d A T AD e xpr e s s i o n s w e r ei n v e r s e lyc o r r e l a t e d G S E A e n r i c h m e n tr e s u l t ss h o w e d t h a t A T AD w a ss ign i f i c a n t lye n r i c h e di nt h ec e l lcyc l es ign a lpa t h w ay T h ed o u b l el u c i f e r a s ee xpe r i m e n tpr o v e dt h a tm i R pt a rge t e dA T AD,a n dt h er e c o v e rye xpe r i m e n t s h o w e dt h a tm i R pr egu l a t e dt h epr o l i f e r a t i o na n di n v a s i o no f期刘浩杰,王德才,李树斌 m i R p通过靶向A T A D 抑制肺鳞癌细胞的侵袭本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版L U S Cc e l l sbyt a rge t i ngA T AD C o n c l u s i o nI nt h i ss t u dy,w ef o u n dt h a tm i R ph a dl o we xpr e s s i o ni nL U S C,a n dt h a t m i R pd e c r e a s e dt h epr o l i f e r a t i o na n di n v a s i o no fL U S C c e l l sbyt a rge t e di n h i b i t i o no fA T AD K E Y WO R D S:m i c r o RNA p(m i R p);A T P a s ef a m i lyAAA d o m a i n c o n t a i n i ng(A T AD);l u ngsqu a m o u s c e l l c a r c i n o m a(L U S C);pr o l i f e r a t i o n;i n v a s i o n肺鳞状细胞癌(l u n gs q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a,L U S C)是世界第二常见的肺部恶性肿瘤,占非小细胞肺癌(n o n s m a l lc e l l l u n gc a r c i n o m a,N S C L C)病例的 ,每年致全球约 万人死亡 .L U S C的治愈率较低,年生存率仅为.针对L U S C的治疗主要是手术以及放化疗,但对晚期患者的疗效有限,而早期诊断和早期治疗是改善L U S C患者生存状态的有效途径.而目前F D A批准的靶向药 物 治 疗,如 表 皮 生 长 因 子 受 体(e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r,E G F R)突变或EML A L K融合靶向治疗,主要适用于肺腺癌(l u n ga d e n o c a r c i n o m a,L UA D),而不适用于L U S C患者.因此,寻找新的生物标志物应用于L U S C早期诊断和靶向治疗,有助于改善L U S C患者的生存现状.M i c r o R NA s(m i R NA s)是一种小的非编码R NA(约 个核苷酸),通过与靶基因的 非翻译区(u n t r a n s l a t e dr e g i o n,UT R)不完全结合,诱导翻译抑制调节靶基因的表达 .大量证据表明m i R NA s的失调与多种癌症的发生和转移有关,m i R NA s可能是癌症潜在的治疗靶点.已有研究表明,m i R p通过靶向抑制C C R 表达,降低了A 细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而m i R p则在三阴性乳腺癌中通过调控MA P K 参与了乳腺癌患者的疾病进展,同时m i R p 通过靶向T R A F 抑制人胃癌细胞的迁移和侵袭能力.其中,m i R p作为m i R NA家族中的重要一员,对多种癌症具有重要调节作用.有研究发现,m i R p通过靶向C X C L 抑制宫颈癌细胞的生长和转移.m i R p的异位表达减弱了乳腺癌细胞的侵袭性表型,如增殖、迁移和侵袭.在肾透明细胞癌(c l e a rc e l l r e n a lc e l lc a r c i n o m a,c c R C C)中,m i R p的表达导致c c R C C细胞周期阻滞和凋亡.但m i R p在L U S C中作用机制并不清楚.因此,本研究通过生物信息学分析及体外实验探究m i R p/AT A D 轴调控L U S C的机制,并为寻求临床治疗的有效靶点提供数据支持和参考.材料与方法细胞培养与转染正常人肺上皮细胞系B E A S B(C )购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;L U S C细胞系H (C C C C )、H (C C C C )购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心;L U S C细胞系S K M E S (C )、H (C )购自中国典型培养物保藏中心细胞库.将各细胞系接种于含有青霉素(I n v i t r o g e n英杰公司,美国)和 m L/L胎牛血清(f e t a lb o v i n es e r u m,F B S)的R PM I 培养基(大岛生物公司,G i b c o,美国),于、m L/LC O恒温箱中培养.m i R pm i m i c、m i m i c N C、m i R pi n h i b i t o r、i n h i b i t o r N C、o e A T A D、o e N C、s i A T A D、s i N C购于上海吉玛制药技术有限公司.根据参考说明书使用L i p o f e c t a m i n e (I n v i t r o g e n英杰公司,美国)转染模拟物、小干扰R NA(s m a l l i n t e r f e r i n gr i b o n u c l e i ca c i d,s i R NA)、抑制剂(i n h i b i t o r)、重组载体和各自阴性对照至L U S C细胞中.生物信息学分析从癌症基因组图谱(T h eC a n c e rG e n o m eA t l a s,T C GA)(h t t p s:/p o r t a l g d c c a n c e r g o v/)下 载T C GA L U S C中 的m i R NA成 熟 体 表 达 数 据(总m i R NA数据癌组织样本 个,癌旁组织样本 个)和总R NA的测序数据(总R NA测序数据癌组织样本 个,癌旁组织样本 个),基于下载数据对m i R p表达进行分析,使用W i l c o x o n法进行检验.利用R包e d g e R,以正常组织样本为对照,对肿瘤组织中差异表达的mR NA进行分析,引用负二项分布模型检验,l o g(F o l dC h a n g e)绝对值大于,校正P值(Pa d j)小于 的基因被确定为差异表达的mR NA,通过m i R T a r B a s e和T a r g e t S c a n数据库对m i R p进行靶基因预测,并与上调的差异表达的mR NA取交集,获得与m i R p具有靶向结合位点的差异mR NA,利用相关性分析最终确定获得靶基因.单基因富集分析(g e n es e te n r i c h m e n ta n a l y s i s,G S E A),以AT A D 表达的中位值将样本分为高表达组和低表达组,从M S i g D B下载K E G G通路的基因集,以低表达组为对照,分析高低表达组的各通路基因集在两组间表达差异,采用软件G S E A对西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版各通路基因集在两组中表达进行分析,选择富集评分绝对值大于,校正P值小于 的基因集进行研究,研究靶基因在肿瘤发生发展中的作用机制.实时荧光定量聚合酶链式反应用T r i z o l(I n v i t r o g e n公 司,美 国)分 别 从H 、H 、S K ME S 和H 细胞中提取总R NA.根据制造商的指示,使用P r i m e S c r i p tR T试剂盒T a K a R a(宝)生物股份有限公司,日本 合成c D NA,随后使用S Y B RP r e m i xE xT a qTMI I试剂盒T a K a R a(宝)生物股份有限公司,日本 在R o c h eL C 实时 定 量 聚 合 酶 链 反 应 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n,P C R)系统(罗氏(R o c h e)公司,瑞士 进行q R T P C R.实验所用引物见表.反应条件:m i n,个循环,s,s,s.AT P酶家族AAA域(AT P a s e f a m i l yAAAd o m a i n c o n t a i n i n g,AT A D)以甘油醛 磷酸脱氢酶(g l y c e r a l d e h y d e p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e,GA P DH)为内参,m i R p以U 为内参分别归一化处理.结果用 C t值比较对照组和实验组的目的基因相对表达差异,实验重复次.表q R T P C R检测中m i R p和A T A D 引物序列T a b T h ep r i m e rs e q u e n c eo fm i R pa n d A T A D f o rq R T P C R基因名称引物序列m i R p正向引物:G C C G G C AG C AT TAT G T C AAT 反向引物:G C C AG C AG C T T GAT G T C AAT GA P DH正向引物:G G G A G C C A A A A G G G T C A T C A T C T C 反向引物:C C AT G C C AG T GAG C T T C C C G T T C U 正向引物:C T C G C T T C G G G C AG C A C A 反向引物:AA C G C T T C A C GAAT T T G C G T ATA D 正向引物:A A G G A A G T T G A A A C C T A C C A C C G 反向引物:G C AAG T T G C T C C G T TAT T T C C A MT T检测将经过转染的S K ME S 细胞和H 细胞分别用含 m L/LF B S的培养液配成单细胞悬液并接种于 孔板(/孔).细胞培养、h时,每孔加 L四甲基偶氮唑蓝(m e t h y l t h i a z o l y l t e t r a z o l i u m,MT T)溶液.孵育h后,弃去上清液加 LDM S O溶液溶解F o r m a z a n,使用酶标仪在 n m处测定样品的吸光度,实验重复次.克隆形成实验分别将转染后的S K ME S 细胞和H 细胞以 个/孔接种于孔培养板中,在.m L/LC O培养周,每d更换次培养基.当肉眼可见细胞集落时,停止培养.用 g/L多聚甲醛(赛默飞世尔科技公司,美国)固定细胞集落,用g/L结晶紫(赛默飞世尔科技公司,美国)染色 m i n.最后计算细胞集落数,实验重复次.W e s t e r nb l o t t i n g检测裂解转染处理后的S K ME S 细胞,提取总蛋白,蛋白质定量试剂盒(B C A法)测定蛋白浓度.每孔上样 m g,S D S P AG E电泳后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(p o l y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d e,P V D F)膜.室温 g/L脱脂牛奶封闭h,AT A D 兔单克隆抗体(,A b c a m,英国)和 a c t i n兔单克隆抗体(,a b c a m,英 国)下 孵 育 过 夜,用T B S T溶液在室温下洗膜m i n,冲洗次.辣根过氧化物酶(h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e,H P R)偶联的二抗山羊抗兔I g G(,A b c a m,英国)孵育h,E C L化学发光,拍照观察.实验重复次.T r a n s w e l l侵袭实验转染后的S K ME S 细胞和H 细胞以/孔接种于用基质胶包被的T r a n s w e l l上室中,加入无血清培养基,下室加 L含 m L/LF B S的R PM I 培养基(G i b c o大岛生物公司,美国)作为化学诱导剂.于 、m L/LC O培养箱培养 h,用棉签小心擦去上腔底部膜表面上的细胞,并对膜下表面的细胞用 g/L多聚甲醛固定,g/L结晶紫染色后,显微镜下观察,拍照.双荧光素酶实验将AT A D 野生型(w i l dt y p e,WT)或突变型(m u t a n t t y p e,MUT)UT R片段亚克隆 到p m i r G L O(P r o m e g a,U S A)中,构建p m i r G L O AT A D WT和p m i r G L O A T A D MU T.将A T A D WT或MU T U T R质粒载体 与m i m i c N C或m i R pm i m i c共转染至S K ME S 细胞,海肾荧光素酶表达载体p R L T KT a K a R a(宝)生物股份有限公司,日本 作为内参.最后,通过荧光素酶测定试剂测量荧光素酶的活性.流式细胞术检测将细胞密度调整为()/m L离心后去上清.L标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育 m i n.m L/L乙醇 固定 h.用碘化丙啶(p r o p i d i u mi o d i d e,P I)染色后F A C S C a n t o流式细胞仪(B DB i o s c i e n c e s,美国)检测D NA含量,F l o w j o_V 软件分析细胞周期分布.统计学分析富集分析使用G S E A软件进行分析.所有实验数据均采用P r i s m统计学软件进行处理,计量资料采用均值标准差的形式表示,两组间比较应用t检验.P 表示差异具有统计学意义.期刘浩杰,王德才,李树斌 m i R p通过靶向A T A D 抑制肺鳞癌细胞的侵袭本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版结果m i R p在L U S C组织及细胞系中表达下调从T C GA L U S C中下载L U S C的m i R NA成熟体表达数据分析显示,m i R p在L U S C中显著下调(图 A).q R T P C R检测L U S C细胞(H 、H 、S K ME S 、H )中m i R p的表达明显低于正常人肺上皮细胞(B E A S B)(图 B),且在S K ME S 细胞中m i R p的表达最低,H 表达最高.因此,后续选择S K ME S 和H 细胞进行实验.A:m i R p表达箱线图(红色代表正常组织,绿色代表肿瘤组织);N o r m a l:正常组织;T u m o r:肺鳞癌组织.B:q R T P C R检测m i R p在正常人肺上皮细胞B E A S B和L U S C细胞系中的表达情况.与B E A S B细胞比较,P.图m i R p在L U S C组织及细胞系中表达下调F i g T h ee x p r e s s i o no fm i R pw a sd o w n r e g u l a t e d i nL U S Ct i s s u e sa n dc e l l l i n e sm i R p抑制L U S C细胞的体外增殖、侵袭为了解m i R p的表达对L U S C细胞侵袭和增殖能力的影响,分组为m i m i c N C、m i R pm i m i c、i n h i b i t o r N C、m i R pi n h i b i t o r进 行 实验.q R T P C R结果显示转染m i R pm i m i c后,S K ME S 细胞和H 细胞中m i R p表达显著,而m i R pi n h i b i t o r则相反(图 A).随后,MT T、克隆形成实验以及细胞侵袭实验检测结果显示,与对照组相比,过表达m i R p抑制S K ME S 和H 的增殖、克隆形成及侵袭能力;抑制m i R p结果则相反(图 BD).以上结果表明了m i R p抑 制L U S C细 胞 的 体 外 增 殖 和侵袭.m i R p靶向抑制A T A D 的表达进一 步 利 用R包e d g e R进 行 差 异 分 析 了 解m i R p在L U S C中的调控机制,共得到 个差异mR NA(|l o g F C|,Pa d j),其中 个下调,个上调;将上调的差异mR NA与数据库T a r g e t S c a n、m i R D B预测的m i R N A靶基因取交集,共得到 个靶基因;其中相关性分析显示,AT A D 与m i R p负相关性最强,且AT A D 在癌症组织和细胞中显著高表达(图 AE).因此,本研究选择AT A D 进一步研究.通过m i R D B数据库预测m i R p和AT A D 靶向结合位点信息(图 F);双荧光素酶实验结果也显示,过表达m i R p显著抑制WTAT A D UT R荧光素酶活性而对MUT AT A D UT R荧光酶素活性没 有影响;而且q R T P C R和W e s t e r nb l o t t i n g结果显示,过表达m i R p抑制AT A D mR NA和蛋白的表达,而抑制m i R p则促进AT A D mR NA和蛋白的表达(图 G I).A T A D 促进L U S C细胞的体外增殖、侵袭G S E A分析 结 果 显 示,细 胞 周 期 相 关 基 因 在AT A D 高 低 表 达 组 样 本 中 的 表 达 差 异 显 著(P ),且 细 胞 周 期 的 富 集 评 分 绝 对 值 最 大(|N E S|),其中对细胞周期的富集评分贡献最大的基因有HD A C、C D KN B、C D K、P KMY T、C D K、C D K(图 A).S K ME S 细 胞 和H 细 胞 分 别 分 组 为o e N C、o e AT A D、s i N C、s i AT A D,q R T P C R检测转染效率如图 B.流式细胞术检测L U S C细胞转染o e N C、o e AT A D、s i N C以及s i AT A D 结果显示,过表达AT A D 导致G/G 期细胞百分比降低,S期细胞显著聚集,加快细胞周期进展,促进细胞增殖,而抑制AT A D 表达时的结果则相反(图 C).MT T、克隆形成实验、T r a n s w e l l实验检测结果显示,过表达AT A D 能显著促进体外S K ME S 细胞和H 细胞的增殖、克隆及侵袭,敲低AT A D 则能西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版显著抑制体外S K ME S 细胞和H 细胞的增殖、克隆及侵袭能力(图 DF).以上结果表明AT A D 可诱导细胞周期从G/G 进入S期,促进细胞增殖,并促进L U S C细胞的体外增殖和侵袭.m i R p通过靶向A T A D 抑制L U S C细胞增殖与侵袭为了进一步阐述m i R p靶向结合AT A D 调控L U S C细胞 增 殖 和 侵 袭 的 分 子 机 制,共 转 染o e AT A D 和m i R pm i m i c检测S K ME S 细胞增殖、克隆、侵袭能力的变化.q R T P C R结果显示,过表达m i R p能降低AT A D 的mR NA表达,而同时过表达m i R p和AT A D 能够显著逆转m i R p对AT A D 表达的抑制作用;克隆形成实验及MT T结果显示,同时过表达m i R p和AT A D 能逆转m i R p对S K ME S 细胞克隆及增殖的抑制作用;侵袭实验结果表明,同时过表达m i R p和AT A D 能够显著逆转m i R p对S K ME S 细胞侵袭的抑制作用(图).这表明m i R p通过靶向抑制AT A D 表达从而抑制L U S C细胞的增殖、侵袭.A:q R T P C R检测m i m i c N C、m i R pm i m i c、i n h i b i t o r N C、m i R p i n h i b i t o r组细胞中m i R p的表达;B:MT T检测各组细胞增殖能力;C:细胞克隆实验检测各组细胞克隆形成能力;D:细胞侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力().与m i m i c N C组比较,P;与i n h i b i t o r N C组比较,P.图m i R p抑制L U S C细胞的体外增殖与侵袭F i g m i R p i n h i b i t e dt h ep r o l i f e r a t i o na n d i n v a s i o no fL U S Cc e l l si nv i t r o期刘浩杰,王德才,李树斌 m i R p通过靶向A T A D 抑制肺鳞癌细胞的侵袭本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版A:T C GA L U S C的mR NA的差异基因火山图(红色代表上调基因,绿色代表下调基因);B:利用两个数据库预测m i R p的靶基因与差异上调mRNA交集;C:m i R p与预测基因的相关性分析;D:A TA D 表达箱线图(红色代表在正常组织中,绿色代表在肿瘤组织中);E:q R T P C R检测A T A D 在正常人肺上皮细胞B E A S B和L U S C细胞系中的表达;F:m i R D B数据库预测m i R p和A T A D 的结合位点;G:双荧光素酶活性检测m i R p和A T A D 的靶向结合情况;H、I:q R T P C R、W e s t e r nb l o t t i n g检测过表达及抑制m i R p表达时A T A D mR NA及蛋白的表达.与B E A S B组细胞比较,P;与m i m i c N C组比较,P;与i n h i b i t o r N C组比较,&P.图m i R p靶向结合A T A D 及抑制A T A D 表达F i g m i R pb o u n dt oA T A D a n d i n h i b i t e dA TA D e x p r e s s i o n讨论L U S C是最常见的恶性肿瘤之一,是癌症死亡的主要原因,并且是肺癌最常见的组织学亚型之一.许多研究表明,来自人类基因组的非编码R NA具有功能性,在各种细胞活动中发挥着关键作用,并且可作为生物标志物或治疗靶标.本研究探讨m i R p在L U S C进展中的作用及机制.m i R p作为一个重要的m i R NA对多种癌症都有重要的调节作 用,研 究 发 现m i R p在 肝 癌、宫 颈 癌、N S C L C等癌 症中发挥重 要作用,但并未 见m i R p在L U S C中的相关报道.本研究对T C GA L U S C的m i R NA表达谱进行分析,发现m i R p在L U S C患者中低表达;还发现m i R p的表达与L U S C细胞的增殖、侵袭有关,首次表明了m i R p表达与L U S C进展之间的相关性.进一步对m i R p的下游靶基因进行预测,发现m i R p能够靶向结合AT A D 进而发挥调控作用.有研究证明,AT A D 可以促进宫颈癌 细 胞 增 殖、侵 袭 和 迁 移;另 有 研 究 发 现,AT A D 过表达促进结直肠癌细胞的转移、分化、侵袭,并且与预后相关;同时,AT A D 在卵巢癌中高表达,提示预后 不良.这 些研究发现 与本研究AT A D 促进癌症发展的趋势保持一致.西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版A:G S E A通路富集分析A T A D 调节的信号通路;B:q R T P C R检测S K ME S 细胞和H 细胞o e N C、o e A TA D、s i N C、s i A T A D 中A T A D 的mR NA表达;C:A T A D 对L U S C细胞细胞周期的影响;D:MT T检测过表达或敲低AT A D 表达后S K ME S 细胞和H 细胞增殖能力变化;E:细胞克隆实验检测过表达或敲低A TA D 表达后S K ME S 细胞和H 细胞克隆形成能力的变化;F:侵袭实验检测过表达或敲低A TA D 表达后S K ME S 细胞和H 细胞的侵袭能力的变化().与o e N C组相比,P;与s i N C组相比,P.图A T A D 诱导细胞周期从G/G 进入S期,并促进L U S C细胞的体外增殖、侵袭F i g A TA D i n d u c e dt h ec e l lc y c l ef r o m G/G t oSp h a s ea n dp r o m o t e dt h ep r o l i f e r a t i o na n di n v a s i o no fL U S Cc e l l si nv i t r o期刘浩杰,王德才,李树斌 m i R p通过靶向A T A D 抑制肺鳞癌细胞的侵袭本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版A:q R T P C R检测共转染o e A T A D 和m i R pm i m i c时,AT A D 的mR NA表达;BD:M