生物化学与分子生物学八课件25市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

目目 录录重组重组DNADNA技术技术Recombinant DNA Technology第二十四章第二十四章第1页目目 录录克隆克隆(clone)来自同一始祖相同副本或拷贝集合。来自同一始祖相同副本或拷贝集合。获取同一拷贝过程称为克隆化获取同一拷贝过程称为克隆化(cloning)，即，即无性繁殖。无性繁殖。技术水平：分子克隆技术水平：分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆(DNA cloning)细胞克隆细胞克隆器官（或组织）克隆器官（或组织）克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）第2页目目 录录重重 组组 DNA技技 术术（recombinant DNA technology）又又称称分分子子克克隆隆（molecular cloning）或或DNA克克隆隆（DNA cloning）或或基基因因克克隆隆（gene cloning)技技术术，是是指指在在体体外外利利用用酶酶学学方方法法将将目目标标DNA片片段段与与能能自自主主复复制制遗遗传传元元件件（又又叫叫载载体体）连连接接，形形成成重重组组DNA分分子子，进进而而在在受受体体细细胞胞中中复复制制、扩扩增增，从从而而取取得得单单一一DNA分分子大量拷贝。子大量拷贝。克克隆隆目目标标基基因因后后，针针对对该该基基因因进进行行特特定定蛋蛋白白质质或或多多肽肽制制备备以以及及定定向向改改造造基基因因结结构构所所用用方方法法及及相相关关工工作作统统称称为为基基因因工工程程（genetic engineering）。所所以以，重重组组DNA技术又称为基因工程技术。技术又称为基因工程技术。第3页目目 录录*重组重组DNA技术发展简史技术发展简史1865年年 G.J.Mendel豌豆杂交试验豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery肺炎球菌转化试验肺炎球菌转化试验1972年年 P.P.Berg Berg 构建第一个重组构建第一个重组DNA分子分子(猿猴病毒猿猴病毒猿猴病毒猿猴病毒DNADNA和和和和 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNA)DNA)19731973年年年年 S.CohenS.Cohen首次将首次将首次将首次将DNADNA片段与质粒连接，并转化入片段与质粒连接，并转化入片段与质粒连接，并转化入片段与质粒连接，并转化入E.coliE.coli1977年年 美美国国南南旧旧金金山山由由博博耶耶和和斯斯旺旺森森建建立立世世界界上上第第一一家家遗遗传传工工，程企业，专门应用重组程企业，专门应用重组DNA技术制造医学上主要药品技术制造医学上主要药品1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素工厂技术生产胰岛素工厂1997年年 英国罗林研究所成功地克隆了英国罗林研究所成功地克隆了“多莉多莉”羊羊Mendel Paul BergIan Wilmut and“Dolly”第4页目目 录录第第 一一 节节重组重组DNADNA技术中惯用技术中惯用工具酶工具酶 Frequently Used Enzymes in Recombinant DNA Technology第5页目目 录录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNA连接酶连接酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶反转录酶反转录酶末端脱氧核苷酰转移酶（末端转移酶）末端脱氧核苷酰转移酶（末端转移酶）DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段 Taq DNA聚合酶聚合酶多核苷酸激酶多核苷酸激酶 工具酶在重组工具酶在重组DNADNA技术中含有技术中含有特殊用途特殊用途第6页目目 录录重组重组DNA技术中惯用工具酶技术中惯用工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化DNA中相邻5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基反转录酶反转录酶合成cDNA；替换DNA聚合酶I进行填补，标识或DNA序列分析末端脱氧核苷末端脱氧核苷酰转酰转移移酶酶在在3羟基末端进行同聚物加尾羟基末端进行同聚物加尾DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针；分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针；DNA序列分析；填补序列分析；填补3末端末端Klenow片段片段又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而无53外切活性。惯用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标识等Taq DNA聚合聚合酶酶惯用于PCR；产物3末端带有A，可用于T-A克隆多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标识探针第7页目目 录录一、限制性核酸内切酶用于切割一、限制性核酸内切酶用于切割DNA定义定义:限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA特特异异序序列列,并并在在识识别别位位点点或或其其周周围围切切割割双双链链DNA一一类类内内切切酶酶。限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶是是重组重组DNA技术中主要工具酶。技术中主要工具酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H第8页目目 录录分分类类：依依据据酶酶识识别别切切割割特特征征、催催化化条条件件及及是是否否含含有有修修饰饰酶酶活性可分为活性可分为、型三大类型三大类（基因工程技术中惯用（基因工程技术中惯用型）型）型型：属属于于复复合合功功效效酶酶，兼兼有有修修饰饰和和切切割割DNA两两种种特特征征，需需要要Mg2+、ATPs-腺腺苷苷酰酰甲甲硫硫氨氨酸酸作作为为催催化化辅辅因因子子，在在DNA降降解解时时伴伴随随有有ATP水水解解。即即它它含含有有核核酸酸内内切切酶酶、甲甲基基化化酶酶、ATP酶酶和和DNA解解旋旋酶酶四四种种活活性性。若若识识别别位位点点上上两两条条DNA链链均均未未甲甲基基化化，则则行行使使内内切切酶酶功功效效，并并在在切切割割DNA同同时时或或之之后后转转变变为为ATP酶酶；若若位位点点上上只只有有1条条链链被被甲甲基基化化则则发发挥挥修修饰饰功功效效，使使另另一一条条链链也也甲甲基基化化；若若位位点点上上两两条条链链均均甲甲基基化化就就与与位位点点解解离离。其其显显著著特特点点是是识识别别位位点点和和切切割割部部位位不不一一致致，无无固固定定切切割割位位点点，普普通通在在识识别别位位点点以以外外1kb（不不少少于于400bp）到到几几kb（可可多多达达7kb）处处随随机机切切割割，不不产产生生特特异片段，故在基因重组中没有应用价值。异片段，故在基因重组中没有应用价值。型型：与与型型酶酶特特征征类类似似，也也有有甲甲基基化化功功效效，但但无无ATP酶酶和和DNA解解旋旋酶酶活活力力；不不一一样样是是它它能能在在DNA链链上上特特异异位位点点切切割割，其其切切割割位位点点在在识识别别位位点以外，对基因工程意义也不大。点以外，对基因工程意义也不大。第9页目目 录录限制酶作用限制酶作用与与甲甲基基化化酶酶共共同同组组成成细细菌菌限限制制修修饰饰系系统统，限限制制外外源源DNA，保保护护本本身身DNA，犹犹似似高等动物免疫系统。高等动物免疫系统。型：就是通常指型：就是通常指DNA限制性内切酶，在基因工程限制性内切酶，在基因工程技术中惯用。特点：分子量小，仅需技术中惯用。特点：分子量小，仅需Mg2+作为催化反作为催化反应辅助因子，它们能识别双链应辅助因子，它们能识别双链DNA特异次序，并在这特异次序，并在这个次序内进行切割，产生特异个次序内进行切割，产生特异DNA片段。片段。类酶识别类酶识别序列特点为序列特点为回文结构，普通为回文结构，普通为46bps（有些为（有些为8或或8个个以上碱基序列）以上碱基序列），且富含，且富含GC。GGATCCCCTAGG第10页目目 录录第一个字母取自产生该酶细菌属名，用大写斜体；第一个字母取自产生该酶细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌种名，用小写斜体；第二、第三个字母是该细菌种名，用小写斜体；第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；用罗马数字表示发觉先后次序。用罗马数字表示发觉先后次序。命名命名Hin d 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株第三种酶株第三种酶（一）重组（一）重组DNA技术中通常使用技术中通常使用型限制酶型限制酶 第11页目目 录录E=Escherichia，埃希氏菌属，埃希氏菌属co=coli，大肠杆菌菌种，大肠杆菌菌种R=RY13，菌株名，菌株名I=第一个被分离到内切酶第一个被分离到内切酶命名命名EcoR 属属 种种 株株 序序第12页目目 录录（二）（二）型限制性内切酶含有一些共性和特征型限制性内切酶含有一些共性和特征1.含有特定识别和切割位点含有特定识别和切割位点 限制性内切酶限制性内切酶识别位点识别位点限制性内切酶限制性内切酶识别位点识别位点Apa IGGGCCCCCCGGGSma ICCCGGGGGGCCCBamH IGGATCCCCTAGGSau 3A IGATCCTAGPst ICTGCAGGACGTCNot IGCGGCCGCCGCCGGCGEcoR IGAATTCCTTAAGSfi IGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG II II型限制性内切酶识别位点举例（型限制性内切酶识别位点举例（示切割位点）示切割位点）第13页目目 录录2.识别核苷酸序列通常为回文结构（识别核苷酸序列通常为回文结构（palindrome）第14页目目 录录第15页目目 录录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口黏端切口黏端切口3.切割双链切割双链DNA分子后产生黏端或平端分子后产生黏端或平端（sticky end）（blunt end）第16页目目 录录第17页目目 录录同尾酶同尾酶（isocaudarner）有有些些限限制制性性内内切切酶酶即即使使识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同黏黏端端，这这么么酶酶彼彼此此互互称称为为同同尾尾酶酶。这两个相同黏端称为这两个相同黏端称为配伍末端配伍末端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A4.不一样酶能够产生一样末端不一样酶能够产生一样末端 第18页目目 录录GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+BstCCCGGGGGGCCCCCCCGGCCGGG G+XmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+Sma能能识识别别同同一一序序列列（切切割割位位点点可可同同或或不不一一样样）但但起起源源不不一样两种酶互称同工异源酶（一样两种酶互称同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶。）或同裂酶。5.不一样酶能够识别同一个序列不一样酶能够识别同一个序列 第19页目目 录录6.6.切割会受其它原因影响切割会受其它原因影响 限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化序列。特异碱基甲基化序列。缓冲液或环境温度也会影响一些酶特异性。缓冲液或环境温度也会影响一些酶特异性。比如，比如，EcoR I在正常情况下识别在正常情况下识别“-GAATTC-”序列，但在甘油浓度大于序列，但在甘油浓度大于5%（v/v）或反应）或反应温度较低时识别序列可变为温度较低时识别序列可变为“-AATT-”或或“-嘌嘌呤嘌呤呤嘌呤AT嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活性，这种现象称为星号活性（star activity），以），以EcoR I*表示。表示。第20页目目 录录二、二、DNA连接酶用于催化连接酶用于催化DNA片段连接片段连接 DNA连连接接酶酶（DNA ligase）：催催化化两两个个相相邻邻3-OH和和5-磷磷酸酸基基团团形形成成3，5-磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而使使DNA片片段段或或单单链链断裂形成缺口连接起来。断裂形成缺口连接起来。连接酶作用机制连接酶作用机制第21页目目 录录BamH I第22页目目 录录 1.大肠杆菌染色体编码大肠杆菌染色体编码 DNA连接酶连接酶 需需NAD+作为辅因子作为辅因子 2.大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体DNA编码编码T4 DNA连接酶连接酶 需需ATP作为辅因子作为辅因子 DNA连接酶起源连接酶起源第23页目目 录录三、重组三、重组DNA 技术中还需使用其它惯用技术中还需使用其它惯用工具酶工具酶（一）（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端磷酸基团碱性磷酸酶能去除核酸分子末端磷酸基团（二）反转录酶以（二）反转录酶以RNA为模板合成为模板合成cDNA（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以组成末端加尾以组成黏黏性末端性末端（四）（四）DNA聚合酶聚合酶I主要用于合成主要用于合成DNA（五）（五）DNA聚合酶聚合酶I大片段保留了有用酶活性大片段保留了有用酶活性（六）（六）Taq DNA聚合酶惯用于聚合酶惯用于PCR（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5羟基末端磷酸化羟基末端磷酸化第24页目目 录录 来来自自于于大大肠肠杆杆菌菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP）或或小小牛牛肠肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用用于于脱脱去去DNA（RNA）5末末端端磷磷酸酸基基团团，使使5-P成成为为5-OH，该该过过程称核酸分子脱磷酸作用。程称核酸分子脱磷酸作用。（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端磷（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端磷酸基团酸基团P5OH3OH3P5OH5OH3OH3OH5第25页目目 录录（二）反转录酶以（二）反转录酶以RNA为模板合成为模板合成cDNA反转录酶反转录酶（reverse transcriptase）反转录酶催化反转录酶催化cDNA合成合成RNARNA53AAAAAAAAAAAATTTTTT53cDNAcDNA随机引物随机引物Oligo-dT第26页目目 录录5 35533 53OHGGG GGdGTP末端转移酶末端转移酶（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端末端加尾以组成黏端加尾以组成黏端 第27页目目 录录 大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶I（DNA polymerase I）是是基基因因工工程程中中惯惯用用DNA聚聚合合酶酶。其其除除含含有有53聚聚合合酶酶活活性性外外，还还有有35及及53核核酸酸外外切切酶酶活活性性。因因其其含含有有53核核酸酸外外切切酶酶活活性性而而惯惯用用于于DNA探探针针缺缺口口平平移移法法（nick translation）标识。）标识。（四）（四）DNA聚合酶聚合酶I主要用于合成主要用于合成DNA第28页目目 录录 DNA聚聚合合酶酶I大大片片段段（large fragment of DNA polymerase I）为为DNA聚聚合合酶酶I用用枯枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶（subtilisin）裂裂解解后后产产生生大大片片段段，这这个个片片段段也也称称为为Klenow片片段段（Klenow fragment）。其其保保留留了了53聚聚合合酶酶活活性性及及3 5外外切切酶酶活活性性，失失去去了了5 3外外切切酶酶活活性性。它它含含有有35外外切切酶酶活活性性能能确确保保DNA复复制制准准确确性性，即即把把DNA合合成成过过程程中中错错配配核核苷苷酸酸去去除除，再再把把正正确确核核苷苷酸酸接接上上去去（该活性称为校对活性）。（该活性称为校对活性）。Klenow片片段段主主要要用用途途有有：补补齐齐双双链链DNA3末末端端，使使其其转转变变成成平平端端；或或经经过过补补齐齐3端端而而使使3末末端端标标识识；在在cDNA克克隆隆中，用于第二股链合成；中，用于第二股链合成；用于用于DNA序列分析。序列分析。（五）五）DNA聚合酶聚合酶I大片段保留了有用酶活性大片段保留了有用酶活性第29页目目 录录将黏端转变成平端将黏端转变成平端GC T T A A OH 35 35GA A T TC T T A A5335 对对5-黏黏端端片片段段，利利用用大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶IKlenow片片段段，在在3-OH端端延延伸伸，可可填填平平末末端端凹凹陷陷并并将将其其转转变变成成平端平端。DNADNA聚合酶聚合酶 EcoR第30页目目 录录将黏端转变成平端将黏端转变成平端C T G C AG5 35CG533 对对3黏黏端端片片段段，应应用用如如T4 DNA聚聚合合酶酶35核核酸酸外外切切酶酶活性可切去未配正确序列，将其转变成平端。活性可切去未配正确序列，将其转变成平端。核酸外切酶核酸外切酶 PstPst 53第31页目目 录录（六）（六）Taq DNA聚合酶惯用于聚合酶惯用于PCR Taq DNA聚聚合合酶酶含含有有良良好好聚聚合合活活性性和和热热稳稳定定性性，惯惯用用于于PCR。该该酶酶含含有有53聚聚合合酶酶活活性性及及53外外切切酶酶活活性性，但但没没有有35外外切切酶酶活活性性，因因而而无无35校校对对活活性性，故故在在PCR反反应应中中假假如如发发生生碱碱基基错错配配，该该酶酶没没有有校校正正功功效效。针针对对此此不不足足，当当前前研研发发出出各各种种高高保保真真耐耐高高温温DNA聚聚合合酶酶，大大大大降降低低了了PCR过过程程中中碱碱基错配率。基错配率。另另外外，Taq DNA聚聚合合酶酶含含有有末末端端转转移移酶酶作作用用，能能在在所所合合成成DNA链链3末末端端加加上上一一个个单单独独腺腺苷苷酸酸残残基基（A）。这这么么PCR产产物物可可直直接接与与带带有有3-T线线性性化化载载体体（T载体）连接（即载体）连接（即T-A克隆）。克隆）。第32页目目 录录（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链55羟基末端磷酸化羟基末端磷酸化 惯惯 用用 是是 T4多多 核核 苷苷 酸酸 激激 酶酶（T4 polynucleotide kinase），该该酶酶含含5多多核核苷苷酸酸激激酶酶和和3磷磷酸酸酶酶活活性性，能能催催化化ATP-位位磷磷酸酸向向DNA和和RNA5-羟基转移。羟基转移。该该酶酶惯惯用用于于：DNA或或RNA5末末端端标标识识；使使没没有有5-末末端端磷磷酸酸DNA片片段段磷磷酸酸化化，以以供连接和克隆之用。供连接和克隆之用。第33页目目 录录第二节第二节 目标目标DNA获取获取Preparation of Interested DNA第34页目目 录录一、化学合成法可直接合成目DNA要求：已知目标基因核苷酸序列或其产物要求：已知目标基因核苷酸序列或其产物氨基酸序列氨基酸序列应用：普通用于小分子肽类基因合成应用：普通用于小分子肽类基因合成第35页目目 录录*化学合成法获取目DNA由已知氨基酸序列推测可能由已知氨基酸序列推测可能DNA序列序列色色 苯丙苯丙 蛋蛋 赖赖第36页目目 录录 第一步：构建第一步：构建基因组基因组基因组基因组DNADNA文库文库文库文库（是指包含（是指包含某一个生物细胞或组织全部基因组某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列随序列随机克隆群体，以机克隆群体，以DNA片段形式贮存了全部基因片段形式贮存了全部基因组组DNA信息）。信息）。第二步：筛选含有目标基因克隆。第二步：筛选含有目标基因克隆。二、从基因组DNA文库中获取目DNA第37页目目 录录组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片段基因片段克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子转化菌含重组分子转化菌限制性内切酶限制性内切酶或机械剪切或机械剪切受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存存在在于于转转化化细细胞胞内内由由克克隆隆载载体体所所携携带带全全部部基基因因组组DNA片段集合片段集合*从基因组DNA文库获取目基因第38页目目 录录三、从三、从cDNA文库中获取目标文库中获取目标DNA 第第一一步步：构构建建cDNAcDNA文文文文库库库库（包包含含某某一一组组织织细细胞胞在在一一定定条条件件下下所所表表示示全全部部mRNA经经反反转转录录而而合合成成cDNA序序列列克克隆隆群群体体，它它以以cDNA片片段段形形式贮存了全部基因表示信息）。式贮存了全部基因表示信息）。第二步：筛选含有目标第二步：筛选含有目标cDNAcDNA克隆。克隆。第39页目目 录录cDNA文库文库存存在在于于转转化化细细胞胞内内由由克克隆隆载载体体所所携携带带全全部部cDNA片片 段段集合集合第40页目目 录录基因组基因组DNA文库和文库和cDNA文库构建文库构建第41页目目 录录从从基因组基因组DNA文库或文库或cDNA文库中筛选文库中筛选目标目标DNA策略策略1.菌落或噬斑原位杂交菌落或噬斑原位杂交2.针针对对表表示示文文库库，可可用用抗抗原原-抗抗体体或或配配体体-受受体结合原理（亲和筛选法）筛选体结合原理（亲和筛选法）筛选第42页目目 录录*从基因组DNA文库获取目基因菌菌落落原原位位杂杂交交法法等等方方法法，可可从从文文库库中中筛筛选选含含有有目目标标基基因因噬菌体噬菌体第43页目目 录录AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAcDNA synthesisInfect cellscDNA library从cDNA文库获取目基因第44页目目 录录 假假如如已已经经知知道道目目标标基基因因序序列列，就就能能很很方方便便地地用用PCR反反应应，从从基基因因组组DNA或或cDNA中中取取得得目目标标基基因因，可可无无须须要要经经过过复复杂杂DNA文文库库构构建过程。建过程。PCR是一个高效快速体外是一个高效快速体外DNA聚合程序聚合程序四、经PCR获取目DNA第45页目目 录录PCR 体系体系模板模板引物引物耐热耐热DNA聚合酶聚合酶dNTPs含含Mg2+缓冲液缓冲液第46页目目 录录PCR过程过程变性变性(Denaturing):经加热使模板经加热使模板DNA 从从 dsDNA 变成变成ssDNA退火退火(Annealing):引物与模板引物与模板DNA杂交杂交延伸延伸(Extension):DNA 合成合成第47页目目 录录ing第48页目目 录录PCR头三个头三个循环循环第49页目目 录录酵母单杂交系统酵母单杂交系统五、经过特异杂交系统获取一些转录因子编码五、经过特异杂交系统获取一些转录因子编码DNADNAA.无转录因子：汇报基因不表示无转录因子：汇报基因不表示“诱饵诱饵”DNA序列序列B.有转录因子：汇报基因表示有转录因子：汇报基因表示C.有转录因子有转录因子 AD/DNA结合蛋白融合蛋白：汇报基因表示结合蛋白融合蛋白：汇报基因表示转录因子转录因子 AD转录因子转录因子DNA结合蛋白结合蛋白汇报基因汇报基因汇报基因汇报基因汇报基因汇报基因.第50页目目 录录.汇报基因汇报基因 汇报基因汇报基因酵母双杂交系统酵母双杂交系统 B.B.有相互作用蛋白质，汇报基因表示有相互作用蛋白质，汇报基因表示 开启子开启子 A.A.无相互作用蛋白质，汇报基因不表示无相互作用蛋白质，汇报基因不表示 “诱饵诱饵”“猎物猎物”AD BD 上游激活序列上游激活序列 开启子开启子BD“诱饵诱饵”“猎物猎物”AD上游激活序列上游激活序列第51页目目 录录第三节第三节 重组重组DNA技术中技术中DNA载体载体DNA Vectors in Recombinant DNA Technology第52页目目 录录载载体体（vectorvector）是是为为携携带带感感兴兴趣趣外外源源DNADNA，实实现现外外源源DNADNA在在受受体体细细胞胞中中无无性性繁繁殖殖或或表表示示有有意意义义蛋蛋白白质质所采取一些所采取一些DNADNA分子分子 按功效分按功效分克隆载体（克隆载体（cloning vector）表示载体（表示载体（expression vector）按基本元件按基本元件起源不一样起源不一样质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体黏粒载体黏粒载体病毒载体病毒载体人工染色体载体等人工染色体载体等载体概述载体概述第53页目目 录录克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设设计载体称为计载体称为克隆载体。克隆载体。表示载体表示载体(expression vector)为为使使插插入入外外源源DNA序序列列可可转转录录和和翻翻译译成成多肽链而特意设计载体称为多肽链而特意设计载体称为表示载体。表示载体。第54页目目 录录一、克隆载体用于外源一、克隆载体用于外源DNA克隆和无克隆和无性繁殖性繁殖（一）克隆载体应具备主要特点（一）克隆载体应具备主要特点最少有一个复制起点（最少有一个复制起点（origin of replication,ori）最少有一个选择性标志（最少有一个选择性标志（selection marker）有适宜限制性内切酶单一切点：称为多克隆位点有适宜限制性内切酶单一切点：称为多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）应有较高拷贝数。应有较高拷贝数。pBR322质粒图谱质粒图谱 第55页目目 录录1.1.质粒质粒(plasmid)特特点点：能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有一一些些遗传信息遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。（二）（二）惯用克隆载体有各种惯用克隆载体有各种第56页目目 录录严严紧紧型型质质粒粒:质质粒粒与与细细菌菌染染色色体体同同时时复复制制，处处于于严严密控制之下，其拷贝数较低。密控制之下，其拷贝数较低。松松弛弛型型质质粒粒:质质粒粒复复制制快快于于细细菌菌染染色色体体复复制制（即即质质粒粒复复制制不不受受严严格格控控制制），其其拷拷贝贝数数很很高高。重重组组DNA技术中使用质粒通常是松弛型。技术中使用质粒通常是松弛型。不不一一样样质质粒粒必必须须兼兼容容才才能能共共存存于于同同一一细细胞胞中中，这这对复合转染（或转化）有参考价值。对复合转染（或转化）有参考价值。当当前前，已已经经有有一一系系列列商商品品化化质质粒粒克克隆隆载载体体可可供供选选择，如择，如pUC系列、系列、pGEM系列等。系列等。质质粒粒载载体体通通常常所所能能容容纳纳外外源源DNA长长度度在在10 kb以以内，外源内，外源DNA片段越长，质粒越不稳定。片段越长，质粒越不稳定。第57页目目 录录pUC系列质粒图谱系列质粒图谱第58页目目 录录噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适合用于系列（插入型，适合用于cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适合用于基因组系列（置换型，适合用于基因组DNA克隆）克隆）cos位点位点:噬菌体噬菌体DNA为线性双链分子，两端各有一条为线性双链分子，两端各有一条由由12个碱基组成、彼此完全互补且个碱基组成、彼此完全互补且5单链突出序列（即单链突出序列（即粘性末端），称粘性末端），称cos位点位点 2.噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列第59页目目 录录3.穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector）人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源源DNA序列在不一样种类宿主细胞中复制、扩增。序列在不一样种类宿主细胞中复制、扩增。第60页目目 录录u表示载体是指用来在宿主细胞中表示外源表示载体是指用来在宿主细胞中表示外源基因载体基因载体u 依据其宿主细胞不一样可分为依据其宿主细胞不一样可分为:原核表示载体（原核表示载体（prokaryotic expression vector）真核表示载体（真核表示载体（eukaryotic expression vector）二、表示载体用于外源二、表示载体用于外源DNA表示表示第61页目目 录录（一）（一）原核表示载体用于在原核细胞中表示外原核表示载体用于在原核细胞中表示外源基因源基因 从克隆载体发展而来，其除了具备克隆载体普通特点外，从克隆载体发展而来，其除了具备克隆载体普通特点外，还需有调控外源基因有效转录和翻译序列，如开启子、核糖体还需有调控外源基因有效转录和翻译序列，如开启子、核糖体结合位点、转录终止序列等。当前应用最广泛原核表示载体是结合位点、转录终止序列等。当前应用最广泛原核表示载体是大肠杆菌表示载体。原核表示载体基本组成以下：大肠杆菌表示载体。原核表示载体基本组成以下：R：调整序列；：调整序列；P：开启子；：开启子；SD：SD序列；序列；TT：转录终止序列：转录终止序列大肠杆菌表示载体大肠杆菌表示载体第62页目目 录录lLac开启子（乳糖开启子）开启子（乳糖开启子）lTrp开启子（色氨酸开启子）开启子（色氨酸开启子）lTac开启子（乳糖和色氨酸杂合开启子）开启子（乳糖和色氨酸杂合开启子）lPL和和PR开启子（开启子（噬菌体左向和右向开启子）噬菌体左向和右向开启子）lT7开启子开启子1.1.开启子是开启外源基因表示必需元件，其能被开启子是开启外源基因表示必需元件，其能被RNARNA聚合酶所聚合酶所识别：识别：当前原核表示载体常使用开启子有以下几个当前原核表示载体常使用开启子有以下几个 第63页目目 录录2.SD序列提供核糖体结合位点序列提供核糖体结合位点 mRNA在在细细菌菌中中翻翻译译严严格格依依赖赖于于核核糖糖体体结结合合位位点点（ribosome binding site）存存 在在。SD序序 列列（Shine-Dalgarno sequence）位位于于转转录录起起始始位位点点上上游游813 bp处处，为为富富含含嘌嘌呤呤短短片片段段，其其能能与与核核糖糖体体30S小小亚亚基基中中16S rRNA 3端端部部分分序序列列互互补补结结合合。SD序序列列作作为为核核糖糖体体结结合合位点，确保了翻译起始复合物形成。位点，确保了翻译起始复合物形成。第64页目目 录录3.转录终止序列有利于外源基因高效表示转录终止序列有利于外源基因高效表示 尽管载体中没有转录终止序列，也可表示一些外源蛋尽管载体中没有转录终止序列，也可表示一些外源蛋白，但表示效果通常不理想。所以，多数原核表示载体中白，但表示效果通常不理想。所以，多数原核表示载体中都带有转录终止序列。都带有转录终止序列。转录终止序列长短不一，短只有几十转录终止序列长短不一，短只有几十bp，长可达几百，长可达几百bp。转录终止序列有利于使转录终止序列有利于使RNA聚合酶重点转录克隆外源聚合酶重点转录克隆外源基因，控制所转录基因，控制所转录RNA长度，提升长度，提升RNA稳定性。稳定性。位于开启子上游转录终止序列可阻止其它开启子通读，位于开启子上游转录终止序列可阻止其它开启子通读，降低本底；位于多克隆位点下游转录终止序列可预防因外降低本底；位于多克隆位点下游转录终止序列可预防因外源基因表示而干扰载体稳定性。源基因表示而干扰载体稳定性。第65页目目 录录4.几个常见原核表示载体各有特点几个常见原核表示载体各有特点 依据表示目标蛋白方式，可将原核表示载体分为依据表示目标蛋白方式，可将原核表示载体分为 （1）非融合型表示载体）非融合型表示载体 （2）融合型表示载体）融合型表示载体 （3）分泌型表示载体）分泌型表示载体 第66页目目 录录（1）非融合型表示载体用于表示非融合蛋白）非融合型表示载体用于表示非融合蛋白 非非融融合合蛋蛋白白是是指指不不与与细细菌菌任任何何蛋蛋白白或或多多肽肽融融合合在在一一起起进进行行表示蛋白。表示该类蛋白载体称为非融合型表示载体。表示蛋白。表示该类蛋白载体称为非融合型表示载体。使使用用强强开开启启子子tac，紧紧接接tac开开启启子子是是多多克克隆隆位位点点，目目标标基基因因克克隆隆于于开开启启子子和和SD序序列列下下游游。在在多多克克隆隆位位点点下下游游包包含含一一个个很很强强rrnB核核糖糖体体RNA转转录录终终止止子子，其其作作用用是是为为了了稳稳定定载载体体系系统统，因因为为上上游游强强tac开开启启子子控控制制转转录录必必须须由由强强终终止止子子抑抑制制，才才不不至至于于干干扰扰与与载载体体本本身身稳稳定定性性相相关关基基因因表示。载体其余部分来自表示。载体其余部分来自pBR322。使使用用pKK223-3时时，应应配配套套使使用用LacIq宿宿主主菌菌，在在无无IPTG诱诱导导时时，tac开开启启子子受受阻阻遏遏，当当加加入入IPTG后后，便可去阻遏，从而使外源基因表示。便可去阻遏，从而使外源基因表示。第67页目目 录录将将一一段段特特殊殊蛋蛋白白质质（或或短短肽肽）基基因因构构建建入入载载体体，使使之之与与目目标标蛋蛋白白融融合合表表示示可可形形成成融融合合蛋蛋白白（fusion protein）。表表示示该该类类蛋蛋白白载载体体称称为为融融合合型型表示载体，如表示载体，如pGEX系统。系统。pGEX系系统统包包含含各各种种载载体体，如如 pGEX-lT、pGEX-2T、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P等等。该该系系统统载载体体使使用用强强开开启启子子tac，紧紧接接开开启启子子是是SD序序列列及及其其下下游游GST基基因因，然然后后是是多多克克隆隆位位点点。用用IPTG可可诱诱导导目目标标基基因因表表示示，表表示示产产物物与与GST融融合合，故故可可利利用用该该标标签签对对蛋蛋白白进行纯化进行纯化。（2）融合型表示载体用于表示融合蛋白）融合型表示载体用于表示融合蛋白第68页目目 录录该类载体优点是能把在受体细菌内表示外源蛋白有效地分泌到周质腔，甚该类载体优点是能把在受体细菌内表示外源蛋白有效地分泌到周质腔，甚至穿过细胞外膜进入培养基中。至穿过细胞外膜进入培养基中。在构建该类载体时，除有普通表示载体应有开启子等元件外，还需含有编在构建该类载体时，除有普通表示载体应有开启子等元件外，还需含有编码信号肽序列（通常置于码信号肽序列（通常置于SD序列下游）。序列下游）。分泌型载体既可用于非融合蛋白表示，也可用于融合蛋白表示。分泌型载体既可用于非融合蛋白表示，也可用于融合蛋白表示。pIN 系系列列载载体体是是较较惯惯用用分分泌泌型型表表示示载载体体，可可使使所所表表示示蛋蛋白白分分泌泌到到宿宿主主菌菌周周质质腔腔中中。该该系系列列载载体体以以pBR322为为基基础础构构建建而而成成，带带有有大大肠肠杆杆菌菌中中最最强强开开启启子子之之一一，即即lpp（脂脂蛋蛋白白基基因因）开开启启子子，其其中中编编码码信信号号肽肽序序列列取取自自大大肠肠杆杆菌中分泌蛋白基因菌中分泌蛋白基因ompa（外膜蛋白基因）。（外膜蛋白基因）。（3 3）分泌型表示载体用于外源基因分泌表示）分泌型表示载体用于外源基因分泌表示pIN 系列载体有系列载体有3种，即种，即pIN-ompA1、pIN-ompA2和和pIN-ompA3，分别适合，分别适合用于使用不一样密码子框架目标基因插入，用于使用不一样密码子框架目标基因插入，克隆位点分别为克隆位点分别为EcoR、Hind和和BamH。第69页目目 录录（二）真核表示载体用于在真原核细胞中（二）真核表示载体用于在真原核细胞中表示外源基因表示外源基因 真核表示载体包含在大肠杆菌中起作用复制起始位点、真核表示载体包含在大肠杆菌中起作用复制起始位点、抗生素抗性基因、多