RVM致炎细胞因子上调导致5-HT释放参与调控慢性术后疼痛.pdf

第 45卷 第1期2024 年 1月Vol.45 No.1January 2024中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）RVM致炎细胞因子上调导致5-HT释放参与调控慢性术后疼痛代娟丽1，王臻1，董超雄1，李玉莹2，魏绪红3（1.华中科技大学协和深圳医院，广东 深圳 518052；2.深圳职业技术大学，广东 深圳 518055；3.中山大学中山医学院生理教研室，疼痛研究中心，广东 广州 510080）摘要：【目的】探讨延髓头端腹内侧部（RVM）内致炎细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）和白介素-1（IL-1）释放增多导致5-羟色胺（5-HT）向脊髓释放增多在慢性术后疼痛（CPSP）模型中的作用。【方法】按照随机方式将SD 大鼠进行如下分组：对照组、皮肤/肌肉切开和牵拉（SMIR）（1d，7d）组、SMIRRVM内注射TNF或IL-1中和性抗体组、SMIRRVM内注射TNF或IL-1组、SMIRRVM内注射溶剂组，用up-down 方法测量大鼠50%机械刺激撤足阈值，免疫组化检测RVM内TNF或IL-1表达情况，酶联免疫吸附测定法（ELISA）方法观察RVM及脊髓背角内5-HT含量的变化。【结果】SMIR可引起大鼠机械痛敏，表现为50%机械刺激撤足阈值下降，持续至少3周。SMIR后，RVM内神经元和星形胶质细胞中的TNF和IL-1 表达上调。TNF 或IL-1 中和抗体（每天一次行SMIR术前30 min给予，共4次）微量注射入RVM可阻断SMIR引起的50%机械刺激撤足阈值下降，并可降低RVM及脊髓背角5-HT的含量。正常动物RVM内注射TNF和IL-1 也可导致50%机械刺激撤足阈值下降，且引起RVM及脊髓内5-HT含量增加。【结论】RVM中致炎细胞因子增多可能通过引起5-HT释放增多参与调控SMIR后慢性术后疼痛的发生发展。关键词：慢性术后痛；延髓头端腹内侧部；肿瘤坏死因子；白介素1；5-羟色胺中图分类号：R338.8 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2024）01-0054-09DOI：10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.20240004.005Up-regulation of Proinflammatory Cytokines in Rostral Ventromedial Medulla Contributes to Chronic Postsurgical Pain by Promoting 5-HT ReleaseDAI Juanli1，WANG Zhen1，DONG Chaoxiong1，LI Yuying2，WEI Xuhong3（1.Xiehe Shenzhen Hospital，Huazhong University of Science and Technology，Shenzhen 518052，China；2.Shenzhen Polytechnic University，Shenzhen 518055，China；3.Department of Physiology，Zhongshan School of Medicine/Department of Physiology and Pain Research Center，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510080，China）Correspondence to：WEI Xuhong；E-mail：Abstract：【Objective】To investigate the role of proinflammatory cytokines tumor necrosis factor alpha（TNF）and interleukin-1（IL-1）in rostral ventromedial medulla（RVM）in chronic postsurgical pain（CPSP）induced by skin/muscle incision and retraction（SMIR）.【Methods】SD rats were randomly divided into 5 groups：Sham group；SMIR group；SMIR+TNF/IL-1 neutralizing antibody group；SMIR+TNF/IL-1 group and SMIR+vehicle group.50%paw mechanical withdrawal threshold（MWT）was measured by the up-down method，immunofluroscence was used 基础研究 收稿日期：2023-08-26 录用日期：2023-12-03基金项目：国家自然科学基金（81870969，81471250）；广东省自然科学基金（2019A1515011855）；深圳市南山区科技计划项目（NS2021078）；深圳职业技术大学校级项目（6023310001K）作者简介：代娟丽，第一作者，副主任技师，研究方向：神经病理性疼痛，E-mail：；魏绪红，通信作者，副教授，E-mail：第1期代娟丽，等.RVM致炎细胞因子上调导致5-HT释放参与调控慢性术后疼痛to detect the TNF and IL-1 expression and ELISA for the 5-Hydroxytryptamine（5-HT）level.【Results】SMIR elicited persistent nociceptive sensitization，upregulated TNF and IL-1 expression in RVM neurons and astrocytes.Microinjection of TNF or IL-1 neutralizing antibody into RVM inhibited the development of nociceptive sensitization and decreased the level of 5-HT in both RVM and spinal dorsal horn.While microinjection of recombinant TNF or IL-1 into RVM enhanced the development of nociceptive sensitization and increased the level of 5-HT in both RVM and spinal dorsal horn.【Conclusion】Up-regulation of proinflammatory cytokines in RVM may contribute to SMIR induced CPSP by promoting 5-HT release.Key words：chronic postoperative pain（CPSP）；rostral ventromedial medulla（RVM）；tumor necrosis factor alpha（TNF）；interleukin-1（IL-1）；5-Hydroxytryptamine（5-HT）J SUN Yatsen Univ（Med Sci），2024，45（1）：54-62外科手术如腹股沟疝修补手术或开胸手术后，约10%50的患者会产生慢性术后疼痛（chronic postoperative pain，CPSP）。其表现为在手术过后2个月，手术切口部位仍持续性疼痛，且不存在慢性感染，皮肤切口愈合不良等情况。CPSP对身体健康，日常活动，心理健康，就业和经济情况具有显著有害影响。在所有的接受手术的病人中有 0.5%1.5%的病人患有严重的甚至是致残性的 CPSP1，因手术类型的不同而有所差异。因此，慢性术后疼痛不是一种伴随伤口恢复就可以消失的症状。目前仍然缺乏对这类疼痛的认识、诊断和治疗，因此非常有必要阐明CPSP的发病机制，从而为进一步预防或治疗 CPSP 提供指导依据。研究报道，牵拉大鼠隐神经支配的大腿皮肤/肌肉可导致远隔部位后爪上产生了机械痛敏，被牵拉的隐神经并没有出现显著的损伤2-3，但却在脊髓背角出现了星形胶质细胞的激活。提示中枢敏感化可能是CPSP的发生的重要原因。延髓头端腹内侧区（rostral ventromedial medullar，RVM）是疼痛调控通路的重要区域，其接受下丘脑、中脑导水管周围灰质、臂旁核等的投射，并通过脊髓腹外侧束和脊髓背外侧束对疼痛发挥抑制或易化调节作用。RVM是疼痛下行易化系统的重要区域，研究表明，RVM 的 5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神经元可被伤害性刺激激活后释放5-HT到脊髓，参与中枢敏感化的产生，因而对调节伤害性刺激相关的行为反应具有重要作用4。实验研究表明，慢性神经病理痛的产生发展，有赖于下行易化系统的激活。阻断RVM的下行易化作用可显著减轻神经病理性疼痛5-6。致炎细胞因子的释放是引起下行易化系统的激活的关键因素。越来越多的证据表明神经损伤过后或癌性痛时，RVM（由功能类似的中缝大核、网状巨细胞核和网状巨细胞核 部组成）产生了与脊髓相似的小胶质细胞激活反应7-8，而小胶质细胞激活会导致炎性因子如 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF）和白介素-1（interleukin-1，IL-1）的释放，继而导致病理性疼痛的产生9-10。中和 RVM 的致炎细胞因子 TNF 或 敲 除 脑 源 性 神 经 营 养 因 子（brainderivedneurotrophicfactor，BDNF）受体 TrkB 可以减轻神经损伤或炎症引起的痛行为，而 RVM 局部注射 TNF 可引起痛敏8，11。但TNF 及 IL-1是否通过引起RVM 5-HT 释放增多进而导致术后痛尚不清楚。本项目拟观察皮肤/肌肉切开和牵拉（skin/muscle incision and retraction，SMIR）大鼠疼痛模型导致的病理性疼痛产生过程中RVM TNF 及 IL-1表达的变化情况，观察TNF 及 IL-1中和性抗体是否阻断SMIR引起的机械痛敏及对RVM、脊髓背角 5-HT含量的影响，以此探讨RVM致炎细胞因子因子是否通过促进 5-HT向脊髓的释放来参与调控CPSP的发生发展。1 材料与方法1.1实验动物成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄不限，体质量220 250 g，购于中山大学北校区实验动物中心（国家级动物实验中心）提供。动物的使用协议和动物处理程序获得了中山大学实验动物管理与使用委员会（IACUC）的批准。动物饲养于室温（22 05）、湿度50%-60、12 h 黑暗-光照循环照明的安静环境。单笼饲养，自由饮水摄食。动55第45卷中山大学学报（医学科学版）物随机分配到不同的实验组。实验动物适应环境一周后，随机将 74 只大鼠随机分为：假手术（17只）、SMIR（22 只）、SMIR+vehicle（5 只）、SMIR+TNF（或 IL-1 中和性抗体，10 只）、vehicle（10只）、TNF（或IL-1，10只）组。我们没有使用统计方法，而是基于以前我们的经验3，6来确定样本量。1.2皮肤/肌肉切开和牵拉（SMIR）模型手术将动物用异氟烷（1.5%-2.5）、70O2 和30N2O的混合物麻醉，在大鼠左侧后大腿内侧靠近隐静脉处大约4 mm远的皮肤表面做1.5-2 cm的切口，暴露大腿肌肉后，在肌肉浅层做7-10 mm的切口，插入微型解剖牵开器（Biomedical Research Instruments Inc.，USA）。将大腿的皮肤及浅表肌肉牵拉2 cm并持续1 h（如图1）。假手术组只皮肤切开但不进行牵拉。1.350机械刺激撤足阈值的测定具体操作方法参照我们之前的操作12。1.4RVM置管给药注射药物为了将药物显微注射入 RVM，我们使用戊巴比妥钠麻醉大鼠，并将其置于脑立体定位仪上。具体操作方法参照我们之前的操作12。注射位点不正确的动物被排除。1.5动物灌注及标本处理具体操作方法参照我们之前的操作12。1.6免疫荧光组织化学染色脑冰冻切片用0.01 mol/L PBS洗片3次，每次5 min，室温（25）下加入封闭液以封闭非特异性结合位点，1 h后弃去封闭液，加入含有待检测蛋白抗体（TNF-抗体或 IL-1抗体，1：400或 1：200）的一抗稀释液，置于4 摇床过夜。吸去一抗，洗片 3 次，每次 10 min，随后加入荧光二抗，室温（25）下避光摇床上慢摇1 h。弃去二抗，洗片3次，每次10 min。随机挑选切片贴于载玻片上，封片后立即于荧光显微镜（LEICA DFC350 FX Camera，Germany）下观察并拍照保存。半定量分析使用Image J 软件，每组每只动物随机挑选5张切片，每组动物数n=5，计算出每张切片RVM区域的免疫荧光阳性面积，再比上RVM的总面积，得到免疫荧光阳性面积百分比。1.7酶联免疫吸附测定法(ELISA)方法观察RVM及脊髓背角内5-HT含量迅速提取脊髓背角L3处和脑组织RVM部分，具体操作方法参照我们之前的操作12。1.8统计学分析统计分析使用 SPSS 16.0统计分析软件，实验结果以均数 标准误（Mean SEM）表示，p0.05则认为有统计学差异。行为学测试结果因不符合正态分布，均采用非参数检验进行分析。所有定量资料满足正态分布，且通过方差齐性检验后采用单因素方差分析，否则采用非参数检验。两个不同实验组同一时间点的数据比较采用Mann-Whitney U检验。免疫荧光光密度，ELISA测得的5-HT 浓度数据在满足正态分布，且通过方差齐性检验后采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间差异用Tukey法（Tukey post hoc test）检测。2 结 果2.1SMIR 引起长时间的机械痛敏行为学测试发现，与手术前基础值或与假手术组比较，隐神经支配部位的皮肤及肌肉牵拉持续1 h后（图1A-D），大鼠同侧后肢50%机械刺激撤足阈值于手术后1 d显著下降（P0.01），7 d降至最低点（P0.001），显著性差异一直保持至术后21 d左右（图1E）。说明SMIR可引起较长时间的术后机械痛敏。2.2SMIR 引起RVM内TNF及IL-1表达上调TNF-是神经损伤以及神经炎症过程最重要和最早释放的致炎细胞因子13，其能进一步促进其他细胞因子（如IL-1、IL-6 等）的产生。我们之前的研究表明，脊髓背角IL-114和IL-615 均在神经损伤引起的病理性疼痛的产生和维持过程发挥着重要作用。因此本研究探讨了RVM 具有代表性的两个致炎细胞因子 TNF-和 IL-1在 SMIR 引起的慢性术后疼痛中的作用。因 SMIR 术后 1 d 时50%机械刺激阈值刚刚开始下降，属于疼痛的产生阶段。7 d时50%机械刺激阈值降至最低水平，之后开始逐渐恢复，本研究选取1 d和14 d作为代表性的两个时间点来进行分子生物学的观察。免疫组化实验结果表明，SMIR可引起RVM内TNF表达上调，如图2所示，与假手术组（图2A D）相比，SMIR术后1 d时TNF的免疫荧光密度已显著上调（图 2B-D），7 d 时进一步上调（图 2C-D）。同样的，IL-1的免疫荧光密度也呈现出与 TNF类似的变化（图2E-H）。免疫荧光双染实验发现，56第1期代娟丽，等.RVM致炎细胞因子上调导致5-HT释放参与调控慢性术后疼痛SMIR 7 d时，上调的TNF及IL-1主要位于NeuN标记的神经元（图3A-C J-L），但GFAP标记的星形胶质细胞（图 3D-F M-O）以及 Iba1标记的小胶质细胞内（图3G-I P-R）也有少量表达。2.3预先RVM内给予TNF或IL-1中和性抗体可防止SMIR引起的机械痛敏上述结果表明SMIR手术导致了RVM内TNF及IL-1表达的上调，那么致炎细胞因子的上调与疼痛产生之间的关系又是怎样的呢？为此我们在RVM内分别微量注射了TNF中和性抗体（100 pg，1 L，每天1次，SMIR术前30 min开始，共4次）或IL-1中和性抗体（100 pg，1 L，SMIR术前30 min开始，每天 1 次，共 4 次），结果发现其均可阻断SMIR引起的机械痛敏，而给予对照溶剂则无作用，SMIR后50%机械刺激撤足阈值仍然出现下降（图4A-B）。ELISA 实验进一步发现，SMIR 后 7 d 的RVM和脊髓背角内5-HT的含量均显著增加。与给予溶剂组相比，给予TNF或IL-1的中和性抗A-D：surgery procedure E：Compared to the sham group,the 50%paw withdrawal threshold was significantly decreased for 21 days in SMIR rats but not in sham rats.day 1,Z=-3.252,P=0.001;day 3,Z=-3.255,P=0.001;day 5,Z=-3.249,P=0.001;day 7,Z=-3.216,P=0.001,day 14,Z=-3.252,P=0.001;day 21,Z=-2.674,P=0.001;day 35,Z=-1.854,P=0.007 2.*P0.01,*P0.001 compared with sham group.n=7/group.图1皮肤/肌肉牵拉引起大鼠50%机械刺激撤足阈值下降Fig.1Skin/muscle and incision（SMIR）decreased the 50%paw withdrawal thresholdCompared to the sham group,SMIR upregulated the expression of TNF（A-D)及IL-1(E-H)at day 1 and 7(n=5/group).D:F(2,12)=22.09,P0.001,*P=0.000 2 at SMIR 1d and 7 d compared with sham group.H:F(2,12)=20.14,P=0.000 1,*P=0.000 3 at SMIR 1 d,*P=0.000 2 at SMIR 7 d compared with sham group.图2皮肤/肌肉牵拉对RVM TNF及IL-1 表达的影响Fig.2The effect of SMIR on the expression of TNF及IL-1in RVM57第45卷中山大学学报（医学科学版）体显著降低了 RVM 内和脊髓背角内神经递质 5-HT的含量（图4C-D）。给予溶剂对SMIR引起的5-HT释放影响不大。该结果提示SMIR后RVM内致炎细胞因子的释放可能通过引起脊髓内5-HT释放增多进而引起慢性术后疼痛。2.4RVM内注射TNF或IL-1可引起正常动物机械痛敏及5-HT释放增多。我们进一步观察了 RVM 内 TNF 或 IL-1 是否是引起机械痛敏的充分条件。发现RVM内微量注射TNF或IL-1均可引起机械痛敏（图5A-B）。ELISA实验进一步证实，注射TNF或IL-1 也可引起5-HT释放增多（图5C-D）。3 讨 论在本研究中，我们发现SMIR可引起大鼠后肢产生持续性痛觉敏感，且 RVM 中致炎细胞因子TNF和IL-1显著上调。此外，将TNF和IL-1TNF was expressed mostly in NeuN labeled neurons(A-C),and to a much lesser extent in GFAP marked astrocyte(D-F)and Iba1 marked microglia(G-I)in RVM at day 7 after SMIR.IL-1 was expressed mostly in NeuN labeled neurons(J-L),and to a much lesser extent in GFAP marked astrocyte(M-O)and Iba1 marked microglia(P-R)in RVM at day 7 after SMIR.n=3/group.图3SMIR 后7 d RVM内TNF及IL-1表达的细胞类型Fig.3The cell types that expressed TNF及IL-1 7 days after SMIR58第1期代娟丽，等.RVM致炎细胞因子上调导致5-HT释放参与调控慢性术后疼痛中和性抗体微量注射入RVM中可防止SMIR引起机械痛敏的产生，并抑制SMIR引起的RVM及脊髓背角5-HT水平的升高。而在正常动物RVM内微量注射TNF或IL-1均可引起持续性机械痛敏，并引起RVM及脊髓内5-HT的水平升高。这些结果表明，RVM致炎细胞因子增多通过引起下行性易化作用参与了CPSP。以前的观点认为慢性术后痛主要由手术期间外周神经的损伤产生。然而，研究表明，皮肤/肌肉切开和牵拉（SMIR模型）导致CPSP产生的同时并没有引起外周神经损伤2，却引起了作为痛觉信号上行传递必经之路的脊髓背角胶质细胞的激活及致炎细胞因子的释放3。该研究进一步发现作为痛觉调制系统的重要区域RVM内致炎细胞因子的表达也上调，中和 TNF 或 IL-1 可以阻断SMIR后持续性疼痛的产生。提示RVM致炎细胞因子上调导致的炎症微环境的出现也参与CPSP的产生。内源性痛觉调制系统主要由中央导水管周围灰质和RVM构成。过度疼痛可激活内源性痛觉调制系统，从而起控制疼痛的作用。VM内 50 左右的神经元为 5-HT能神经元，可对伤害性信息传递产生紧张性抑制作用。与急性痛时不同，机体处于病理性疼痛状态时，内源性痛觉调制系统自身发生了显著的变化16。最新研究报道：神经损伤引起脊髓背角氯离子失衡，导致内源性5-HT系统由下A:Compared to the vehicle group,microinjection of TNF neutralizing antibody into RVM inhibited the development of nociceptive sensitization.day-1,Z=-8.383,P=0.421;day 1,Z=-2.41,P=0.016;day 3,Z=-2.611,P=0.09;day 5,Z=-2.611,P=0.09;day 7,Z=-2.643,P=0.008,day 9,Z=-Z=-2.643,P=0.008.B:Compared to the vehicle group,microinjection of IL-1 neutralizing antibody into RVM inhibited the development of nociceptive sensitization.C-D:the effect of TNF or IL-1 neutralizing antibody on the 5-HT level in RVM(C)and spinal dorsal horn（D)C:F(4,20)=69.25,P0.0001,*P0.001,SMIR+TNF antibody group(the 5-HT level was significantly decreased)compared with SMIR+vehicle group.*P0.001,SMIR+IL-1 antibody group(the 5-HT level was significantly decreased)compared with SMIR+vehicle group.*P0.01,*P0.001 compared with the related group.n=5/group.图4RVM内注射TNF或IL-1中和性抗体对SMIR引起的机械痛敏及5-HT水平的影响Fig.4The effect of TNF or IL-1 neutralizing antibody on the nociceptive sensitization and 5-HT level in RVM and spinal cord induced by SMIR59第45卷中山大学学报（医学科学版）行抑制转变为下行易化，进而导致神经病理性疼痛17。除此之外，在病理性状态时，脊髓5-HT受体亚型的表达发生了变化。正常状态时脊髓内痛觉初级传入纤维末梢上（即和传入 纤维末梢）以5-HT1A受体表达为主，RVM释放的5-HT通过与5-HT1A受体结合，抑制了痛刺激引起的兴奋性神经递质谷氨酸的释放，从而抑制了痛觉信号从脊髓向丘脑的传递。而病理情况下脊髓非选择性配体门控通道 5-HT3受体表达上调18，5-HT 转而与5-HT3受体结合，对阳离子钠、钾、钙等离子的通透性增加，增加神经末梢递质的释放，从而引起病理性疼痛19。本研究进一步发现SMIR导致RVM和脊髓背角5-HT含量均增多，综合以前的研究报道，我们认为在SMIR后，RVM起源的5-HT介导的下行性易化作用发生了增强，由此介导了慢性术后疼痛的产生。我们的前期工作已经报道 SMIR 可引起 DRG和脊髓背角致炎细胞因子的上调3，7。有研究表明，在 DRG，TNF 和 IL-1 可上调电压门控钠通道，引起感觉神经元放电增多，也就是产生了外周敏感化20-21。在本研究中，我们发现SMIR 后致炎细胞因子 TNF或 IL-1在 RVM 中上调。文章报道：TNF通过作用于神经元的TNFR1，激活PI3K信号通路，特异性引起不包含GluR2 的AMPA受体在细胞膜上表达，同时，TNF 也可引起细胞膜上GABAA 受体表达降低22。膜片钳记录也显示TNF和 IL-1可引起 AMPA-或 NMDA 电流增大及GABA电流减小23。因此，致炎细胞因子TNF和IL-1可增强谷氨酸介导的兴奋性突触传递，并可减弱GABA介导的抑制性突触传递。通过分别对兴奋性和抑制性突触发挥长时程的影响，从而驱动神经元过度兴奋，进而促进痛觉信号的上行传递。RVM 内预防性给予 TNF 或 IL-1 中和性抗体可缓解机械痛敏并降低RVM和脊髓背角中的5-HT 水平。而在正常动物，RVM 内注射微量的A-B：The effect of microinjection of TNF or IL-1 into RVM of nave rats on the 50%paw withdrawal threshold A:day-1,Z=-2.643,P=0.008;day 1 and 3,Z=-2.611,P=0.008;day 5,Z=-2.627,P=0.008;day 7,Z=-2.611,P=0.009;day 14,Z=-2.619,P=0.008,day 21,Z=-2.227,P=0.051.B:day-1,Z=-4.88,P=0.639;day 1,Z=-2.847,P=0.003;day 3 and 5,Z=-2.842,P=0.003;day 7,Z=-2.847,P=0.003;day 14,Z=-2.842,P=0.003;day 21,Z=-2.632,P=0.008.C-D:The effect of microinjection of TNF or IL-1 into RVM of nave rats on the level of 5-HT in RVM and spinal dorsal horn。C:5-HT level in RVM.F(3,16)=143.4,P0.001.*P0.001,TNF group compared with vehicle group；*P0.001,IL-1 group compared with vehicle group。D:5-HT level in SP.F(3,16)=29.14,P0.001.*P0.001,TNF group compared with vehicle；*P0.001,IL-1 group compared with vehicle group.图5RVM 内微量注射TNF或IL-1对正常动物50%机械刺激撤足阈值及RVM 内和脊髓背角神经递质5-HT含量的影响Fig.5The effect of microinjection of TNF or IL-1 into RVM of naive rats on the 50%paw withdrawal threshold and the level of 5-HT in RVM and spinal dorsal horn60第1期代娟丽，等.RVM致炎细胞因子上调导致5-HT释放参与调控慢性术后疼痛TNF或IL-1可引起机械痛敏，同时RVM和脊髓背角5-HT水平升高。RVM的神经元根据对受体激动剂的敏感性分成两类，一类对受体激动剂不敏感，而另外一类细胞膜上表达受体（MOR）且对 阿片受体激动剂产生超级化反应，即抑制反应24-25。在正常情况下，阿片类物质部分地通过减少RVM 神经元的GABA信息传递，激活下行抑制系统而产生抑制疼痛的作用。然而在致炎细胞因子 TNF 或 IL-1 存在的情况下，无论是 GABA 的输入活动还是GABAA受体的性质都会发生改变，导致GABA介导的抑制性突触传递功能受到抑制（去抑制），由此可能进一步激活MOR阳性神经元的神经元26，导致其释放 5-HT增多。RVM 5-HT 的释放可通过引起下行性易化作用，最终导致痛觉过敏。这与我们的发现是一致的，即在RVM注射TNF或IL-1可引起RVM和脊髓背角5-HT浓度的增加。我们目前的实验只是发现了 5-HT的增高，如能进一步验证脊髓5-HT受体的表达情况，以及使用5-HT受体激动剂和拮抗剂加以验证，或能测定5-HT代谢物5-羟阴多酰乙酸（5-HIAA）与5-HT 比值的改变情况，并将其作为 5-HT 释放的指标27-28，将能显著提高我们研究的可信性和科学性。这也是该研究的局限之处，后续将会进一步跟进深入研究。既往研究表明，TNF和IL-1 的受体，即TNFR1和IL-1R，主要表达在含有NMDAR亚基NR1的 RVM 神经元8，而 TNFR2 主要位于胶质细胞上28。最近的研究表明，敲除小胶质细胞的TNFR2可引起淋巴细胞入侵，T细胞激活以及中枢神经脱髓鞘，从而导致自身免疫性脑脊髓炎出现时间提前，说明小胶质细胞的TNFR2具有一定的保护意义。而敲除单核/巨噬细胞的 TNFR2 可通过减轻外周T细胞激活及中枢T细胞入侵及脱髓鞘起到减轻自身免疫性脑脊髓炎的作用，提示单核/巨噬细胞的TNFR2具有加重自身免疫性脑脊髓炎的作用29。虽然本研究未评估TNFR1及TNFR2的表达情况及表达的 细胞类型，但据以往的研究，我们可以推测出SMIR后RVM上调的两类炎性因子也可能是通过神经元及非神经元两方面发挥致痛作用。我们的实验结果表明疼痛在术后 1 d即刻诱导，且疼痛行为的进展具有时效性，3 d到峰值，维持至7 d。免疫荧光结果也表明（图 2），RVM 脑区中 TNF 和 IL-1在 1 d和 7 d时表达并无显著差异，表明TNF 和 IL-1可能有助于疼痛启动，但似乎仍有其他机制参与疼痛发展。过往研究指出RVM内注射 TNF可通过磷酸化 NR1受体异化痛觉过敏，SMIR后RVM内升高的TNF可能通过类似的作用机制导致疼痛8。既往研究表明，除了TNF和 IL-1 之外，RVM 中的其他介质包括胆囊收缩素30-31和脑源性神经营养因子11也参与了疼痛的易化作用。我们之前的研究也表明，NADPH 氧化酶2 激活导致活性氧簇的释放也起到了类似的作用12。综上所述，预防慢性术后疼痛的预防不应只关注手术切口本身，而应关注手术所导致的炎症微环境的形成及下行易化系统的激活。参考文献1 Steyaert A，De Kock M.Chronic postsurgical painJ.Curr Opin Anaesthesiol，2012，25（5）：584-588.2 Flatters SJ.Characterization of a model of persistent postoperative pain evoked by skin/muscle incision and retraction（SMIR）J.Pain，2008，135（1-2）：119-130.3 Ying YL，Wei XH，Xu XB，et al.Over-expression of P2X7 receptors in spinal glial cells contributes to the development of chronic postsurgical pain induced by skin/muscle incision and retraction（SMIR）in ratsJ.Exp Neurol，2014，261：836-843.4 Guo W，Miyoshi K，Dubner R，et al.Spinal 5-HT3 receptors mediate descending facilitation and contribute to behavioral hypersensitivity via a reciprocal neuron-glial signaling cascadeJ.Mol Pain，2014，9（10）：35.5 Cai YQ，Wang W，Hou YY，et al.Optogenetic activation of brainstem serotonergic neurons induces persistent pain sensitization J.Mol Pain，2014，10：70.6 Wang W，Zhong X，Li Y，et al.Rostral ventromedial medulla-mediated descending facilitation following P2X7 receptor activation is involved in the development of chronic post-operative pain J.J Neurochem，2019，149（6）：760-780.7 Huang ZX，Lu ZJ，Ma WQ，et al.Involvement of RVM-expressed P2X7 receptor in bone cancer pain：mechanism of descending facilitation J.Pain，2014，155（4）：783-791.8 Wei F，Guo W，Zou S，et al.Supraspinal glial-neuronal interactions contribute to descending pain facilitationJ.J Neuro61第45卷中山大学学报（医学科学版）sci，2008，28（42）：10482-10495.9 Guo M，Chen F，Guo JC，et al.Study of the hippocampus and the anterior cingulate gyrus by proton MR spectroscopy in patients with post-traumatic stress disorder J.Asian Pac J Trop Med，2012，5（