喙尾琵琶甲肠道来源真菌的分离及其次级代谢产物的抗菌、抗肿瘤活性筛选.pdf

.885.喙尾琵琶甲肠道来源真菌的分离及其次级代谢产物的抗菌、抗肿瘤活性筛选李铭晖 王明明 殷鹏凯 杨自忠 肖怀 杨大松 杨银河*(大理大学药学院,云南省昆虫生物医药研发重点实验室,大理 671000)摘要：目的 研究药用昆虫喙尾琵琶甲Blaps rynchopetera成虫肠道的活性真菌，为抗菌、抗肿瘤活性天然产物的开发提供新的真菌资源。方法 结合稀释涂布法和选择培养法对喙尾琵琶甲成虫肠道的真菌进行分离纯化；以9株病原菌为指示菌，通过牛津杯琼脂扩散法检测肠道真菌次级代谢产物的抗菌活性；结合形态学，通过分子生物学方法进行ITS序列比对，鉴定抗菌活性显著的真菌并构建系统发育树；采用5株肿瘤细胞，对已鉴定的菌株进行抗肿瘤活性测试。结果 从喙尾琵琶甲肠道中分离获得108株真菌，其中17株真菌具有不同程度的抗菌活性；选择7株抑菌活性显著(抑菌圈直径14 mm)的真菌进行鉴定；研究还显示3株真菌的次级代谢产物具有广谱的抗肿瘤活性。结论 喙尾琵琶甲肠道来源真菌的次级代谢产物具有一定的抗菌及抗肿瘤活性。关键词：喙尾琵琶甲；肠道真菌；抗菌活性；抗肿瘤活性；分子鉴定；系统发育树中图分类号：Q978.1 文献标志码：AIsolation of fungi from the guts of Blaps rynchopetera and screening of antimicrobial and antitumor activity of fungis secondary metabolitesLi Minghui,Wang Mingming,Yin Pengkai,Yang Zizhong,Xiao Huai,Yang Dasong,and Yang Yinhe(Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,College of Pharmacy,Dali University,Dali 671000)Abstract Objective In order to provide new fungal resources for the development of antimicrobial and antitumor active natural products,the active fungi in the guts of medicinal insect Blaps rynchopetera adults were studied.Methods Fungi were isolated and purified from the gut of B.rynchopetera adults by using dilution coating method and selective culture method.The antimicrobial activities of secondary metabolites from the fungi were detected by Oxford cup agar diffusion assay with 9 pathogenic microorganism as indicator strain.ITS sequence alignment was performed to identify the fungi with significant activity through molecular biological method and the phylogenetic tree was constructed.Five tumor cell lines were used to test the antitumor activity of the identified strains.Results A total of 108 strains of fungi were isolated from the gut of B.rynchopetera,among them 17 strains showed different degrees of antimicrobial activity.Seven fungi with significant antibacterial activity(the diameter of 收稿日期：2022-12-16基金项目：云南省基础研究项目(No.202001AU070022)；中青年学术和技术带头人后备人才项目(No.202305AC160035；No.202105AC160062)；云南省重大科技专项计划(No.202002AA100007)作者简介：李铭晖，男，生于1997年，在读硕士研究生，研究方向：昆虫肠道微生物活性次级代谢产物。E-mail:*通信作者，E-mail:文章编号：1001-8689(2023)08-0885-09中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.886.昆虫，隶属无脊椎动物节肢动物门昆虫纲，在自然界中数量庞大，种类繁多，目前已报道和命名的昆虫达100万种。昆虫的肠道系统通常分为前肠、中肠和后肠3个区域，具有存储、消化食物和排泄的功能1，这为微生物的定殖提供了独特的生存环境。昆虫肠道微生物包含原生生物、古生菌、细菌和真菌等2，研究表明它们可帮助宿主消化食物以获取生存所必需的营养成分，提高宿主对寄生虫、病原体的防御，调节免疫系统提升自我解毒的能力，影响宿主的发育周期、交配繁殖及寿命等 3-6。已有文献报道昆虫肠道微生物具有产生活性次级代谢产物的能力，例如从三开蜣螂Copris tripartitus的肠道细菌中分离获得两个新型环肽类化合物Coprisamides A和B，对苯醌还原酶均具有显著的诱导活性7。从黑负葬甲Nicrophorus concolor的肠道放线菌微杆菌Microbacterium sp.分离出两个多肽类化合物nicrophorusamides A和B，对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌等革兰阳性菌具有抑制作用8。研究表明，昆虫肠道微生物是挖掘新型次级代谢产物的重要来源，具有潜在的药用价值和研究意义。喙尾琵琶甲Blaps rynchopetera属于鞘翅目Coleoptera拟步甲科Tenebrionidae琵琶甲属Blaps，是一种携带特殊臭味的昆虫，具有抗菌、消炎、解毒、免疫调节等作用，作为一种民间药用昆虫，在云南彝族长期广泛用来治疗发烧、咳嗽、胃炎、疮肿等病症9。近年研究发现，喙尾琵琶甲虫体提取物中含有酚类、醌类、脂肪酸、脂肪酸酯、环肽、氨基酸等化学成分10-12，研究还显示喙尾琵琶甲成虫的粗提物具有体外抑菌活性、抗肿瘤活性和抗氧化活性13-15。根据调查16，喙尾琵琶甲在云南省分布广泛，生长在垂直海拔7602450 m阴凉潮湿的环境，靠近居民房屋、牲畜圈舍，这样的生存环境大大增加了喙尾琵琶甲肠道菌群的种类丰富度。鉴于喙尾琵琶甲是一种分布广，适应性强，生存环境较为恶劣的药用昆虫，目前尚未有喙尾琵琶甲肠道真菌代谢产物的相关研究。本研究对喙尾琵琶肠道来源真菌进行分离纯化，共获得108株真菌。以6株病原细菌、3株病原真菌为指示菌，采用牛津杯琼脂扩散法对抗菌活性真菌进行筛选。结果显示，17株真菌的次级代谢产物具有不同程度的抗菌活性。本研究对抗菌活性明显的7株真菌进行形态学、分子生物学鉴定，并对这7株真菌的次级代谢产物进行抗肿瘤活性测试，结果显示3株真菌的次级代谢产物对5株肿瘤细胞表现出较高的细胞抑制率。本研究是对药用昆虫喙尾琵琶甲成虫肠道真菌资源的首次探索，这为后续从喙尾琵琶甲成虫肠道真菌中挖掘活性天然产物提供了重要的微生物资源。1 材料与方法1.1 供试昆虫与病原菌喙尾琵琶甲成虫的采集时间：2020年8月；地点：云南省大理白族自治州大理市满江区农作物田地内。成虫经大理大学昆虫生物医药研发重点实验室杨自忠教授根据形态特征17鉴定为喙尾琵琶甲Blaps rynchopetera。9株病原菌：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(ATCC25923)、大肠埃希菌Escherichia coli(ATCC25922)、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa(ATCC9027)、粪肠球菌Enterococcus faecalis(ATCC47077)、白假丝酵母Canidia albicans(ATCC10231)、黑曲霉Aspergillus niger(BNCC186380)、青霉Penicillium expansum(BNCC117714)由昆虫生物医药研发重点实验室菌种储藏库提供，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methieillin-resistant Staphylococus aureus,MRSA)(ATCC43300)购自广东省科学院微生物研究所，鼠伤寒沙门菌Salmonella typhimurium(BNCC103281)购自the inhibition zone was greater than 14 mm)were selected for identification.The study also showed that the secondary metabolites of three strains of fungi had broad-spectrum antitumor activity.Conclusion The secondary metabolites of fungi from the gut of B.rynchopetera have certain antibacterial and antitumor activity.Key words Blaps rynchopetera;Gut fungi;Antimicrobial activity;Antitumor activity;Molecular identification;Phylogenetic tree喙尾琵琶甲肠道来源真菌的分离及其次级代谢产物的抗菌、抗肿瘤活性筛选 李铭晖等.887.北纳生物科技有限公司。供试肿瘤细胞系：采用肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMC-7721、宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA-MB-231及结肠癌细胞SW480 5种肿瘤细胞进行真菌代谢产物的抗肿瘤活性测试，所有细胞系均由中国科学院昆明植物研究所天然药物活性筛选中心提供。1.2 试剂与仪器真菌分离纯化用PDA培养基(广东环凯微生物科技有限公司)，分离时培养基中添加50 g/mL氯霉素以抑制细菌生长。病原菌的活化及抗菌活性筛选培养基为PDA培养基、LB培养基(广东环凯微生物科技有限公司)、BHI培养基(北京陆桥技术股份有限公司)。阳 性 药 品 试 剂 主 要 包 括 盐 酸 万 古 霉 素(vancomycin hydrochloride)、青霉素G钠(penicillin G sodium)和制霉菌素(nystatin)(上海麦克林生化科技有限公司)，氯霉素(chloramphenicol)(上海阿拉丁试剂有限公司)。主要试剂包括琼脂粉(广东环凯微生物科技有限公司)，甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸(天津市风船化学试剂科技有限公司)，真菌基因组提取试剂盒(武汉纳磁生物科技有限公司)、PCR产物磁珠法纯化试剂盒(上海硕美生物科技有限公司)。通用引物为北京六合华大基因科技有限公司合成。仪器主要包括洁净工作台(SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司)，振荡培养箱(MQD-S2R，上海旻泉仪器有限公司)，生化培养箱(LBI-250，上海龙跃仪器设备有限公司)，立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-50A，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)，电子天平(WTB 5008，杭州万特衡器有限公司)，PCR仪(9700，ABI公司)，离心机(5417R，德国Eppendorf公司)，电泳仪电源(DYY-8C，北京市六一仪器厂)，水浴锅(DK-24，上海精宏实验设备有限公司)。1.3 肠道真菌的分离、纯化将20头喙尾琵琶甲成虫活体置于已灭菌的玻璃瓶中，于-20 条件下放置30 min。待虫体不动后，在洁净工作台内，对虫体进行体表的消毒：向瓶中加入无菌水，用力摇晃2 min，清洗2次，依次用5%次氯酸钠浸泡1 min，75%乙醇浸泡3 min，用无菌水冲洗3次，置于室温晾干。取最后一次清洗的无菌水200 L涂布于PDA培养基上，在28 的培养箱中培养7 d，观察培养基上没有任何微生物生长。在洁净工作台上，用手术刀、剪刀将试虫腹部覆盖的体壳去除，暴露出内部脏器组织，取出肠道组织，称重，加入PBS溶液(1 mL/g)研磨。取1 mL研磨液至装有9 mL PBS的试管中，依次稀释至10-6 g/mL 浓度，采用稀释涂布法，取10-310-6 g/mL不同浓度的稀释液各100 L均匀涂布于含有50 g/mL氯霉素、100 mg/L氯霉素和链霉素混合液的PDA培养基上，每个浓度进行3个平行实验，同时设置培养基空白对照和PBS溶剂对照；将平板置于28 培养箱中培养，待平板长出可见菌落，通过观察菌落形态、大小、菌丝颜色等特征，挑取菌丝在PDA培养基上进行真菌纯化，至少转接3次以上，直至获得单一菌株，用50%甘油作为冻存液，将菌种保存于-80 冰箱中。1.4 肠道真菌的抗菌活性测试真菌代谢粗提物的制备：每株菌发酵10个平皿，置于28 培养箱中培养14 d后，将培养基切割成小块，以乙酸乙酯:甲醇:冰乙酸=80:15:5(V/V/V)的配比液分别浸泡3 d，2 d，1 d，过滤提取液，合并减压浓缩获得粗提物浸膏。采用牛津杯琼脂扩散法18检测真菌次级代谢产物粗提物的抗菌活性：将9株病原菌于对应的液体培养基中进行活化培养4 h(37，180 r/min)，调整菌液浓度为(35)106 CFU/mL的菌悬液。各吸取 100 L菌液至对应的固体培养基上，均匀涂布，轻轻插入牛津杯(直径8 mm)，分别吸取100 L粗提物(20 mg/mL)，对应阳性药(盐酸万古霉素150 g/mL、氯霉素150 g/mL、青霉素G钠150 g/mL、制霉菌素1 mg/mL)加入牛津杯，将培养皿于4 冰箱中放置 4 h后再转移至37 培养箱中培养，12 h后观察结果，记录抑菌圈的大小，每组进行3次平行实验。1.5 抗菌活性真菌鉴定及系统发育树分析观察抗菌活性明显的7株真菌在平板上的菌落形态、菌丝形态和孢子形态。采用柱式法提取真菌基因组DNA。使用真菌通用引物ITS4 中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.888.(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)和ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)扩增转录间隔区ITS序列。PCR反应体系(25 L)：PCR Mix 21 L，上、下游引物(5 pmol/L)各1 L，模板(ng/L)2 L。PCR反应程序：96 5 min；96 20 s，56 30 s，72 30 s，共35个循环；72 10 min。对3 L PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶检测后，委托北京六合华大基因科技有限公司进行基因测序。将纯化后的PCR产物进行上机测序，选择与菌株同源性高的序列作为参照序列，将测序结果与NCBI数据库中的序列进行Blast比对，运用MEGA 7.0软件，采用Neighbor Joining方法19构建系统发育树，根据真菌菌株间的亲缘关系确定种属分类情况，最后将各菌株序列提交至GenBank数据库，以获取序列号。1.6 肠道真菌代谢产物对肿瘤细胞的抑制活性测试实验采用MTS法检测7株喙尾琵琶甲成虫肠道真菌代谢产物的抗肿瘤细胞活性，用含10%胎牛血清的RMPI1640完全培养液配制单个细胞悬液，提前1224 h接种细胞进行培养，接种30005000个细 胞/孔至96孔板上，每孔体积100 L。样品用DMSO溶解，加入细胞孔，以100 g/mL样品浓度筛选，每孔终体积200 L，每种处理均设3个复孔。于37 培养48 h后，保留贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20 L和培养液100 L；设3个空白复孔(MTS溶液20 L和培养液100 L的混合液)，继续孵育24 h，使反应充分进行后测定光吸收值。选择492 nm波长，使用多功能酶标仪读取各孔的光吸收值，记录结果，数据处理后以样品编号为横坐标，细胞抑制率为纵坐标绘制细胞的抑制率图。实验设顺铂(cisplatin,DDP)和紫杉醇(Taxol)两个阳性化合物，以化合物浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，计算在不同浓度下的化合物对五种肿瘤细胞的抑制率。2 结果2.1 肠道真菌的分离、纯化从喙尾琵琶甲成虫肠道中分离到真菌108株，编号为BPF1BPF108，保存于-80超低温冰箱内。2.2 肠道真菌的抗菌活性根据不同病原菌，实验选用不同的阳性药为对照，采用牛津杯琼脂扩散法检测真菌代谢产物的抗菌活性，阳性药的抑菌圈直径见表1所示。抗细菌活性结果表明：通过对108株肠道真菌的固体发酵产物进行抗菌活性检测，其中有15株真菌的代谢产物对病原细菌表现出不同程度的抑菌作用，有7株真菌的代谢产物对病原细菌显示出较强的抑菌活性(抑菌圈直径14 mm)20。其中菌株BPF6、BPF100的代谢产物对四株细菌具有抑制作用，BPF10、BPF11、BPF33、BPF62的代谢产物对3株细菌具有抑制作用，抑菌圈直径见表2。图1显示的是部分喙尾琵琶甲成虫肠道真菌代谢产物对细菌的抑制作用。抗真菌活性结果显示：共有15株真菌的代谢产物表现出抑菌活性，其中7株真菌BPF6、BPF39、BPF55、BPF62、BPF70、BPF88、BPF106的代谢产物对黑曲霉、青霉和白假丝酵母3种真菌具有广谱的抑菌活性，抑菌圈直径见表3。2.3 抗菌活性真菌鉴定及系统发育树分析喙尾琵琶甲成虫肠道真菌代谢产物的抗菌活性结果(表23)显示：具有显著抗菌活性(抑菌圈直径14 mm)的肠道真菌共有7株，编号依次为BPF6、BPF33、BPF47、BPF55、BPF56、BPF100、BPF106，这些真菌在PDA培养基上的菌落形态见图表1 阳性药对不同病原菌的抑菌圈直径(mm)Tab.1 Inhibition zone diameters(mm)of positive drugs against different pathogenic strains 病原菌盐酸万古霉素青霉素G钠氯霉素制霉菌素耐甲氧西林金黄色葡萄球菌18.40.3w-/金黄色葡萄球菌/26.50.220.50.1/大肠埃希菌/-20.30.6/粪肠球菌/17.0 0.522.00.5/鼠伤寒沙门菌/19.01.2/铜绿假单胞菌/-19.20.8/黑曲霉/19.20.7青霉/18.40.3白假丝酵母/25.50.9注：数据为平均值标准差；-：无明显抑制作用；/：未测。喙尾琵琶甲肠道来源真菌的分离及其次级代谢产物的抗菌、抗肿瘤活性筛选 李铭晖等.889.表2 具有显著抗菌活性真菌对病原细菌的抑菌圈直径(mm)Tab.2 Inhibition zone diameters(mm)of funji with significant antibacterial activity against different pathogenic bacteria菌株编号耐甲氧西林金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌粪肠球菌鼠伤寒沙门菌铜绿假单胞菌BPF618.10.113.00.7-19.00.1-10.70.5BPF1013.30.413.51.0-13.81.1BPF1110.20.310.20.6-10.00.2-BPF3315.40.712.20.1-16.40.5-BPF39-11.70.4-BPF4512.10.112.62.3-BPF47-10.50.4-16.20.3-BPF5514.91.2-11.30.5-BPF5614.90.8-12.11.1BPF6212.50.411.30.5-10.41.5-BPF7012.30.212.30.8-BPF8310.00.49.90.9-BPF8811.90.912.30.5-BPF10020.10.519.70.6-11.10.716.10.7BPF10618.90.615.50.7-注：数据为平均值标准差；-：无明显抑制作用；/：未测。表3 具有显著抗菌活性真菌对病原真菌的抑菌圈直径(mm)Tab.3 Inhibition zone diameters(mm)of fungi with significant antifungal activity against different pathogenic fungus菌株编号黑曲霉白假丝酵母青霉BPF5-12.60.3BPF611.60.813.40.411.92.5BPF11-11.40.912.31.3BPF33-11.31.0-BPF3910.80.513.12.112.70.5BPF45-12.50.310.30.4BPF47-12.40.511.70.4BPF5510.60.511.70.69.50.5BPF56-11.40.59.80.7BPF6211.20.712.70.611.60.4BPF7011.61.112.31.312.10.1BPF839.20.511.30.3-BPF8810.60.313.10.912.40.3BPF10610.60.413.30.213.90.1BPF108-11.51.7-注：数据为平均值标准差；-：无明显抑制作用；/：未测。AD中的致病细菌依次为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌；测试样品分别为菌株BPF6、BPF33、BPF47、BPF55、BPF56、BPF100、BPF106的代谢产物，阳性对照为V：万古霉素；P：青霉素G钠，C：氯霉素。图1 部分喙尾琵琶甲成虫肠道真菌粗提物及阳性药对不同病原细菌的抑菌活性Fig.1 Inhibitory activities of positive drugs and crude extracts of some intestinal fungi isolated from B.rynchopetera adults against different pathogenic bacteriaAAAAABBAPPPPPPPPPDPPPBBPF6BPF6BPF55BPF56BPF106BPF100BPF100BPF106BPF100BPF33BPF33VCCCCCCCCVVVVV2和表4。图2表明，各菌株的菌落形态均有差异，呈现出绒毛状或絮状，菌落颜色呈现绿色、黄色、白色、棕色等，菌丝均呈现出分枝状，分生孢子呈现卵圆形或椭圆形。有的菌株生长较快，菌丝较发达，如BPF6和BPF33，在温度为28 的PDA平板上，3 d即可长至平板的三分之二大小。有的菌株生长较慢，如BPF100和BPF106，但它们的菌落边缘较为清晰，易于观察21-24。提取7株抗菌活性显著真菌的DNA，使用通用引物(ITS1和ITS4)进行PCR扩增，获得目的基因扩中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.890.表4 具有显著抗菌活性真菌的表型鉴定Tab.4 Phenotype identification of fungi with significant antibacterial activity 菌株编号菌落形态(PDA平皿)显微特征BPF6菌落铺满整个平板，菌落呈绒状辐射状，中心为白色，菌落外围产生孢子并出现黄棕色斑菌丝发达，有隔膜，分枝状，分生孢子椭圆形BPF33菌落铺满整个平板，菌落呈绒状辐射状，中心为浅绿色，外围产生孢子并出现深绿色斑菌丝发达，有隔膜，分枝状，分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，分生孢子无色光滑，椭圆形或倒卵形BPF47菌落铺满整个平板，菌落呈絮状，产孢簇部分为白色，部分为黄绿色 菌丝有隔，分枝状，分生孢子单细胞，球形或卵圆形BPF55菌落呈絮状，菌丝质地致密，中心为紫色周围为淡红色菌丝呈分枝状，分生孢子12个细胞，卵形，附着于单生瓶梗上，在顶端聚成簇BPF56菌落呈绒毛状，中心为白色或棕色，外周菌体为绿色菌丝发达，分枝状，分生孢子呈球形，壁平滑BPF100菌落呈绒毛状，具放射状皱纹，质地较为紧密，大部分为白色，靠近边缘有绿色菌体菌丝发达有分枝，细而长，分生孢子球形，壁平滑BPF106菌落呈绒毛状，具放射状皱纹，质地较为致密，橄榄绿色，边缘清晰呈现黑色菌丝不分枝，分隔处不缢缩，分生孢子椭圆形，侧生于菌丝上注：A1G1分别为真菌BPF6、BPF33、BPF47、BPF55、BPF56、BPF100、BPF106的正面平板菌落形态；A2G2分别为这7株真菌的显微镜分生孢子形态。图2 喙尾琵琶甲成虫肠道抗菌活性真菌在PDA培养基上的形态及显微镜下特征Fig.2 Morphological characteristics of antimicrobial active fungi from the gut of Blaps rynchopetera adults on PDA mediumA2A1B1C1D1D2G1F1E1E2F2G2C2B2喙尾琵琶甲肠道来源真菌的分离及其次级代谢产物的抗菌、抗肿瘤活性筛选 李铭晖等梗木霉属Trichoderma longibrachiatum的序列相似性达100%，真菌BPF47与深绿木霉属Trichoderma atroviride的序列相似性达100%，真菌BPF55与尖孢镰刀属Fusarium oxysporum的序列相似性达100%，真菌BPF56和BPF100与桔青霉属Penicillium citrinum的序列相似性达100%，真菌BPF106与假枝孢菌Cladosporium pseudocladosporioides的序列相似性达100%。将7株真菌的扩增序列提交至GenBank数据库，菌株按照编号数字由小到大对应的序列号为OP364036.1OP364042.1。2.4 肠道真菌对肿瘤细胞的抑制活性采用MTS法对7株喙尾琵琶甲成虫肠道真菌：BPF6、BPF33、BPF47、BPF55、BPF56、BPF100和BPF106的代谢产物进行肿瘤细胞抑制活性测试。结果显示，在测试浓度为100 g/mL 时，7株真菌的代谢产物对5株肿瘤细胞表现出不同程度的抑制活性，其中3株真菌BPF6、BPF33、BPF55对5株肿瘤细胞的抑制率较高，实验结果见表5。3 讨论天然产物骨架类型丰富，生物活性广泛，是创新药物的重要来源。微生物因分布广泛，种类繁多，生境条件多样，生长周期短，发酵技术较成熟，短时间内可大量富集代谢产物等优势获得众多学者的关注。近年来，同一生境下微生物代谢增片段。对扩增产物测序，测序结果通过NCBI数据库中Blast程序进行比对。将同源性高的序列作为参照序列，并运用MEGA 7软件采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树(图3)。结果发现这7株菌归属于5个属，其中，真菌BPF6和BPF33与长.891.图3 邻接法构建的基于ITS基因序列喙尾琵琶甲成虫肠道7株抑菌活性显著真菌的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 7 strains of fungi with strong antimicrobial activity in the gut of Blaps rynchopetera adults constructed by neighbor-joining method based on the ITS sequences0.020100100100100100100100 OP364037.1 Trichoderma longibrachiatum(BPF33)MK284517.1 Trichoderma longibrachiatum MH153613.1 Trichoderma longibrachiatum MT520623.1 Trichoderma longibrachiatum OP364036.1 Trichoderma longibrachiatum(BPF6)MN416777.1 Trichoderma longibrachiatum KX463453.1 Trichoderma longibrachiatum KJ767089.1 Trichoderma longibrachiatum OP364038.1 Trichoderma atroviride(BPF47)MT341775.1 Trichoderma atroviride MT023026.1 Trichoderma atroviride MN795754.1 Trichoderma atroviride OP364039.1 Fusarium oxysporum(BPF55)MT001892.1 Fusarium oxysporum ON677886.1 Fusarium oxysporum ON677884.1 Fusarium oxysporum OP364040.1 Penicillium citrinum(BPF56)MT597829.1 Penicillium citrinum MT597828.1 Penicillium citrinum MT582768.1 Penicillium citrinum OP364041.1 Penicillium citrinum(BPF100)MT487835.1 Penicillium citrinum MT102834.1 Penicillium citrinum MN879404.1 Penicillium citrinum OP364042.1 Cladosporium pseudocladosporioides(BPF106)MF473221.1 Cladosporium pseudocladosporioides MF473219.1 Cladosporium pseudocladosporioides MT582794.1 Cladosporium pseudocladosporioides23221410023142498表5 7株肠道真菌来源代谢产物对肿瘤细胞的抑制活性(100 g/mL)Tab.5 The inhibitory activity of metabolites from 7 strains of intestinal fungi on tumor cells(100 g/mL)菌株编号细胞抑制率/%宫颈癌 Hela肺癌 A549肝癌 SMMC-7721乳腺癌 MDA-MB-231结肠癌 SW480BPF6100.020.0999.700.04 99.460.10 99.880.42 99.260.02 BPF3396.940.05 85.791.51 93.26 0.28 99.470.20 97.860.24 BPF4797.092.7838.212.12 53.031.27 86.051.63 76.281.34 BPF5599.370.34 99.650.03 98.900.15 99.630.15 98.810.18 BPF5631.451.01 26.101.96 39.710.68 42.993.29 40.950.44 BPF10023.702.05 12.932.18 12.531.86 36.261.29 38.292.16 BPF10654.542.15 13.991.12 42.871.07 42.573.17 34.111.32 顺铂(40 mol/L)86.840.7871.660.7577.570.4360.780.0468.671.72紫杉醇(5 mol/L)83.151.3459.520.8866.390.7464.411.0359.881.13产物的重复分离导致新型抗生素发现速度降低，本研究提出以生境特殊、肠道微生物丰富、生存竞争激烈、研究较少的药用昆虫喙尾琵琶甲成虫肠道来源真菌作为新的微生物来源，对后续研究新型抗生素具有重要的指导意义。Yin等25从黄蜻Pantala flavescens肠道内生真菌Curvularia crepinii 中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.892.QTYC-1的代谢物中分离出4个化合物，其中新化合物O-demethylated-zeaenol对苹果黑腐皮壳菌具有抑制作用，可在农业生产领域用作生物防腐剂。Li等26从螽斯Longhorned grasshoppers肠道内生真菌Fusarium proliferatum ZS07的代谢物中分离出6个化合物，其中新聚酮衍生物O-methylated SMA93，对枯草芽胞杆菌具有较强抑制作用，在农业生产上可用作生物防腐剂。本研究对20头喙尾琵琶甲成虫肠道中的真菌进行分离纯化，获得108株形态有差异的真菌，说明其肠道中可培养的真菌资源较为丰富。对108株真菌的代谢产物进行抗菌活性筛选，结果显示有7株真菌的代谢物对病原菌显示出较强的抑制作用(表23)，有3株真菌代谢物对肿瘤细胞表现出较高的抑制率(表5)。鉴定结果显示这7株活性真菌归于5个属(图3)。其中BPF6、BPF33具有较强的抗菌活性和抗肿瘤活性，与其亲缘关系较近的长梗木霉属Trichoderma longibrachiatum真菌，有文献报道27从其代谢物中分离获得5个新化合物，其中化合物Longibramides B 和 E对金黄色葡萄球菌有抑制作用，对乳腺癌细胞MCF-7、小鼠小胶质瘤细胞BV-2具细胞毒作用；Ngo等28从长梗木霉SFC100166的培养液中获取13个化合物，其中11个化合物对不同植物致病真菌具不同程度的抑制作用；深绿木霉的代谢产物能抑制幽门螺旋杆菌以及产志贺氏毒素大肠埃希菌29；尖孢镰刀菌的代谢产物具有广谱的抑菌作用30；桔青霉代谢产物对小鼠肿瘤细胞系具有细胞毒活性，对金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用31；本研究获得的肠道真菌表现出极大的研发潜力，后续可对这些活性真菌进行次级代谢产物及其作用机制研究。研究结果显示喙尾琵琶甲成虫肠道含有丰富的真菌，肠道内存在的抗菌活性真菌，或为虫体自身抵御外来病原菌的侵染提供助力。本研究仅对真菌次级代谢产物的粗提物进行活性筛选，获得了具有一定抗菌活性、抗肿瘤活性的菌株，这为进一步研究喙尾琵琶甲成虫肠道真菌的生物活性物质提供了新的真菌资源。4 结论本研究从喙尾琵琶甲成虫肠道中分离获得108株真菌，其中抗菌活性菌有17株；7株抑菌活性显著的真菌经鉴定归属于5个属；3株真菌的次级代谢产物具有广谱的抗肿瘤活性。该研究表明喙尾琵琶甲肠道来源真菌的次级代谢产物具有一定的抗菌及抗肿瘤活性，为后续进一步挖掘活性次级代谢产物奠定了基础。喙尾琵琶甲肠道来源真菌的分离及其次级代谢产物的抗菌、抗肿瘤活性筛选 李铭晖等参 考 文 献1 Engel P,Moran N A.The gut microbiota of insects-diversity in structure and functionJ.FEMS Microbiol Rev,2013,37:699-735.2 Douglas A E.Multiorganismal insects:Diversity and function of resident microorganismsJ.Annu Rev Entomol,2015,60:17-34.3 Zhang Y L,Ge H M,Zhao W,et al.Unprecedented immunosuppressive polyketides from Daldinia eschscholzii,a mantis-associated fungusJ.Angew Chem Int Ed Engl,2008,47:5823