DB53∕T 1064.1-2021 绿孔雀检疫技术 第1部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范(云南省).pdf

ICS 11.220CCS B 41云南省地方标准DB53/T 1064.12021绿孔雀检疫技术第 1 部分： 禽副黏病毒实验室检测技术规范Quarantine technique for Pavo muticusPart 1: Technical specifications for laboratory examination ofavian paramyxoviruses2021 - 09 - 30 发布2021 - 10 - 14 实施云南省市场监督管理局发 布53DB53/T 1064.12021I目次前言.III引言.I1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.25总则.26仪器设备和试剂.26.1实验室设备.26.2试剂.37样品.37.1采样要求与原则.37.2采集工具.37.3样品类型与采样方法.37.4采样登记表的填写.47.5样品的保存和运输.48试验步骤.48.1鸡胚接种（病毒分离）.48.2病毒血凝（HA）试验和血凝抑制（HI）试验. 48.3禽副黏病毒 L 和 M 基因的 RT-PCR 扩增. 58.4新城疫病毒 F 基因的 RT-PCR 扩增及测序分析.69试验数据处理.79.1HA 试验结果判定.79.2HI 试验结果判定.79.3L 和 M 基因扩增结果判定.79.4F 基因扩增结果及毒力判定.7附录 A（规范性）试剂配制.8附录 B（规范性）采样记录表.10附录 C（规范性）RT-PCR 引物.11DB53/T 1064.12021III前言本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件DB53/T 1064绿孔雀检疫技术的第1部分。DB53/T 1064已经发布了以下部分：第 1 部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范；第 2 部分：禽流感病毒实验室检测技术规范；第 3 部分：羽虱实验室检测技术规范；第 4 部分：消化道线虫实验室检测技术规范。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南省林业与草原局、云南省市场监督管理局共同提出。本文件由云南省林业标准化技术委员会（YNTC02）归口。本文件主要起草单位：云南农业大学、云南省标准化研究院。本文件主要起草人：陈培富、黄艳梅、胡世享、杨敏、卓娜、李宁、钱丽敏、邹丰才、何依蓉、杨建发。DB53/T 1064.12021引言绿孔雀（Pavo muticus）在我国仅分布于云南，是国家级重点保护野生动物，也是全球濒危物种，并已列入濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)和世界自然保护联盟濒危物种红色名录。为切实贯彻 中华人民共和国野生动物保护法 和 中华人民共和国动物防疫法 ， 编制并发布DB53/T 1064绿孔雀检疫技术 地方标准， 可让从事绿孔雀保护的相关人员按标准化和规范化程序开展绿孔雀病原学诊断， 从而采取必要的防治措施， 以提高染疫绿孔雀的成活率， 维护绿孔雀种群健康和地区生态平衡，提升生物多样性保护成效。本文件已发布4个部分：第 1 部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范。本部分从禽副黏病毒实验室检测技术的总则、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；第 2 部分：禽流感病毒实验室检测技术规范。本部分从禽流感病毒实验室检测技术的总则、禽流感病毒毒株的毒力划分和血清亚型、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；第 3 部分：羽虱实验室检测技术规范。本部分从羽虱实验室检测的原理、试验条件、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；第 4 部分： 消化道线虫实验室检测技术规范。 本部分从消化道线虫实验室检测技术的试验原理、常见线虫形态特征、试验条件、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范。DB53/T 1064.120211绿孔雀检疫技术第 1 部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范重要提示：本检测技术规范中，氯仿有中等毒性，操作时应在通风条件下进行并戴手套和口罩，不小心接触皮肤应立即冲洗；凝胶电泳若使用溴化乙啶（EB）作核酸染色剂，操作时应戴手套和口罩，被EB污染的物品要进行无害化处理；操作焦碳酸二乙酯（DEPC）应戴手套和口罩并在通风条件下，不小心接触皮肤应立即冲洗。 由于新城疫病毒可引起人一过性结膜炎， 采样及检测人员应佩戴口罩和防护眼镜，并采取必要的消毒措施。 本文件中凡接触病毒样品的检验器材、 废弃物及其包装物均应做消毒或灭菌无害化处理，以免污染环境或扩散病毒。1范围本文件规定了绿孔雀（Pavo muticus）检疫技术中禽副黏病毒实验室检测技术涉及的总则、仪器设备和试剂、样品、试验步骤和试验数据处理。本文件适用于绿孔雀检疫技术中禽副黏病毒实验室检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 标注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T 1948兽医实验室生物安全要求通则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1禽副黏病毒 avian paramyxoviruses一类感染家禽和野禽的单链负股RNA病毒，属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒属（Avulavirus），包括至少禽副黏病毒19血清型，其中禽副黏病毒1型又称作新城疫病毒（Newcastle disease virus），其致病性最受关注。3.2F 蛋白酶切位点 cleavage site of F protein新城疫病毒融合蛋白（F）的F2亚基（位于F氨基端）与F1亚基（位于F羧基端）之间被宿主细胞蛋白内切酶识别的一个短肽，由113117位氨基酸残基组成，其中113116位可能含多个碱性氨基酸，如精氨酸（R）或赖氨酸（K）。3.3病毒血凝试验 viral hemagglutination testDB53/T 1064.120212利用有血凝活性的病毒与特定动物的红细胞结合而使红细胞凝集 （即红细胞不再自然下沉汇集） 的特性，测定病毒效价即滴度的方法。3.4病毒血凝抑制试验 viral hemagglutination inhibition test使用抗体阻断或抑制病毒的血凝活性，用于测定血清抗体效价或病毒种类的一种方法。4缩略语下列缩略语适用于本文件。AMV：禽成髓细胞瘤病毒 Avian myeloblastosis viruscDNA：互补DNA complementary DNADEPC：焦碳酸二乙酯 DiethypyrocarbonatedNTP：脱氧核苷酸 Deoxyribonucleotide triphosphateEB：溴化乙啶 Ethidium bromideF：融合蛋白 Fusion proteinHA：血凝 HemagglutinationHAU：血凝单位 Hemagglutination unitHI：血凝抑制 Hemagglutination inhibitionL：大聚合酶蛋白 Large polymerase proteinM：基质蛋白 Matrix proteinNDV：新城疫病毒 Newcastle disease virusPBS：磷酸缓冲盐溶液 Phosphate-buffered salinePCR：聚合酶链式反应 Polymerase chain reactionRBCs：红细胞 Red blood cellsRNA：核糖核酸 Ribonucleic acidRT-PCR：反转录-聚合酶链式反应 Reverse-transcription polymerase chain reactionSPF：无特定病原体 Specific pathogen free5总则5.1采用鸡胚接种方法从绿孔雀检测样品分离禽副黏病毒。5.2取5.1得到的鸡胚尿囊液做病毒血凝（HA）试验和血凝抑制（HI）试验，确定分离毒株的种属和血清型（亚型）。5.3用RT-PCR扩增分离毒株的RNA聚合酶（L）基因和基质蛋白（M）基因，对禽副黏病毒及其第1血清型（新城疫病毒）分别做出鉴定。5.4对5.2或5.3确定的新城疫病毒分离株，采取RT-PCR扩增其融合蛋白（F）基因，再做测序分析，对新城疫病毒分离株做出毒力判定。6仪器设备和试剂6.1实验室设备6.1.1PCR 仪：温度范围 4.0 99.9 ，样品基座配置至少包括单个 0.2 mL 孔。DB53/T 1064.1202136.1.2凝胶成像系统：对 EB 染色的 DNA 检测灵敏度低至 0.1 ng；有效像数 1 3601 024、10 bit，数据线接口 USB 2.0。6.1.3冷冻高速离心机：最高离心力 20 000 g；容量 1.5 mL 12。6.1.4电泳仪：电压 50 V120 V，电流 10 mA800 mA，定时 0min999min。6.1.5电泳槽：耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液新鲜且容量充足。6.1.6冰箱：具有冷藏和冷冻功能分区（20 4 ）。6.1.7微量移液器： 单道可调， 量程 0.5 L10 L、 2 L20 L、 10 L100 L 和 100 L1 000 L。6.1.8水浴锅：温度范围 20 100 。6.1.9过滤器：一次性无菌用品，内含孔径 0.45 m 的滤膜。6.1.10V 形孔血凝反应板：一次性或可重复使用的血凝反应板。6.2试剂6.2.1阿氏液（Alsevers Solution），pH 7.2、0.01 mol/L 磷酸缓冲盐溶液（PBS）、1%健康未免疫鸡红细胞悬液、标准新城疫病毒抗原、阳性对照血清和阴性对照血清。6.2.2RNA 提取试剂盒、氯仿、异丙醇、75%乙醇、1.0%琼脂糖凝胶、50TAE 缓冲液、10 g/L 溴化乙啶（EB）或其他可替代的核酸染料、DNA 分子量标准、2Taq Master Mix、无 RNA 酶灭菌超纯水（DEPC 处理水）、10扩增反应缓冲液、dNTPs、RNase 抑制剂（40 U/L)、AMV 反转录酶（5 U/L） 、胶回收试剂盒。6.2.3试剂配制见附录 A。7样品7.1采样要求与原则7.1.1采样应符合 NY/T 541 的要求。7.1.2采集的样品具有代表性，应从濒死、死禽和处于急性发病期的绿孔雀采集样品，对暴发疫病的群体宜采集多只发病或死亡个体的样品，采样过程应无菌操作，容器应密封，注意避免被污染。7.2采集工具棉拭子、剪刀、镊子、1.5 mL离心管、研钵等采样工具经121 、20min高压灭菌并烘干。7.3样品类型与采样方法7.3.1组织样品取病死孔雀待检样品，采集肺脏（或气管）、脑、心、肝、脾、胃、肾等组织各1份，每份不少于3 g，置于洁净样品袋或平皿内。将样品封口贴上标签，做好标记。7.3.2拭子样品7.3.2.1取待检样品，采集喉气管拭子和泄殖腔拭子（或新鲜粪样）各 1 份，将拭子样品端剪下或折断，分别置于无菌试管或器皿中，加 1.0 mL1.5 mL 含抗生素的 PBS。将样品封口，贴上标签，做好标记。7.3.2.2抗生素含量视具体情况而定：a)对气管拭子，PBS 应含青霉素（1 000 U/mL）、链霉素（1 mg/mL）或卡那霉素（50 g/mL）和制菌霉素（1 000 U/mL）；DB53/T 1064.120214b)对泄殖腔拭子和粪便 PBS，上述抗生素浓度应提高至 5 倍。7.3.3血清样品采集静脉血液2 mL3 mL于无菌离心管中，自然放置析出血清，3 000 r/min离心10min，将血清转移、分装于新的无菌试管中，盖紧盖子，封好口，贴上标签。不同个体的血清样品不能混合。7.3.4整只采样将病死孔雀装入封闭的无毒塑料袋内，至少用两层塑料袋包装，封口并贴上标签，作好标记。7.4采样登记表的填写填写采样记录表（见附录B），样品编号应与标签一致，随样品送至符合NY/T 1948要求的实验室。7.5样品的保存和运输7.5.1样品应置于加干冰或冰袋的保温瓶或隔热泡沫盒中运输， 也可用液氮罐运输， 保温容器应密封，防止渗漏。保温容器外贴封条，封条有贴封人（单位）签字或盖章，并注明贴封日期。7.5.2所有样品在 4 以下运输，拭子样品和组织样品应作暂时的冷藏（4 ）或冷冻（20 ）处理，随即送至实验室。7.5.3血清样品宜单独存放。若 24 h 内可运达实验室，在保温箱内加冰袋冷藏运输；若超过 24 h，应先冷冻，其后在保温箱内加大量冰袋运输，途中不能超过 48 h。7.5.4各种样品到达实验室后，若暂时不进行处理，则应冷冻（20 以下）保存，不应反复冻融。8试验步骤8.1鸡胚接种（病毒分离）8.1.1样品处理将棉拭子在PBS中充分混匀至拭子上没有肉眼可见的样品；粪便、研碎的组织加样品稀释液充分研磨，按照1 g 组织加10 mL PBS的比例混成悬液。样品液经3 000 r/min离心10min，取上清液用滤器过滤，再取滤过液作为接种材料。8.1.2样品接种取按8.1.1处理完毕的样品，以0.2 mL/胚的量经尿囊腔途径接种孵化9 d11 d的SPF鸡胚，每个样品接种35枚鸡胚， 在37 孵化箱内孵育， 每天上午和下午定点观察鸡胚死亡情况。 无菌收集24 h 96 h死亡鸡胚及96 h仍存活鸡胚的尿囊液，用于病毒血凝试验以测定有无HA活性。8.2病毒血凝（HA）试验和血凝抑制（HI）试验8.2.1病毒血凝（HA）试验8.2.1.1在 96 孔 V 型微量反应板，每孔预先加 25 L PBS。8.2.1.2向第 1 孔加入 25 L 尿囊液，反复吹吸 3 次5 次混匀。8.2.1.3从第 1 孔吸取 25 L 溶液加入第 2 孔，混匀后吸取 25 L 加入第 3 孔，如此进行 2 倍连续稀释至第 11 孔，从第 11 孔吸取 25 L 溶液弃去，但第 12 孔加入 25 L PBS 或正常尿囊液作为阴性对照孔。DB53/T 1064.1202158.2.1.4每孔加入 25 L PBS。8.2.1.5每孔加入 25 L 1%鸡红细胞悬液。8.2.1.6轻轻振荡血凝反应板以混匀反应体系，室温（20 25 ）静置 40min，或 4 静置 60min，当阴性对照孔的红细胞在孔底汇集成原点时判定结果。8.2.2病毒血凝抑制（HI）试验8.2.2.1在 96 孔血凝反应板，每孔预先加入 25 L PBS。8.2.2.2向第一孔加入 25 L 血清样品，混匀。8.2.2.3在血凝反应板上将血清作横向的 2 倍连续稀释，但第 12 孔、第 13 孔、第 14 孔和第 15 孔分别设置为加 25 L PBS 的红细胞对照孔、加未做任何免疫禽血清的阴性对照孔、加禽流感病毒抗体的对照孔和加禽腺病毒抗体的对照孔（对已确定禽副黏病毒血清型的分离毒株，还可设置阳性对照孔）。8.2.2.4每孔加入 25 L 4 HAU 的病毒抗原，室温（20 25 ）静置不少于 30min，或 4 静置不少于 60min。8.2.2.5每孔加入 25 L 1%RBCs，轻轻振荡混匀，室温（20 25 ）静置约 40min，或 4 放置约 60min，当红细胞对照孔呈显著钮扣状时判定结果。8.3禽副黏病毒 L 和 M 基因的 RT-PCR 扩增8.3.1病毒 RNA 的提取可用商品化 RNA 提取试剂盒提取待检样品（棉拭子、组织或鸡胚尿囊液）、阳性对照样品及阴性对照样品的病毒 RNA。也可用 RNA 提取试剂（如 Trizol）提取，方法如下：a)将经过预处理的 250 L 待检样品加入 750 L RNA 提取试剂（如 Trizol）中，振荡 2min，室温放置 5min；b)加入250 L氯仿， 在微量振荡器上振荡1min， 室温放置5min后， 4 、 12 000 r/min （约14 000g）离心 15min；c)吸取上层水相转入一新的离心管中，加入等量的异丙醇，混匀，室温放置 15min，4 、12 000r/min（约 14 000g）离心 15min；d)小心吸弃上清，加入 DEPC 处理的 75 %乙醇 750 L，4 、12 000 r/min （约 14 000g）离心5min；e)小心吸弃上清，将沉淀自然风干或于 50 干燥箱中晾干，加适量的 DEPC 处理水溶解；f)取 5 L 提取物与 1 L 6核酸上样缓冲液混匀，做 1%琼脂糖凝胶电泳检查 RNA 提取效果，对组织样品观测到 28S、18S 及 5.8S rRNA 三个条带或至少前两个条带，提示 RNA 提取合格；g)提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT 或 RT-PCR 扩增，若需长期保存 RNA，应置于80 冰箱或液氮内。8.3.2RT-PCR 扩增（两步法）8.3.2.1反转录反应（cDNA 的合成）：取提取的 RNA 11 L，加入 2 L、10 mo1/L 的反转录引物（见附录 C），4 L 5反转录缓冲液、0.5 L 反转录酶、0.5 L RNA 酶抑制剂、2 L dNTP Mixture 至20 L，42 孵育 1 h，即得到 cDNA 溶液，直接用于 PCR 扩增或20 冻存备用。8.3.2.2PCR 扩增体系：在反应管中依次加入 8 L 无核酸酶水、10 L 2Taq Master Mix、1 L 上述cDNA 溶液、0.5 L 上游引物和 0.5 L 下游引物（见附录 C，引物浓度均为 10 mol/L），混匀，瞬时离心，使液体全部集中于管底。DB53/T 1064.1202168.3.2.3PCR 扩增条件：94 预变性 3min，94 变性 10s，56 退火 30s，72 延伸 25s，循环 30次，72 延伸 5min。扩增反应结束后立即取扩增产物进行电泳检查或置于 4 冰箱备用。8.3.3扩增产物的电泳检测制备1.5 %琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入1TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3 L5 L扩增产物加到凝胶孔，加入5 L DNA分子量标准。恒压（8 V10 V/cm凝胶长度）电泳30min40min，随后取出凝胶，置于凝胶成像系统下观察扩增结果。8.4新城疫病毒 F 基因的 RT-PCR 扩增及测序分析8.4.1病毒 RNA 的提取按照 8.3.1 步骤进行。8.4.2引物针对新城疫病毒F基因设计的引物见附录C。8.4.3RT-PCR 扩增（一步法）8.4.3.1RT-PCR 扩增体系配制见表 1。体系配好后，盖紧 PCR 反应管盖，并做好标记。8.4.3.2使用瞬时离心使液体都沉降到PCR管底。 同时设立阳性对照和阴性对照。 PCR扩增程序： 42 反转录 30min； 95 预变性 3min； 94 变性 30s， 55 退火 30s； 72 延伸 45s 共进行 35 次循环； 72 再延伸 7min。PCR 产物置于 4 保存或20 冻存备检。表 1RT-PCR 扩增体系组分体积（L）无 RNA 酶灭菌超净水14.610扩增反应缓冲液2.5dNTPs（2.5 mmol/L each）2.0RNase 抑制剂（40 U/L）0.5AMV 反转录酶（5 U/L）0.7Taq 酶（5 U/L）0.7F 基因上游引物（10 mol/L）0.5F 基因下游引物（10 mol/L）0.5模板 RNA3.0总计258.4.4扩增产物电泳检查参照8.3.3操作。8.4.5测序分析将PCR产物用胶回收试剂盒回收、纯化，做核酸测序，所获序列用DNAstar（5.0）分析并在NCBI网站上做BLAST在线比对。根据核苷酸序列推导分离毒株F的氨基酸序列，确定内切蛋白酶识别位点的碱性氨基酸数量。DB53/T 1064.1202179试验数据处理9.1HA 试验结果判定9.1.1将血凝反应板倾斜呈约 60， 观察 RBCs 有无呈泪珠样流淌， 出现泪珠样流淌的反应孔判定为病毒血凝阴性。9.1.2完全凝集（无泪珠样流淌）的病毒最大稀释倍数为该病毒样品（尿囊液）的血凝滴度，其相应的病毒含量表示为 1 个血凝单位（HAU)，再根据开始的稀释倍数精确计算血凝滴度。9.1.3血凝判定标准：红细胞均匀分散在孔内、倾斜血凝板时不流淌判为完全凝集，记作+；75%凝集记作+；50%凝集记作+；25%凝集记作+；红细胞汇集于孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时与对照孔（仅含 25 L RBCs 和 50 L PBS）RBCs 流淌相同的孔判定为不凝集，记作。9.2HI 试验结果判定9.2.1红细胞均匀分散在孔底周围、 倾斜血凝板时不流淌判为完全凝集， 记作+； 75%凝集记作+；50%凝集记作+；25%凝集记作+；红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时与对照孔（仅含 25 LRBCs 和 50 L PBS）RBCs 流淌相同的孔判定为不凝集或血凝被抑制，记作。9.2.2完全抑制 4 HAU 病毒抗原的最高血清稀释倍数为该血清的 HI 滴度。9.2.3检查各种对照：阴性对照血清 HI 滴度不高于 4（记作 22或 2 log2），阳性对照血清 HI 滴度应在已知滴度的一个稀释度以内，红细胞对照应无自凝现象，结果有效，试验成立。9.2.4如果高于 1:16（24或 4 log2）稀释度的血清能抑制 4 HAU 的病毒抗原，HI 滴度被判为 HI 抗体阳性，表明动物发生新城疫病毒感染或接种过新城疫疫苗。9.2.5如果血清 HI 滴度为 16，判为可疑，需重复 HI 试验，若 HI 滴度仍为 16，可判定血清抗体阳性，若 HI 滴度为 8 则判定为血清抗体阴性。9.2.6在所有的确诊试验中针对试验采用的 HAU 应设病毒 HA 滴度的追溯性测定。9.2.7当血凝活性不被禽流感病毒抗体和禽腺病毒抗体阻断，便可初步判定为禽副黏病毒阳性。9.3L 和 M 基因扩增结果判定使用L基因引物做PCR扩增呈阳性结果时，禽副黏病毒各血清型的扩增产物均约121 bp。进而使用M基因引物扩增NDV阳性对照、阴性对照和待测分离毒株，其扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，阴、阳性对照同时成立表明试验有效，否则试验无效。在阴、阳性对照结果成立的前提下，如果待检样品的RT-PCR产物凝胶电泳后在约300 bp位置出现特异性的单一条带，则初步判定为禽副黏病毒1型即NDV核酸阳性。9.4F 基因扩增结果及毒力判定9.4.1试验成立条件：凝胶电泳阳性对照出现约 535 bp 扩增条带，同时阴性对照无扩增条带。9.4.2待检样品出现 535 bp 左右的目的片段（与阳性对照大小相符），判为新城疫病毒核酸阳性；待检样品未出现目的片段，判为新城疫病毒核酸阴性。9.4.3若 NDV 分离毒株 F2 亚基的羧基端有 3 个以上碱性氨基酸（精氨酸或赖氨酸）残基而 F1 亚基的氨基端即 117 位为苯丙氨酸，判定该分离毒株为 NDV 强毒株。DB53/T 1064.120218AA附录A（规范性）试剂配制A.11.5%琼脂糖凝胶称取琼脂糖1.5 g，放入100 mL 1TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60 时，加入5 L核酸染料，迅速混匀并铺板，使凝胶厚度为3 mm5 mm。A.250TAE电泳缓冲液A.2.10.5 mol/L EDTA溶液（pH8.0） ：称取EDTA 18.61 g，加灭菌双蒸水至100 mL，后用氢氧化钠调pH至8.0。A.2.250TAE电泳缓冲液：Tris碱242 g，冰乙酸57.1 mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL，加灭菌双蒸水溶解至1 000 mL。A.3溴化乙啶（EB）溶液溴化乙啶20 mg，加灭菌双蒸水溶解至20 mL，避光保存。A.4DEPC处理的双蒸水焦碳酸二乙酯（DEPC）50 L，加灭菌双蒸水至100 mL，室温放置6 h8 h，121 2 高压灭菌20min，分装到DEPC处理过的1.5 mL离心管。A.5阿氏液（Alsevers Solution）A.5.1阿氏液配方见表A.1。表 A.1阿氏液配方序号成分含量(g/100 mL)1葡萄糖2.052柠檬酸钠0.803柠檬酸0.0554氯化钠0.42A.5.2配制方法：加蒸馏水100 mL，加热溶解后调pH值至6.1，69 kPa 15min高压灭菌，4 保存备用。A.6pH7.2、0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）A.6.1配制25PB磷酸氢二钠 2.74 g ；磷酸二氢钠 0.79 g ；加蒸馏水 100 mL。A.6.2配制1PBSDB53/T 1064.12021925PB 40 mL；氯化钠 8.5 g；加蒸馏水至1 000 mL，调pH值至7.2，121 高压灭菌30min或过滤除菌，4 保存备用。A.71%鸡红细胞悬液采集至少3只未曾接种任何疫苗、无新城疫抗体的健康公鸡的血液，与等体积的阿氏液混合，用pH7.2、0.01 mol/L PBS洗涤35次，每次均以2 000 r/min（100 g 200 g）离心10min，洗涤后留取红细胞，再用PBS配制成体积分数为1%红细胞悬液，4 保存备用，有效期1 周。DB53/T 1064.1202110BB附录B（规范性）采样记录表绿孔雀采样记录表见表B.1。表 B.1绿孔雀采样记录表样品编号采集份数 采集地名称海拔经度纬度采集日期 发病时间免疫与用药史疾病特征采集人DB53/T 1064.1202111CC附录C（规范性）RT-PCR 引物RT-PCR引物见表C.1。表 C.1RT-PCR 引物引物名称序列（53）预期产物长度（bp）反转录引物AGC AAAAGC AGGL 基因上游引物GAR GGI YII TGY CAR AAR NTN TGGAC121L 基因下游引物TIAYIG CWATIR IYT GRT TRT CNC CM 基因上游引物CGAAGAGCC CGT TAG TCAAAT C297M 基因下游引物GTATCT TAG CAACTT GGG GAGF 基因上游引物ATG GGC YCCAGAYCT TCTAC535F 基因下游引物CTG CCACAG CTAGTT GTGATAATC C_DB53/T 1064.12021