NY∕T 3257-2018 水稻稻瘟病抗性室内离体叶片鉴定技术规程(农业).pdf

ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3257一2018水稻稻瘟病抗性室内离体叶片鉴定技术规程Technical code of practice for wounding inoculation of detached leaves for evaluation of rice resistance to the blast fungus (Magnaporthe oryzae) 2018-07-27发布2018-12 -01实施中华人民共和国农业农村部发布剧吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位:全国农业技术推广服务中心、中国农业大学。本标准主要起草人:赵文生、彭友良、杨普云、杨俊、朱晓明。NY/T 3257-2018 I NY/ T 3257一2018水稻稻瘟病抗性室内离体叶片鉴定技术规程范围本标准规定了水稻对稻瘟病抗性的室内离体叶片鉴定技术方法和评价标准。本标准适用于常规水稻资源、品种、品弃华幽国iiOI5J宰内鉴定和评价。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的件。凡是不注日期的引GB/ T 15790稻GB/ T 19557.7 3 术语和定义下列抗病性植物体所人工接种在适宜条件抗性评价根据采用接种体inoculum 能够侵染寄主并引水稻稻瘟病the rice blast 由丝状真菌稻瘟病菌(有1主态恤r.Jheozae，无出gJiculaa oryzae)引起的水稻真菌病害。依据病害发生的时期和部位，槽-冒了叶枕瘟、穗颈瘟、枝梗瘟、粒瘟和茎节瘟。番茄燕麦培养基oat tomato agar 用于稻瘟病菌培养。称取40 g燕麦片，800mL水煮沸留滤液，加入150mL番茄汁、15g琼脂粉，定容至1L。4 病原物的采集、分离和保存4. 1 病样采集在待测水稻材料的适合种植地区或拟推广地区代表性地块种植普感品种丽江新团黑谷，种植全程NY/T 3257-2018 不施用杀菌剂。在田间叶瘟发生期(一般为分囊期至抽穗扬花期)，采集具有典型稻瘟病病斑的水稻叶片。4.2 病菌分离剪取含有单个典型病斑的水稻叶段，浸水展开，经次氯酸铀消毒和无菌水漂洗之后，用灭菌滤纸吸干叶段上的水，平铺于水琼脂板上。于280C光照培养箱中约5d，可观察到稻瘟菌的元性繁殖体(包括营养菌丝、分生抱子梗和分生抱子)。在体视显微镜下，用挑针挑取叶段上的稻瘟菌分生抱子，并置于含有四环素等抗生素的水琼脂板上，280C光照培养箱中培养。12h24 h后，用挑针在体视显微镜下挑取萌发的单个稻瘟菌分生抱子。含有单个稻瘟菌分生于包子的琼脂块要尽可能小，且背景干净、元杂质。4. 3 病菌培养将挑取的单个稻瘟菌分生抱子块转移至番茄燕麦培养基上，于280C光照培养箱中培养，3d5 d后可长出稻瘟菌菌落。4. 4 病菌保存确认长出的稻瘟菌菌落生长良好，无杂菌污染。挑取菌落边缘的新生菌丝至贴有灭菌滤纸片的番茄燕麦培养基上，于280C光照培养箱中培养。待稻瘟菌菌落长满滤纸片(7d9 d)，确认元杂菌污染后，收集滤纸片于灭菌的硫酸纸袋内，编号，并于超净工作台内吹干。将装有稻瘟菌的硫酸纸袋放人灭菌的信封内，于干燥器中干燥7d10 d;然后放置于盛有硅胶干燥剂的塑料盒内，于-200C冰箱中长期保存。每个病斑只分离、保存1个单抱菌株。5 水稻的种植与管理根据需要称取适量的供试(待测)水稻种子，按常规方法种植水稻幼苗，待水稻生长至3叶7叶龄期用于接种。6 接种体的制备稻瘟菌菌丝块或分生抱子悬浮液均可作为室内接种鉴定的接种体。6. 1 菌丝块从冰箱中取出保存的滤纸片，平铺在番茄燕麦培养基的中央部位，于280C光照培养箱中培养。5 d7 d后，用菌落边缘的菌丝块作为接种体。在番茄燕麦培养基上转接培养的菌丝块也可作为接种体。6. 2 分生于包子悬浮液6.2. 1 产抱在番茄燕麦培养基上活化稻瘟菌，待其菌落直径长至接近培养基边缘时，在超净工作台内往培养皿中加人适量元菌水润湿菌落，片刻后用无菌的涂菌环将菌丝打断成细小碎段，用移液器将菌丝液混匀，转移到新的厚番茄燕麦平板上(培养基厚度大于培养皿厚度的2/3)，再用同一无菌涂菌环涂布均匀，吹干，于280C光照培养箱中培养1.5d或2d左右，待番茄燕麦平板上长出气生菌丝，加元菌水到培养皿中;用棉签将培养基表面菌丝轻轻擦去，避免损伤培养基表面;用水将菌丝段冲洗干净、晾干，再用双层纱布盖在培养皿上。280C光照培养箱中培养2d3 d，培养基表面即可生成大量的分生抱子。6.2.2 制备抱子悬浮渡在产抱培养皿上加人含O.025 % Tween 20的灭菌水，用玻璃洗菌棒将菌落表面形成的分生抱子洗下，再用双层擦镜纸过滤分生抱子液至5mLEP管中。充分混匀分生抱子液，用血球计数板测定袍子浓度。重复测定3次，取平均值。将分生抱子悬浮液浓度调至105个抱子/mL，且保证菌液不少于2mL。分生抱子悬浮液需现配现用。NY/T 3257-2018 离体叶片划伤接种7. 1 叶片的准备剪取充分展开心叶的中下部叶段(长度约为5cm)，用灭菌的昆虫针在叶正面、垂直于主叶脉制造微创伤，每个叶段均匀分布3个微创伤点，每个点长约2mm，注意不能划穿叶片。接种前准备盛放待测水稻叶片的培养皿:将滤纸裁剪成直径约8cm的圆片，把2层3层灭菌滤纸片平铺于直径为9cm的塑料培养皿内，添加自来水浸湿滤纸片，去掉培养皿内的流动水。将2根灭菌牙签放入培养皿内用于搭放水稻叶片，牙签间距2cm3 cm。注意叶面上的划伤点不要摆放在牙签上，防止抱子液的液滴滑落或导致叶片易变黄。7.2 接种接种前，先在划伤叶段上均匀喷洒含O.025 % Tween 20的灭菌水。如以菌丝块为接种体，用打孔器或刀片在菌落近边缘处取0.5cmXO. 5 cmXO. 5 cm的菌丝块，倒置于叶片划伤点上，轻压以使菌丝块充分接触叶面划伤部位。如以分生于包子悬浮液为接种体，混匀抱子悬浮液后，用200L的移液器在划伤点处点接5L10L抱子液滴，液滴太大易滑落，太小发病不充分。每个叶片3个接种点，3次独立重复。7. 3 接种后处理将含有接种水稻叶段的培养皿先放置于相对湿度100%、260C下，黑暗培养24h36 h;再将培养皿摆放在260C、光照条件下保湿培养，每天喷水1次2次，观察叶片发病情况。根据发病情况，在接种后96 h168 h拍照、记录。7 1 抗病性评价8. 1 抗感性判别抗性病斑仅局限于叶片划伤处，呈褐色点状，病斑中无分生抱子形成，即为+。感病病斑呈梭形，中央灰色的崩溃部生有菌丝和分生抱子，崩溃部的外围可能有褐色坏死，最外层是淡黄色的中毒部，形状不规则，边缘呈现出暗绿色记为。8. 2 接种菌株的数量室内评价待测水稻材料的抗瘟性，所用菌株须为从拟推广地区(建议以县或县级市为单位)种植的普感品种丽江新团黑谷上分离的单抱菌株，菌株数量不少于300株/县或连续3年，每年不少于100株。8. 3 重复接种对于第一次接种出现抗病病斑或不典型感病病斑的菌株，要再进行2次重复接种。3次接种均为抗病病斑的记为+;3次接种中只要有一次出现感病病斑，记为一。8. 4 接种有效性判别每次接种均以普感品种丽江新团黑谷为对照，对照叶片上出现典型的感病病斑时，接种有效。8.5 抗谱计算按式(1)计算。8 C =?lOO(l) 式中:-一形成抗病病斑的菌株数，单位为个;b一一总接种菌株数，单位为个;C一-抗谱，单位为百分率(%)。3 NY/T 3257-2018 8. 6 抗瘟性评价标准依据待测材料的室内抗谱评价其在当地大田的抗性潜力，具体评价标准见表1。表1水稻稻瘟病抗性的评价标准抗性评价抗病Resistant(R)中抗Moderatelyresistant(MR) 中感ModeratelySusceptible(MS) 感病评价标准(C)，%c二三7050C70 -1i 4 FON|khmN的回问Z中华人民共和国农业行业标准水稻稻瘟病抗性室内离体叶片鉴定技术规程NY/ T 3257- 2018 争等中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100125网址:.ccap. COn1. cn) 北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销争导* 争e印张O.75 字数15千字2018年11月北京第1次印刷争e开本880nnnnX1230nnnn 1/16 2018年11月第1版书号16109 4612 定价18.00元争争版权专有侵权必究举报电话[phone] NY/T 3257-2018