《天然药物化学实验指导》中黄酮类化合物显色反应的考证.pdf

2793中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 天然药物化学实验指导 中黄酮类化合物显色反应的考证秦凌月1，谢文豪2，彭越2，韩清娟3，黄秀凝1，刘艳霞1*（1.陆军军医大学药学与检验医学系生药学与中药学教研室，重庆400038；2.陆军军医大学基础医学院无军籍地方生大队20队，重庆400038；3.陆军军医大学药学与检验医学系药物分析与分析化学教研室，重庆400038）摘要：目的探究天然药物化学实验教学中黄酮化合物显色反应多样化及与配套理论教材描述不相符的原因，为 天然药物化学实验指导 中“碱-酸法提取芦丁”实验教学提供参考。方法采用师生合作的方式，以芦丁、槲皮素、芹菜素为对照品，进行精制芦丁供试品的盐酸-镁粉反应、Molish反应和 ZrOCl2/枸橼酸反应的鉴定，同时供试品进行聚酰胺薄层色谱分析。结果显色反应表明精制芦丁供试品中含有具 3-OH 的杂质，薄层色谱表明该杂质为槲皮素。结论 天然药物化学实验指导 中，采用 ZrOCl2/枸橼酸反应鉴定精制芦丁供试品时，芦丁中含有少量槲皮素会造成溶液不褪色或不完全褪色。这种现象在实验课中可探究或给予解释。关键词：天然药物化学；实验教学；芦丁；显色反应中图分类号：O657.3文献标识码：A文章编号：1672-2981(2023)10-2793-04doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2023.10.040Chromogenic reaction of flavonoids in Experiment Instruction of Natural Pharmaceutical ChemistryQIN Ling-yue1,XIE Wen-hao2,PENG Yue2,HAN Qing-juan3,HUANG Xiu-ning1,LIU Yan-xia1*(1.Department of Pharmacognosy and Traditional Chinese Medicine,Faculty of Pharmacy and Laboratory Medicine,Army Medical University,Chongqing 400038;2.The 20th Non-military Undergraduate Student Brigade,College of Basic Medical Science,Army Medical University,Chongqing 400038;3.Department of Pharmaceutical Analysis and Analytical Chemistry,Faculty of Pharmacy and Laboratory Medicine,Army Medical University,Chongqing 400038)Abstract:Objective To determine the diversity of flavonoids chromogenic reaction in the experimental teaching of Natural Pharmaceutical Chemistry,and analyze the inconsistency in the chromogenic reaction with the description in the corresponding theoretical textbook.Methods With the help of teachers and students,refined rutin was identified by hydrochloric-magnesium powder,Molish and ZrOCl2/citric acid reactions with rutin,quercetin and apigenin as reference.The polyamide thin layer chromatography of the test rutin was conducted.Results The chromogenic reactions showed impurity harboring 3-OH in the test rutin,and the thin layer chromagraphy showed the impurity was quercetin.Conclusion In the Experimental Instruction of Natural Pharmaceutical Chemistry,when ZrOCl2/citric acid reaction is used to identify the test refined rutin,a small amount of quercetin in it would cause the solution not to fade or not to fade completely.This phenomenon can be explained in the laboratory.Key words:natural pharmaceutical chemistry;experimental teaching;rutin;chromogenic reaction基金项目：陆军军医大学教育改革研究课题（No.2021B08）。作者简介：秦凌月，女，助教，主要从事药用植物内生菌活性成分作用机制研究，email：*通信作者：刘艳霞，女，讲师，主要从事药学教育与新药研发，email：liuyibin_药学教育2794Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期天然药物化学是药学、中药学专业的专业必修课，是运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分的一门学科，主要研究天然药物中各类化学成分的结构特征、物理化学性质、提取分离方法、结构鉴定与生物活性、生物合成规律及途径、体内外动态变化等1。笔者所在教研室承担药学四年制本科的天然药物化学授课任务，理论课 56 学时、实验课 54 学时。实验课共设置三个实验，均为 18 学时，其中实验二为“碱-酸法提取芦丁”。芦丁（rutin）是糖苷类黄酮的一种，由槲皮素（quercetin）3 位上的羟基与芸香糖（葡萄糖与鼠李糖 1-6 连接而成的双糖）脱水而成，超过 70种植物或植物来源的粮食中均含有该黄酮，如杏、葡萄、荞麦种子、樱桃、洋葱、李子和橙子等2。芦丁除具有维生素 P样作用外，还具有多种药理活性，包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗细菌与真菌，广泛应用于多种疾病的治疗 3。1事件概述及原因分析天然药物化学实验课程的选用教材为人民卫生出版社的 天然药物化学实验指导（第 4 版），配套的理论教材为 天然药物化学（第 7 版）4-5。在 20222023 学年秋季学期“碱-酸法提取芦丁”实验教学中，学生通过碱溶酸沉法从槐米（豆科植物槐 Sophora japonica的花蕾）中提取芦丁，并依据其在冷水、热水中的溶解度差异进行精制；用 ZrOCl2/枸橼酸显色反应鉴定精制芦丁时，学生加入 2%ZrOCl2/甲醇溶液后溶液颜色变黄，但继续加入 2%枸橼酸/甲醇后溶液未发生褪色现象，与配套理论教材中关于锆盐实验原理的描述（黄酮类化合物分子中有游离的 3-OH 或5-OH时，3-OH或 5-OH、4-酮基与锆盐试剂生成黄色锆络合物，但 3-OH、4-酮基络合物的稳定性较 5-OH、4-酮基络合物强，故加入枸橼酸后，5-OH 黄酮的溶液显著褪色，而 3-OH 黄酮仍呈鲜黄色4）不相符。超出了学生理解范畴，使学生对该实验产生了质疑。首先核对试剂，未有异常情况发生。其次分析原因，ZrOCl2/枸橼酸反应的溶液未褪色，猜测可能是芦丁的纯度不高，其中含具有 3-OH 的杂质，杂质的 3-OH、4-酮基与 Zr4 形成稳定的络合物，使得加入 2%枸橼酸/甲醇后溶液不褪色。为考证该猜想是否成立，采用师生合作的方式，使用芦丁（黄酮醇苷，含 5-OH）、槲皮素（黄酮醇，含 3-OH、5-OH）、芹菜素（黄酮，含 5-OH）为对照品（见图 1），对实验课获取的精制芦丁进行盐酸-镁粉反应、Molish反应和 ZrOCl2/枸橼酸反应的鉴定，过程中设置试剂用量的梯度以优化操作步骤，并使用聚酰胺薄层色谱法鉴定所含杂质。图 1芦丁（A）、槲皮素（B）、芹菜素（C）的化学结构式Fig 1Chemical structure of rutin（A），quercetin（B）and apigenin（C）2精制芦丁的显色反应与薄层色谱2.1材料 对照品芦丁（批号：153-18-4）、槲皮素（批号：117-39-5）、芹 菜 素（批 号：520-36-5）（纯 度均 98%，成都钠钶锂生物科技有限公司），其余试剂均为市售分析纯，水为超纯水。供试品为“碱-酸法提取芦丁”实验课中学生提取并精制的芦丁样品。2.2供试品及对照品溶液的配制 取供试品 16 mg 置于 25 mL量瓶中，乙醇定容，得供试品待测溶液。分别取对照品芦丁 16 mg、槲皮素 8 mg、芹菜素 8 mg 置于 25 mL量瓶中，乙醇定容，得对应的对照品溶液，分别标记为标液 1、标液 2、标液 3。2.3供试品的显色反应 盐酸-镁粉反应：取标液 1 3 及供试品溶液各 2 mL分别放入比色管中，设置梯度用量的盐酸与镁粉，即分别加入 0.2、0.4、0.2 mL 浓盐酸，再依次分别加入 0.03、0.03、0.06 g 镁粉，观察三组试验的颜色变化情况。Molish反应：取标液 1 3 及供试品溶液各 2 mL分别放入比色管中，设置梯度用量的-萘酚/乙醇溶液，即分别加入 0.3、0.2、0.1 mL 10%-萘酚/乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加 3 mL的浓硫酸，观察三组试验中两液面产生的颜色变化。ZrOCl2/枸 橼 酸 反 应：取 标 液 1 3 及 供试品溶液各 2 mL分别放入比色管中，滴加 2%ZrOCl2/甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，至溶液变为黄色，继续滴加至颜色不再加深为止，记录消耗的 ZrOCl2/甲醇溶液体积；再向试管中加2795中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 入 2%枸橼酸/甲醇溶液，记录颜色变化情况。2.4供试品的聚酰胺薄层色谱 取聚酰胺薄层板，以标液 1 3 为对照，点上供试品样品，用 75%乙醇液进行展开。展开一段距离后，吹干，用 1%AlCl3溶液对薄层板进行显色，在日光、紫外灯下观察样品斑点的颜色与荧光。2.5结果分析盐酸-镁粉反应结果表明，加入 0.4 mL 浓盐酸，再加0.03 g 镁粉后显色较好且镁粉消化完全，标液 1 3 及供试品分别呈红色、淡红、黄色、红色。即供试品显色与对照品芦丁相同，符合实验预期，说明实验课中成功从槐米中提取到芦丁（见图 2A）。Molish 反应结果表明，加入 0.3 mL 10%-萘酚/乙醇溶液，并滴加3 mL 浓硫酸后，标液1、供试品呈现的玫瑰环明显，而标液 2、3 无玫瑰环现象。符合实验预期，再次说明实验课中芦丁提取成功（见图 2B）。ZrOCl2/枸橼酸反应结果表明，消耗 1 mL ZrOCl2/甲醇溶液后，标液 1 3 及供试品溶液均变黄且颜色不再加深；后加入 2%枸橼酸/甲醇溶液，芦丁与芹菜素标液完全褪色，槲皮素标液不褪色，而供试品发生褪色但褪色不完全，最终呈现为浅黄色（见图 2C）。这证实了实验前的推论：“碱-酸法提取芦丁”实验课中所用试剂均无异常，供试品不褪色是因为其本身不纯、其中含有具 3-OH的杂质。图 2盐酸-镁粉反应（A）、Molish 反应（B）及 ZrOCl2/枸橼酸反应（C）显色效果Fig 2Chromogenic effect of hydrochloric acid-magnesium powder reaction（A），Molish reaction（B）and ZrOCl2/citric acid reaction（C）a.芦丁对照品（rutin reference）；b.槲皮素对照品（quercetin refer-ence）；c.芹菜素对照品（apigenin reference）；d.供试品（test product）聚酰胺薄层色谱的结果表明，供试品的主要成分为芦丁，但其中含有少量槲皮素（见图 3）。即供试品中具 3-OH 的杂质为槲皮素。图 3日光（A）、365 nm 紫外光（B）下的薄层色谱图Fig 3Thin layer chromatography under sunlight（A）and 365 nm ultraviolet（B）a.芦丁对照品（rutin reference）；b.槲皮素对照品（quercetin reference）；c.供试品（test product）；d.芹菜素对照品（apigenin reference）3结论与讨论提取的芦丁中含有槲皮素杂质的相关研究，为本实验的结果提供了有力支撑：孟祥颖等6报道通过碱溶酸沉法加热提取芦丁，产物常有9%13%的水解产物存在；赵文斌等7从槐米粉提取芦丁，薄层层析鉴定表明，样品中含有少量槲皮素；舒晓宏等8-9从槐花米中提取芦丁时发现，酸碱浓度适宜的石灰水和盐酸可提高芦丁产率，但碱提 pH 值偏高、酸沉 pH 值偏低，芦丁粗提率提高的同时带来含量较高的杂质；另有研究者采用有机溶剂提取法，从槐米、苦荞中提取到的芦丁，也均被不同程度地分解为槲皮素10-11。笔者查阅资料推断，槲皮素杂质是芦丁在提取过程中被碱水解而产生的：芦丁的苷键为烯醇苷键，对碱不稳定，碱溶液会催化苷键水解4；天然药物化学实验指导中描述“称取槐花米 20 g，取 1 1.5 g 石灰粉加入 10 mL 水后研成乳液，槐米在搅拌条件下加入石灰乳，调节 pH 至 8 9，加热至微沸，维持 pH 保持 40 min 5”；在上述提取过程中，用石灰乳调节溶液 pH 使呈碱性，加热情况符合芦丁碱水解的条件，故而部分芦丁碱水解生成槲皮素，造成提取的供试品芦丁不纯。综合上述，“碱-酸法提取芦丁”实验课中，通过碱溶酸沉法提取芦丁时，芦丁发生部分碱水解生成槲皮素杂质，槲皮素含有的 3-OH、4-酮基与锆盐试剂形成稳定性强的络合物，故采用ZrOCl2/枸橼酸反应鉴定芦丁供试品时，加入 2%枸橼酸/甲醇溶液后，黄色不褪或褪色不完全；而纯净芦丁的 5-OH 与锆盐试剂形成络合物的稳2796Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期定性较差，采用 ZrOCl2/枸橼酸反应鉴定时，完全褪色。总而言之，实验过程中出现不褪色现象实为芦丁碱水解生成了槲皮素杂质所致，在后续实验授课中可给予解释或进行进一步探讨。此外，本次实验探究充分体现了基于问题导向（problem-based learning，PBL）12的师生合作教学模式，凸显了“以教师为主导、学生为主体”的教学理念。具体来讲，学生在“碱-酸法提取芦丁”实验课中发现了精制芦丁的 ZrOCl2/枸橼酸反应的不褪色现象；以两名学生为代表形成学习小组，探讨该问题的可能原因，具有天然药物化学、药物分析学学科背景的教师成立教学组；师生就该问题交流探讨，共同设计用于考证该问题的实验步骤；学生进行实验操作，教师指导实验、答疑解惑；最终师生合作解决了天然药物化学实验教学中的问题。教师在指导学生中获得了成长，学生深刻理解了黄酮化合物显色反应的原理，实验操作得以进一步规范，科研思维也得到引导与培养。基于 PBL 的师生合作教学模式为深化天然药物化学课程改革13提供了思路与方法。参考文献1 刘畅，徐巍巍，唐雨，等.天然药物化学实验指导中“汉防己”的生源考证 J.中南药学，2019，17（7）：1167-1168.2 Ganeshpurkar A，Saluja AK.The pharmacological poten-tial of rutin J.Saudi Pharm J，2017，25（2）：149-164.3 Rotimi DE，Elebiyo TC，Ojo OA.Therapeutic potential of rutin in male infertility：a mini review J.J Integr Med，2023，21（2）：130-135.4 裴月湖，娄红祥.天然药物化学 M.7 版.北京：人民卫生出版社，2016.5 裴月湖.天然药物化学实验指导 M.4 版.北京：人民卫生出版社，2016.6 孟祥颖，郭良，李玉新，等.芦丁的来源、用途及提取纯化方法 J.长春中医学院学报，2003，19（2）：61-64.7 赵文斌，许玉华，王鲁石，等.芦丁的纯化及其含量测定 J.时珍国医国药，2007，18（4）：876-878.8 舒晓宏，冯梅，陈华，等.槐花米中芦丁提取最佳 pH值的实验研究 J.大连医科大学学报，2005，27（2）：91-92.9 张依，周泽纯，全锦秋，等.槐米中芦丁的提取工艺优化及检识 J.中国医药科学，2020，10（3）：38-41.10 程秀民，尘学兰，高彦慧，等.RP-HPLC 测定槐米中芦丁和槲皮素含量 J.中成药，2004，24（8）：680-682.11 王改玲，周乐，梁冉，等.不同提取条件对苦荞籽粒中芦丁降解的影响 J.西北植物学报，2005，25（5）：1035-1038.12 程欣，马云淑，陈凌云，等.PBL 教学法在生物药剂学与药物动力学实验教学能力提升中的探索性研究 J.中南药学，2017，15（5）：700-702.13 刘冬，刘艳霞，明乾良，等.天然药物化学课程改革的实践与探讨 J.安徽医药，2022，26（5）：1057-1060.（收稿日期：2023-04-24；修回日期：2023-05-17）