响应甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯熏蒸的菜豆象转录组分析.pdf

月 ():昆 虫 学 报 :.:./.基金项目:贵州省菜豆象发生规律和绿色防控技术研究(黔科合支撑)贵州省高层次创新型人才培养计划 “百”层次人才(黔科合平台人才)作者简介:江兆春 男 年 月生 硕士 正高级农艺师 主要从事植物检疫和农作物病虫害防控技术推广工作:.杨璐 女 年 月生 硕士研究生 研究方向为农业昆虫与害虫防治:.共同第一作者 通讯作者 :.收稿日期:接受日期:响应甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯熏蒸的菜豆象转录组分析江兆春 杨 璐 张 越 杨 洪 戴仁怀(.贵州省植保植检站 贵阳 .贵州大学昆虫研究所 贵州山地农业病虫害重点实验室 贵阳)摘要:【目的】通过对甲酸乙酯()和异硫氰酸甲酯()单剂和混剂()熏蒸处理的菜豆象 转录组数据分析初步探究 和 对菜豆象的联合作用机制【方法】采用广口瓶熏蒸法对菜豆象成虫进行(/)和(/)单剂和混剂()(/)熏蒸处理对照组()不做熏蒸处理利用 测序平台对 和 单剂和混剂()熏蒸处理的菜豆象成虫进行转录组测序对差异表达基因()进行 分类和 通路富集分析选取 个 进行 验证【结果】与 比较组分别有 和 个 上调基因居多而 比较组的 数量为 个下调基因居多 的 分类表明 与 比较组的 富集数最多的条目均为细胞解剖学实体、结合和催化活性 比较组的 则主要富集在细胞解剖学实体、结合和细胞过程等 的 通路富集分析表明 比较组的 主要富集在蛋白质消化与吸收、溶酶体和内质网蛋白加工通路上 比较组的 主要富集在粘着斑、细胞外基质受体相互作用和昆虫激素生物合成等通路上 比较组的 主要富集中在 转运、复制和错配修复等通路上 此外 和 单剂熏蒸处理后菜豆象成虫体内分别有 和 个解毒酶基因表达量较 显著下调而 混剂熏蒸处理后菜豆象体内 个解毒酶基因表达量较 显著下调 筛选的 个 的表达趋势与转录组数据基本一致【结论】本研究结果表明 与 混用具有协同增效作用能够诱导菜豆象发生细胞基因毒性损伤抑制菜豆象解毒酶基因的表达可能是其增效的主要原因初步明确了 与 混用最优配方对菜豆象的熏蒸杀虫分子机制为进一步研究 与 对菜豆象的联合作用机制提供重要参考关键词:菜豆象 甲酸乙酯 异硫氰酸甲酯 混剂 转录组中图分类号:.文献标识码:文章编号:()(:)(.昆虫学报 卷 ):【】()().【】.(/)(/)(/).().().【】.【】.:菜豆象 是危害豆类的世界性仓储害虫在我国被列为农业植物检疫性有害生物和进境植物检疫有害生物(.杨璐等)由于菜豆象危害的隐蔽性极易随粮食贸易往来携带传播进而引起危害 目前我国对菜豆象的防治主要是应用化学农药为主的各种熏蒸剂及储粮防护剂 甲酸乙酯()具有低毒、速效、无残留等优点以 为有效成分的商业产品 作为干果熏蒸剂在澳大利亚被广泛使用表明 作为熏蒸剂具有广泛的应用前景(.姚洁等)沸点为.常温下 为无色液体易溶于水具有良好的扩散能力但是易燃遇明火易爆炸燃烧阈值为 /单独使用 时可能存在安全隐患(杨璐等)为降低 的使用浓度、扩大 的使用范围筛选出与之混配的熏蒸剂是有效的措施之一农药复配是将作用机理不同的杀虫剂混配使用从而影响害虫体内的生理生化反应达到协同增效的 期江兆春等:响应甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯熏蒸的菜豆象转录组分析 效果 等(.)异硫氰酸甲酯()是可用于检疫和船运前消毒的能够替代溴甲烷的熏蒸剂 对四纹豆象 具有较好的熏蒸效果其 熏蒸对成虫的 为 /对卵的 为 /(.)在浓度时间积约./的条件下可完全杀灭各龄期杂拟谷盗 、白腹 皮 蠹 和 米 象 (刘涛等)但在熏蒸过程中粮食对 的吸附作用很强所以在实际应用时需要较高的投药量而 与 搭配混用()可分别降低两者的使用量 有研究报道了 在熏蒸杀灭米象成虫中的协同增效作用(.)当 与 的质量比为.时可获得最佳经济效益且对菜豆象成虫的熏蒸效果最佳(杨璐等)然而 和 的联合作用机制尚不清楚高通量测序被广泛应用于研究杀虫剂杀虫的分子机制能够获取生物体体内特定条件下转录组、分析差 异 表 达 基 因()(.)在本研究中我们首先通过生物测定估算了 和 熏蒸对菜豆象成虫的 值然后对各熏蒸处理组的菜豆象成虫进行 分析并应用 技术对筛选的差异性解毒酶基因表达进行验证以期为菜豆象的可持续治理提供参考 材料与方法.材料供试虫源:菜豆象采自贵州省贵阳市花溪徐家冲农贸市场()于温度()、相对湿度 、无光照的人工气候箱内饲养 以羽化后 的健康成虫作为供试虫源药剂:.甲酸乙酯原药购自天津市科密欧化学试剂有限公司.异硫氰酸甲酯原药购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司试剂及仪器:(美国 公司)(中国康为世纪生物科技有限公司)(瑞士 公司)核酸蛋白质浓度测定仪(美国 公司)实时定量 仪(美国 公司).毒力测定为确定转录组测序时对菜豆象成虫处理的熏蒸剂浓度采用密闭熏蒸法(.)测定 和 (/)的毒力 称取 的 溶于 的丙酮溶液得到母液放入容量瓶中备用 按照本课题组前期得到最佳混用配方配制 混剂:称取.的 溶于.的 溶液中得到质量比 母液()放入容量瓶中备用(杨璐等)将 头菜豆象成虫放入 的广口瓶熏蒸盒()内置于广口瓶内供熏蒸剂挥发 在 条件下设置 个 浓度梯度(和/)、个 浓度梯度(.和./)、个 混剂浓度(.和 /)全黑条件下熏蒸 每个处理重复 次处理结束后观察和统计各处理菜豆象的死亡情况并使用 .软件计算出 值对照组()不做任何熏蒸处理.熏蒸处理后菜豆象成虫转录组测序熏蒸处理:用 浓度的 和 分别熏蒸羽化后 的菜豆象健康成虫 和.作为处理组(基于预实验结果选取的时间点:蒸剂处理后死亡率达到 时的时间)并设置空白对照组()处理方法同.节熏蒸结束后每个处理随机收集 头存活的成虫所有收集的样品立即浸入液氮 冷藏备用每个处理 次重复 按照 说明书提取菜豆象总 吸取 通过 核酸蛋白质浓度测定仪测定其浓度与纯度吸取 进行.琼脂糖凝胶电泳检测其完整性挑选品质达到转录组测序要求的 送至华大基因武汉公司进行 文库构建和转录组测序使用 平台对其进行测序使用 软件去除质量低的读段得到有效读段利用软件 对有效读段进行从头组装拼接转录组数据(.)利用 软件将组装的转录本进行聚类去冗余从而获得 以 中的 程序将转录组测序获得的所有 与六大数据库(和)进行比对分析()获得相应的注释信息 昆虫学报 卷.差异表达基因()筛选使用 进行 和 比较组 筛选(.)参数:并对 进行 注释和 代谢通路富集分析分析 主要参与的生物学功能和代谢通路.验证差异表达的解毒酶基因为了验证转录组测序结果的准确性采用 技术对自 文库中筛选出的 个 进行验证 引物序列见表 反应体系:节合成的 模板 正反向引物(/)各 反应程序:预变性 变性 退火并延伸 个循环 溶解曲线分析 每个基因做 个样本重复和个技术重复 采用 法计算候选基因的相对表达量()表 引物信息 基因正向引物序列()反向引物序列()结果.供试药剂对菜豆象的毒力 和 熏蒸处理对菜豆象成虫的 分别为.和./.不同处理菜豆象成虫转录组 和 处理组的菜豆象成虫转录组数据经过过滤后均得到.以上的高质量有效读段每个样本的 均大于 均大于 说明测序质量可靠 对转录本进行聚类和组装分析得到 条 平均长 为 组装的 数量随其长度增加呈下降趋势说明拼接数据可用于后续功能注释和 分析.的筛选菜豆象成虫不同处理组的 筛选结果如图 所示 和 比较组的 数量分别为 和 个特异表达的 数量分别为 和 个有 个共享(图:)比较组的 数量最少其中上调基因 个下调基因 个 比较组的 数量最多其中上调基因 个下调基因 个(图:).的功能注释 比较组的 的 功能分类如图()所示在生物学过程()分类中注释到细胞过程()和代谢过程()基因数量最多分别为 个和 个二者均参与了细胞的增殖和组织器官的发育在细胞组分()分类中注释到细胞解剖学实体()和细胞内()相关基因的数量最多分别为 和 个在分子功能()分类中注释到结合()和催化活性()的相关基因数量最多分别为 和 个 比较组 的 功能分类如图()所示在生物学过程分类中注释到细胞过程和代谢过程的基因数量最多分别为 和 个在细胞组分分类中注释到细胞解剖学实体和细胞内相关基因的数量最多分别为 和 个在分子功能分类中注释到结合和催化活性相关基因数量最多分别为 和 个 比较组 的 功能分类如图()所示在生物学过程分类中注释到细胞过程和代谢过程的基因数量最多分别为 和 个在细胞组分分类中注释到细胞解剖学实体和细胞内相关基因的数量最多分别为 和 个在分子功能分类中注释到结合和催化活性相关基因数量最多分别为 和 个 期江兆春等:响应甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯熏蒸的菜豆象转录组分析 图 响应 浓度甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯熏蒸的菜豆象成虫不同比较组的转录组中差异表达基因()的韦恩图()和柱状图().()()():未做薰蒸处理的对照组 :甲酸乙酯 ./:异硫氰酸甲酯 ./:./(/).图 和表 同 .图 响应 浓度甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯熏蒸的菜豆象成虫不同比较组的转录组中差异表达基因()功能注释.():.代谢通路富集分析结果表明 比较组的 富集最显著的前 条通路中前 条通路分别是蛋白质消化与吸收()、溶酶体()、内质网蛋白加 昆虫学报 卷工()除此之外还有叶酸一碳库()、半乳糖代谢()、聚合酶()、抗 原 加 工 提 呈()等(图:)比较组的 富集的 代谢通路主要包括粘着斑()、细胞外基质受体相互作用()、昆虫激素生物合成()、赖氨酸生物合成()等(图:)比较组的 显著富集的 代谢通路包括 转运()、复制()、错配修复()、细胞周期()、真核生物核糖体的生物合成()、监控通路()等(图:)图 响应 浓度甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯熏蒸的菜豆象成虫不同比较组的转录组中差异表达基因()富集的前 条 代谢通路.():.菜豆象解毒酶基因的差异性浓度的不同熏蒸剂胁迫后菜豆象体内显著下调的差异表达的解毒酶基因见表 处理后与 比较有 个差异表达解毒酶基因包括 个细胞色素 家族基因(基因:.)和 个 家 族 基 因(基 因:.)处理后与 比较有 个差异表达解毒酶基因包括 个细胞色素 家族基因(基因 分别为.和.)和 个 家族基因(基因:.)混剂(质量比)处理后有 个差异表达解毒酶基因包括 个细胞色素 家族基因(基因 分别为.和.)和 个 家族基因(基因:.).验证 个显著差异表达的基因(期江兆春等:响应甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯熏蒸的菜豆象转录组分析 和 )的 结果与转录组数据的趋势基本一致验证了转录组测序结果的准确性(图)表 响应 浓度甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯熏蒸的菜豆象成虫不同比较组的转录组中显著下调差异表达的解毒酶基因 比较组 基因 基因 值差异倍数 .图 响应 浓度甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯熏蒸的菜豆象成虫不同比较组的转录组中 个差异表达基因()的 验证.()讨论本研究对 和 单剂和 混剂熏蒸后的菜豆象成虫进行转录组测序和比较分析发现 和 两比较组 显著少于 比较组的且 和 两比较组的上调 居多而 比较组的下调 居多(图)说明 混剂对菜豆象成虫的相关基因表达的抑制作用更强 与 组 富集最显著的前 个 条目均为细胞解剖学实体、结合、催化活性 组中 富集的 条目主要包含细胞解剖学实体、结合、细胞过程表明 混剂对菜豆象成虫的致死作用更强(图)同时对 进行 通路富集分析发现 比较组 主要富集在蛋白质加工、合成、转运等相关通路上 比较组 主要富集在粘着斑、细胞外基质受体相互作用、昆虫激素生物合成等相关通路上(图:)而 比较组 则主要富集在 转运、复制、错配修复等通路上(图:)这些通路的基因对于维持生物体各种生理性分子生物学稳态具有重要作用(.)表明 熏蒸导致菜豆象发生细胞基因毒性损伤这可能是菜豆象的直接致死原因在受到杀虫剂胁迫时昆虫可以通过提高体内解毒酶的活性加速外源有毒物质的代谢降低对杀虫剂的敏感度此过程涉的酶系主要有:细胞色素 酶系、谷胱甘肽转移酶和羧酸酯酶(.)细胞色素 广泛分布于生物体内是一类参与昆虫体内次代谢物质和杀虫剂解毒代谢的超家族酶可以催化多种类型的反应能够代谢多种内源性和外源性物质影响杀 昆虫学报 卷虫剂在生物体组织中的分布发挥解毒效应研究表明细胞色素 是对拟除虫菊酯类、有机氯类杀虫剂产生抗药性的关键酶系(.)谷胱甘肽转移酶广泛存在于需氧生物中是一类多功能的超基因家族酶在响应化学有害物质、杀虫剂、极端温度及重金属胁迫中起到极其重要的作用(.)研究表明吡虫啉和马拉硫磷协同增效的原因与抑制谷胱甘肽转移酶的活性密切相关(.)昆虫羧酸酯酶在对外源有毒物质水解过程中具有重要作用可催化酰胺键、酯键及硫酯键的内源及外源物质水解使昆虫对有机磷类、拟除虫菊酯类杀虫剂增强抗性(.)在不同熏蒸剂处理后 表达均被下调表明 在菜豆象成虫的解毒代谢中发挥重要作用 和 单剂处理后菜豆象体内分别有 和 个解毒酶基因表达量显著下调而 混剂熏蒸导致菜豆象体内 个解毒酶基因表达量显著降低(表)表明 与 混用具有协同增效作用可能与抑制解毒酶基因 和 的表达有关本研究利用 测序技术对经、单剂和 混剂胁迫后的菜豆象进行测序和分析通过转录组数据发现 与 混用具有协同增效作用对菜豆象成虫的致死作用更强能够显著抑制菜豆象多种解毒酶 同时获得一批可能与 和 解毒代谢相关基因为深入开展熏蒸剂对菜豆象靶标基因和调控研究提供了丰富的数据资源参考文献().:()(:).():.:.():.():.(:)(:).():.():.().:.(.).:.:.:.():.刘涛 张凡华 李丽 王跃进.异硫氰酸甲酯和硫酰氟混用杀灭松材线虫的增效研究.植物检疫():.():.().():.():.:.():.:.(期江兆春等:响应甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯熏蒸的菜豆象转录组分析 .).():.():.?.:.():.():.(.)(:)()(:).():.(.).:.:.()(:).():.(:).():.:.:.:.():.():.:.():.().():.杨璐 戴仁怀 杨洪 江兆春.甲酸乙酯与异硫氰酸甲酯混用熏蒸菜豆象的最优配方.生物安全学报():.().():.杨璐 戴仁怀 杨洪 江兆春 李敏 杨燕琼.甲酸乙酯和异硫氰酸甲酯混用对菜豆象的熏蒸活性研究.山地农业生物学报():.().():.姚洁 戴仁怀 杨洪 廖应江.甲酸乙酯熏蒸菜豆象的初步研究.植物检疫():.:.(责任编辑:马丽萍)