微生物暗物质分离培养——以CPR和DPANN类群为例.pdf

基金项目:内蒙古自然科学基金项目()内蒙古师范大学引进高层次人才科研启动经费项目()作者简介:姜凯 男讲师博士 研究方向为环境微生物资源开发与利用:.通讯作者收稿日期:微生物暗物质分离培养 以 和 类群为例姜 凯 曹春玲(.内蒙古师范大学 生命科学与技术学院内蒙古 呼和浩特.内蒙古自治区高等学校生物多样性保护与可持续利用重点实验室内蒙古 呼和浩特.内蒙古自治区农牧业技术推广中心内蒙古 呼和浩特)摘 要 候选门级辐射类群()细菌和 超门古菌是重要的微生物暗物质约占地球细菌和古菌多样性的一半 目前对于 和 的研究处于起步阶段仅获得了少数的实验室培养菌株代表着丰富的菌种资源和基因资源的潜力同时其生态功能还未知预示着未来新发现的巨大机遇 本文在总结现有微生物分离培养方法以及 和 菌株共性特征的基础上对已实现实验室培养的 和 菌株进行归纳和分析提出该类群菌株分离培养的几点建议以期为今后对该类群菌株的分离培养提供参考 细菌和 古菌的可培养研究有助于加深对该类群菌的认识阐明其生活方式、进化及演变规律并揭示其独特的代谢途径及功能基因发现新的天然活性产物具有重要的科学意义及应用价值关键词 微生物暗物质候选门级辐射类群细胞微小共生生活分离培养中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.)().微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .“微生物暗物质”()指未实现实验室培养的微生物其在碳、氮等元素循环中发挥着重要作用是新基因资源和新天然产物的巨大宝库同时影响着周围生物及环境 随着组学技术的发展借助深度测序及生物信息分析手段大量“微生物暗物质”基因组被获取、解读极大扩充了生命之树上的分支 年 等从天然碱性生物膜中直接获取并重构出 株未培养细菌(和 )的近乎全部基因组 随后不断有未培养微生物的基因组被直接测序、组装 年 等利用宏基因组技术从地下水及沉积物中获得了 多个宏基因组组装 的 基 因 组()其中包含了 个新门级的细菌类群 年 等对 多个已公开的宏基因组数据进行组装并获得了将近 个 其中包含了 个新门水平的细菌、个新门水平的古菌 年 等统计了从不同生境获取的 多个宏基因组数据 共包括 个 其中 个 代表了跨越 个门的候选新种 然而这也进一步加剧了微生物基因组信息与分离培养之间的不平衡通过对公开的宏基因组数据进行分析除人体相关生境外地球中其他生境中已发现的微生物绝大多数处于未培养状态 从微生物整体角度来讲目前已被培养的微生物只占地球微生物总量的极小比例 研究表明不同环境中已培养微生物的占比存在较大差别在.之间中位数为.候选门级辐射类群()细菌和 超门古菌是在上述进程中发现的两大类微生物分支 年和 年根据组装基因组信息超门古菌和 类群细菌被定义 系统进化树显示 类群和 超门分别位于细菌域和古菌域外侧相互毗邻 具有细胞微小、厌氧/耐氧、难培养、营共生生活、基因组精简、缺少部分核心代谢能力等共性特征 目前 类群分为 个超门(和)和其他独立菌门至少 个门水平分支 超门由最初定名时的 个门增到至少 个菌门 然而仅有极少数 和 类群菌株实现了实验室培养制约了对该类群生态功能、生活方式、进化及演变规律等方面的研究 本文在介绍现有微生物分离培养方法的基础上对微生物暗物质中的大类群 类群细菌和 超门古菌的分离培养进行总结和分析以期为今后对这两大类独特的微生物暗物质类群的分离培养提供参考 微生物培养的思路早在 年研究人员就已通过对比平板计数和细胞计数两种方法发现平板培养所得到的微生物数量要远小于环境中微生物实际存在的数量即所谓的“大平板计数异常”现象 随后“寡营养菌()”“活的不可培养()”状态和“未培养微生物”等概念相继被提出并于 年获批了“暂定()”分类地位来描述还未被培养但序列/基因组信息显示为潜在的新生命分支的微生物 测序技术的发展与应用更是推动了“微生物暗物质”这一术语的提出以此来唤醒人们对未培养微生物的重视虽然微生物分离培养的研究曾一度被一些学者认为是低阶的、过时的但对于此类微生物的可培养尝试从未间断过改变培养基成分、浓度添加微量元素、特殊电子受体和特殊代谢物避免生长抑制因子的产生尝试交互共生培养等都是对传统培养方法进行的调整和优化 等通过在培养基中添加混合碳源、微量元素和维生素混合物以及多种复杂小分子化合物成功分离出多种人体肠道内未培养微生物 等发现短肽类物质的添加可以促进海洋砂坪中未培养细菌 的体外生长和富集 氢氧化铁和锰氧化物作为电子受体添加到培养基中可以促进微生物新物种的发现 信号分子、腐殖酸或处理活性氧的酶类的添加过氧化氢等抑制因子的移除可以提高未培养微生物的可培养成功率 用吉兰糖胶代替琼脂作为凝固剂可以增强未培养微生物 期 姜凯等:微生物暗物质分离培养 以 和 类群为例 的培养和分离效果 辅助菌株的添加与共培养可以促进难培养微生物的生长富集样品极限稀释、培养基稀释培养、滤膜滤过和延长培养时间是分离寡营养菌及未培养菌简单而高效的手段 为了避免微生物之间的相互干扰 等开发出了样品极限稀释法将样品稀释至仅有极少量甚至一个微生物细胞进而在同源的灭菌海水培养基中培养从中分离出多个新的纯培养微生物 等对污水样品进行梯度稀释和培养从原液到稀释至发现重建的每一个稀释梯度都会多分离到 个独特的类群 采用不同孔径滤膜对样品进行预处理是避免培养过程中微生物之间相互干扰发现新物种的另一个简单而有效的方法 内蒙古自治区高等学校生物多样性保护与可持续利用重点实验室(本实验室)利用.滤膜处理内蒙古岱海样品发现能显著提高可培养细菌新种检出效率 培养基稀释培养方法最早由 等提出并以此从不同环境中分离培养出大量微生物新物种 年杜宗军团队采用/浓度的 培养基对威海近海表层沉积物进行长时间(最长为 )富集培养共获得 个物种的 株纯菌其中包含 个潜在新种(个新目、个新科、个新属和 个新种)等通过在培养基中添加木聚糖延长微生物培养时间至 周成功分离出 多株之前未培养的微生物 本实验室结合培养基稀释和延长培养时间共从内蒙古岱海分离鉴定 株菌其中 株菌 比对相似性.进一步分析归为 个潜在新菌种其中新种 已完成多相分类鉴定 年“原位培养”的概念首次提出阐明了利用特殊装置将培养从实验室回归到采样环境的想法 模拟微生物生境及细菌原位培养实验的开展也被认为是“微生物纯培养研究”重新被重视、复兴的标志 最初的设计是利用环形不锈钢垫圈和孔径为.的滤膜组成的“扩散生长盒”装置将琼脂与极限稀释后的待培养样品进行封闭之后在模拟的生境中进行培养 由于.滤膜对微生物的不透过性以及对生长相关活性物质的可透过性特点实现了扩展室内外化学物质的交流并避免了环境微生物的污染和干扰 该方法培养出的微生物数量是传统平板培养方法的 倍 随后基于“扩散生长盒”或类似装置的原位培养研究在不同环境中获得了成功 在此基础上研究人员又开发出了分离芯片()实现了原位培养的高通量操作“微生物纯培养研究”复兴的另一个标志是“培养组学()”的提出与兴起 培养组最早由 在 年提出是综合多重培养条件进行微生物富集培养并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱()及 基因测序技术进行微生物鉴定的高通量培养方法 第一篇相关报道研究了 个粪便样品的 种培养条件共培养鉴定出 个门 个属共 种微生物其中 种为人体肠道内首次发现 随后的研究主要集中在肠道等人体相关生境极大缩小了人体相关生境中微生物宏基因组信息与纯培养之间的不平衡在过去的 年中微生物微包埋、流式细胞分选、微流控芯片等分离技术荧光原位杂交()、基因测序、宏基因组测序、等微生物鉴定技术 等高通量培养技术以及、逆向基因组技术等新方法的应用原位培养、培养组学等培养理念的创新极大推动了微生物分离培养的研究进展 和 类群特点及难培养原因 类群细菌和 超门古菌是生命之树上的重要分支约占地球全部细菌和古菌多样性的一半然而对它们的认识仍处于起步阶段 类群是细菌域最外侧的单系分支由 等于 年根据宏基因组来源的 和蛋白序列聚类、命名融合了早期发现的 超门(现为)和 超门(现为)目前包括了至少 个菌门的庞大细菌类群 超门古菌是古菌域重要的分支由 等于 年根据单细胞基因组测序所得到的 个基因组草图和已有 信息将菌门 、.、.、和 微 生 物 学 杂 志 卷.聚为一类并依据最初五个菌门的首字母命名而来 目前 超门是至少包括了 个菌门的庞大古菌类群 随着研究的深入已在地下水、土壤、湖泊、泉水、极端环境、海洋、饮用水系统和动物等广泛生境中发现 和 类群的存在 类群细菌和 超门古菌在系统进化树上虽各自位于不同域但相互毗邻同时有很多共性特征.基因组精简及缺少部分关键代谢途径除.和其他菌门少数菌株外绝大多数 和 类群菌株基因组小于 根据已有基因组信息分析 和 类群菌株缺少完整的脂肪酸合成途径和糖异生途径(缺少葡萄糖磷酸酶)大多数菌株缺少完整的三羧酸循环途径、氨基酸生物合成途径、核苷酸从头合成途径、糖酵解途径(主要缺少磷酸果糖激酶)和 免疫系统但值得注意的是该类群菌株基因组中约有一半以上的基因未能有效注释不排除其在某些代谢中发挥作用的可能.细胞个体微小与常规微生物菌体细胞相比 和 类群菌株细胞个体相对微小可以据此进行初步富集 等利用.滤膜预过滤.和.滤膜收集微生物菌体发现能有效富集 超门菌株 等利用.、.和.滤膜串联过滤地下水发现.滤膜富集的 细菌相对丰度要比.滤膜多 以上说明很多 菌体细胞能通过.滤膜 对已观察的 和 类群菌株进行统计通常为球形直径小于.(表)表 和 类群菌株细胞形态及大小 类群/超门菌株形态大小/参考文献、和 球/椭球.球.、和 球.球/球杆.球.()球.球.球.球.球.球.球.球.()球.对复制速率的测定和细胞分裂的观察说明小细胞状态下的 类群和 菌株正处于代谢活跃期而非寡营养下的细胞变小状态.营共生生活根据已有基因组信息分析大多数 和 类群菌株缺少有氧呼吸链包括 脱氢酶和氧化磷酸化复合物 同时除.、.和.中的个别菌株基因组预测可能独立生存外大多数 和 类群菌株基因组预测无法单独生活 实验室数据支持这一结论(表)已获得实验室培养的 和 类群菌株都是与其他 和 类群菌株宿主菌共生生活不能独立培养且大多为厌氧/耐氧菌 然而对这类菌的研究仍处于起步阶段其生活方式及营养需求还有待深入研究同时基因组中存在大量未能注释的基因还不能完全排除独立生存的可能 人工构建微生物底盘细胞是合成 期 姜凯等:微生物暗物质分离培养 以 和 类群为例 生物学的重要组成部分目前的策略主要有通过遗传工程手段简化微生物基因组的“”策略和从头合成生命的“”策略结合 类群和 菌株基因组精简的特点如果能找到独立生活的菌株将在这两个策略的基础上增加新的思路对人工构建微生物底盘细胞具有重要意义表 和 类群已培养菌株分布 类群/超门菌株共生宿主菌参考文献 、.、.、()、.、.、.()、.检测容易被忽视采用细菌和古菌 通用引物检测微生物往往会遗漏许多 和 类群菌株信息 研究表明很多 类群菌株 和 基因中存在内含子且在保守区和可变区都有发现 超门中.、.、.和.中发现有蛋白编码基因的存在 同时 和 类群在 基因序列层面高度可变很多是在保守区容 易 造 成 通 用 引 物 不 匹 配 的现象 和 类群菌株的分离培养 类群细菌和 古菌是自然界中广泛存在的庞大微生物类群可能占地球全部细菌和古菌多样性的一半而且这两类菌基因组中约有一半的基因功能未知代表着丰富的菌种资源和基因资源 同时他们的生态功能还未知代表着未来新发现的巨大机遇 然而厌氧/耐氧缺少部分核心代谢能力营共生生活等共性特点导致 和 类群菌株难培养 缺少实验室分离培养菌株严重制约着对该类菌在生理生化、代谢潜能、活性物质发掘以及生态功能等方面的深入研究需要在 和 类群的富集和分离培养方面开展更多的基础研究工作目 前类 群 只 有、.和.的部分菌株实现了实验室培养 超门只有.和.的部分菌株实现了实验室培养(表)根据 和 类群特点结合该类群已培养菌株的分离培养过程针对 和 类群菌株分离培养提出几点建议 微 生 物 学 杂 志 卷.增加 和 类群生境及多样性的研究对于不同环境中微生物多样性的研究多采用基于 序列的高通量测序技术然而 和 类群菌株由于常有 通用引物不匹配的现象容易被遗漏和忽视 目前关于 和 类群生境及多样性的信息多由宏基因组测序、和后续的生信分析获得但数量还较少集中在地下水等少数生境 充分了解 和 类群在不同生境中的多样性及丰度分析环境因子的影响是后续分离培养的前提 菌株的实验室培养就是建立在此基础上最初在泥炭沼泽中发现命名为“”之后发现在海水、深海沉积物、地下水、土壤、热泉和动物体内等广泛生境存在但在口腔中的研究最为深入 常存在于口腔中丰度在 左右但在不同类型牙周炎患者口腔中丰度显著升高部分能达到 同时具有较高的多样性至少在口腔中发现 个不同属 菌株基于此唾液样品被用来作为分离 菌株的研究材料并首次获得了 菌株的实验室培养物后续的 、和 等一系列菌株都是在不同口腔环境中分离获得 本实验室利用宏基因组测序研究了内蒙古岱海湖水及沉积物样品中 和 的多样性发现岱海中存在丰度低但丰富的 和 物种资源.菌株分离培养过程中增加检测 和 类群存在的环节 和 类群菌株不能独立生活以及存在 通用引物不匹配的现象造成依靠富集、涂布培养、划线分纯和 检测的常规流程很难发现该类群菌株可能的存在 在富集过程中增加菌群结构变化监测的环节在分离培养过程中有针对性的增加显微观察特异性引物筛查的环节可能对发现 和 类群菌株线索提高分离培养机率有所帮助 等在分离培养热岩样品中嗜热菌的过程中分离到一株新的自养硫还原菌 通过显微观察无意间发现表面共生菌的存在在此基础上培养出 的第一株菌 .的菌株 是在富集 中嗜酸菌的过程中偶然发现与共生菌属()高丰度共存.菌株.和.是分别在分离培养出嗜盐菌.后以及富集培养几丁质自养嗜盐菌过程中无意间发现 类群中的菌株.能够实现实验室培养最初也是基于在所获得的 菌株表面观察到有共生菌的存在.有针对性的分离特定 和 类群菌株更易成功 细菌和 类群古菌分别代表细菌域和古菌域中庞大的独立分支虽然有很多共性特征但在具体的代谢活动、宿主菌选择、遗传进化和存在生境等方面有各自的特点 针对其中特定门水平中的菌株进行有针对性的分离培养可能比广泛的筛选培养更容易成功 的 菌 株、和.的菌株 和.的菌株.中的菌株.和.的菌株.在分离培养过程中均有针对性的采用特异性引物扩增监测特定菌的存在及生长状况提高了分离培养的成功率 等通过分析 的 序列发现部分菌株可能具有链霉素抗性以此推断为依据通过添加链霉素成功富集分离到了菌株 等通过测序数据有针对性的预测 和.的表面蛋白结构以此设计荧光抗体标记物成功分离培养出 菌株、和.菌株.明确 和 类群菌株宿主是分离培养的关键由于不能独立生活确定 和 类 期 姜凯等:微生物暗物质分离培养 以 和 类群为例 群菌株的共生宿主是其分离培养的关键 等在黄石公园诺里斯间歇泉盆地的 热泉发现存在丰度较高的(占古菌丰度的)根据实验室已培养菌株 的共生菌信息及文献报道推断此类环境中的 菌株可能以嗜热嗜酸的 菌株为宿主以此设计最初的富集培养基最终成功实现菌株.的实验室培养 美国 研究所的 团队和 团队根据 已培养菌株的共生宿主信息将口腔样品经过.或.滤膜过滤富集 菌株之后与潜在的宿主共培养共实现至少 株 菌株的实验室培养 中科院微生物研究所杜文斌团队利用 技术确定 宿主菌信息成功从中药蝉蜕中分离出菌株.传统分离培养方法与新技术要充分结合已实现实验室培养的 和 类群菌株在实验过程中并不是利用某种传统分离培养方法或单纯的采用某一项新技术往往是采用多种传统的分离培养方法并结合一些新的技术手段实现最终的分离培养 不同孔径滤膜过滤、不同转速离心分离、极限稀释法、富集培养和传代培养等传统培养方法以及流式细胞分选、技术、逆向基因组技术和 等新技术手段的有效结合将有助于更多 和 类群菌株的分离培养 其中细胞微小作为 和 类群的一个共同特点通过采用不同孔径滤膜过滤达到菌株的初步分离与富集可以作为 和 类群菌株分离培养过程中优先选择的一项简单而有效的手段 展 望 细菌和 古菌类群庞大分布广泛同时基因组中约有一半以上的基因未被注释代表着未来科学发现的重大机遇 目前关于 和 的研究仍处于起步阶段 对其可培养研究不仅有助于加深对该类群菌多样性和生态功能的认识阐明其生活方式、进化及演变规律还有利于揭示其独特的代谢途径及功能基因发现新的天然活性产物具有重要的科学意义及应用价值 同时如果在 或 中找到能独立生活的菌株将对合成生物学中底盘细胞的构建具有重要的指示作用 近些年我国在发表的微生物新物种数量方面一直处于领先地位国内也涌现出许多优秀团队 笔者获悉国内的一些实验室已获得 和 类群菌株的培养物相信不久的将来就会有一些突破性的报道但该类菌的分离培养研究仍面临巨大挑战 首先目前对于 和 类群菌株在不同生境中的多样性及丰度研究仍较少缺少指示性信息特别是 通用引物不匹配的现象容易使 和 类群菌株被遗漏和忽视 其次未培养微生物的分离培养是一项耗时而艰巨的工作特别是对于 和 类群菌株如何找到 和 类群菌株的共生宿主破解宿主菌生长限制因子并有效而方便的进行实验室培养同时实现可重复仍然是一道鸿沟 关于 和 类群菌株的可培养研究不应局限于现有的一种或几种方法应在生境信息基础上选择合适的研究材料在采用滤膜过滤等简单方法 的 同 时 应 多 结 合 新 兴 的 逆 向 基 因 组、等技术进行有针对性的分离培养 同时“广撒网式”的分离培养也不应放弃在过程中增加表面共生菌的检测环节可能有意想不到的收获参考文献:.():.():.():.():.():.微 生 物 学 杂 志 卷 .():.():.():.():.():.():.():.():.():.():.陶晔 邢鹏.候选门级辐射类群()细菌研究进展.微生物学报 ():.():.():.:.():.():.():.:.():.():.():.():.():.:.():.:.():.():.():.():.():.():.期 姜凯等:微生物暗物质分离培养 以 和 类群为例 .():.():.:.():.:.():.():.():.():.():.():.():.():.():.():.():.():.():.:.():.():.范念斯 齐嵘 杨敏.未培养微生物的培养方法进展.应用与环境生物学报 ():.周恩民 李文均.未培养微生物研究:方法、机遇与挑战.微生物学报 ():.熊盈盈 莫祯妮 邱树毅 等.未培养环境微生物培养方法的研究进展.微生物学通报 ():.:.():./.().:./.():.():.():.():.()微 生 物 学 杂 志 卷 .():.:/.().:./.():.():.():.():.():.()(.).():.():.():.():.():.():.():.():.():.():.:.李华伟 罗文彬 许国春 等.基于高通量测序的福建北部马铃薯晚疫病株根际土壤细菌群落分析/.微生物学 通 报:.().:./.()():.():.():.():.期 姜凯等:微生物暗物质分离培养 以 和 类群为例