胆管癌患者血清长链非编码RNA母系表达基因3表达及其与预后相关性研究.pdf

目的:探讨胆管癌患者血清长链非编码R NA母系表达基因3(l n c R NA ME G 3)表达及其与预后的关系。方法:选取胆管癌患者9 2例(胆管癌组)和体检健康者9 2例(对照组)为研究对象。术后随访3 6个月,根据预后情况分为预后不良组(4 4例,患者死亡)和预后良好组(4 8例,患者存活)。采用荧光定量P C R检测血清l n c R NAME G 3表达水平。比较对照组与胆管癌组血清l n c R NA ME G 3表达水平。比较预后良好组和预后不良组临床资料、病理特征及血清l n c R NA ME G 3表达水平。采用S p e a r m a n法分析胆管癌患者血清l n c R NA ME G 3表达水平与肿瘤分化程度、T NM分期、淋巴结转移、血管浸润的相关性。采用多因素L o g i s t i c回归分析胆管癌患者预后不良的影响因素。采用受试者工作特征(R O C)曲线评价血清l n c R NA ME G 3对胆管癌患者预后不良的预测价值。结果:胆管癌组血清l n c R NA ME G 3表达水平低于对照组(P0.0 5)。预后不良组肿瘤低分化、T NM分期期、有淋巴结转移、有血管浸润比例高于预后良好组,血清l n c R NA ME G 3表达水平低于预后良好组(均P0.0 5)。胆管癌患者血清l n c R NA ME G 3表达水平与肿瘤分化程度呈正相关,与T NM分期、淋巴结转移、血管浸润呈负相关(均P0.0 5)。肿瘤低分化、T NM分期期、有淋巴结转移、血清l n c R NA ME G 3低表达是胆管癌患者预后不良的独立危险因素(均P0.0 5)。血清l n c R NA ME G 3预测胆管癌患者预后不良的曲线下面积为0.8 2 0,截断值为0.6 2 0,敏感度为8 7.1 0%,特异度为7 0.8 0%。结论:胆管癌患者血清l n c R NA ME G 3呈低表达,与患者预后密切相关,对预测胆管癌患者预后不良有较高预测价值。关键词 胆管癌;长链非编码R NA母系表达基因3;预后;肿瘤分化程度;TNM分期;淋巴结转移;血管浸润中图分类号:R5 7 5.7 文献标志码:A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 0-7 3 7 7.2 0 2 3.0 9.0 1 1E x p r e s s i o no f s e r u ml n c R N A ME G 3i np a t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o m aa n d i t s c o r r e l a t i o nw i t hp r o g n o s i sZ HAOD o n g z h i,CHANGY u a n y u a n,C AOZ h e l i,L IG u o d o n g,Z HAOY a j u a n(D e p a r t m e n to fG a s t r o e n t e r o l o g y,B a o d i n gN o.1C e n t r a lH o s p i t a l,B a o d i n g0 7 1 0 0 0,C h i n a)A B S T R A C T O b j e c t i v e:T o i n v e s t i g a t e t h ee x p r e s s i o no f s e r u ml o n gn o n-c o d i n gR NAm a t e r n a l l ye x p r e s s e dg e n e3(l n c R NA ME G 3)i np a t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o m aa n d i t sc o r r e l a t i o nw i t hp r o g n o s i s.M e t h o d s:At o t a l o f9 2p a-t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o m a(c h o l a n g i o c a r c i n o m ag r o u p)a n d9 2h e a l t h ys u b j e c t s(c o n t r o lg r o u p)w e r es e l e c t e d.T h ep a t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o m aw e r e f o l l o w e du p f o r 3 6m o n t h s a f t e r o p e r a t i o na n dd i v i d e d i n t op o o r p r o g n o s i sg r o u p(4 4c a s e s,d i e d)a n dg o o dp r o g n o s i sg r o u p(4 8c a s e s,s u r v i v e d)a c c o r d i n gt ot h ep r o g n o s i s.S e r u ml n c R NAME G 3e x p r e s s i o nw a sd e t e c t e db y f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v eP C R.T h e s e r u ml n c R NA ME G 3e x p r e s s i o n l e v e l o f c o n-t r o l g r o u pa n dc h o l a n g i o c a r c i n o m ag r o u pw e r ec o m p a r e d.T h ec l i n i c a ld a t a,p a t h o l o g i c a l f e a t u r e sa n ds e r u ml n c R NAME G 3e x p r e s s i o n l e v e l o fg o o dp r o g n o s i sg r o u pa n dp o o rp r o g n o s i sg r o u pw e r e c o m p a r e d.S p e a r m a na s s a yw a su s e dt oa n a l y z et h ec o r r e l a t i o nb e t w e e ns e r u ml n c R NA ME G 3e x p r e s s i o nl e v e la n dt u m o rd i f f e r e n t i a t i o n,T NM s t a g e,l y m p hn o d em e t a s t a s i sa n dv a s c u l a r i n f i l t r a t i o n i np a t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o m a.M u l t i v a r i a t eL o g i s t i cr e g r e s s i o nw a su s e dt oa n a l y z et h ei n f l u e n c i n gf a c t o r so fp o o rp r o g n o s i si np a t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o m a.R O Cc u r v ew a su s e dt oe v a l u a t e t h ep r e d i c t i v ev a l u eo f s e r u ml n c R NA ME G 3f o rp o o rp r o g n o s i so fp a t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o-m a.R e s u l t s:T h es e r u ml n c R NA ME G 3e x p r e s s i o nl e v e lo fc h o l a n g i o c a r c i n o m ag r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to f c o n t r o l g r o u p(P0.0 5).T h ep r o p o r t i o no f t u m o rw i t hl o wd i f f e r e n t i a t i o n,T NMs t a g e,l y m p hn o d em e-t a s t a s i sa n dv a s c u l a r i n f i l t r a t i o n i np o o rp r o g n o s i sg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nt h a t i ng o o dp r o g n o s i sg r o u p,a n dt h es e r u ml n c R NA ME G 3e x p r e s s i o n l e v e lw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a t i ng o o dp r o g n o s i sg r o u p(a l lP0.0 5).S e r u ml n c R NA ME G 3e x p r e s s i o n l e v e l i np a t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o m aw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h ed e g r e eo f t u m o rd i f f e r e n t i a t i o n,a n dn e g a t i v e l yc o r r e l a t e dw i t hT NMs t a g i n g,l y m p hn o d em e t a s t a s i s,a n dv a s c u l a r i n-3611陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l2 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9f i l t r a t i o n(a l lP0.0 5).L o wt u m o rd i f f e r e n t i a t i o n,T NMs t a g e,l y m p hn o d em e t a s t a s i s a n d l o we x p r e s s i o no f s e r-u ml n c R NA ME G 3w e r ei n d e p e n d e n tr i s kf a c t o r sf o rp o o rp r o g n o s i si np a t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o m a(a l lP0.0 5).S e r u ml n c R NA ME G 3p r e d i c t e dp o o rp r o g n o s i s i np a t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o m aw i t ha na r e au n d e rt h ec u r v eo f0.8 2 0,t r u n c a t i o nv a l u eo f0.6 2 0,s e n s i t i v i t yo f8 7.1 0%,a n ds p e c i f i c i t yo f7 0.8 0%.C o n c l u s i o n:S e r u ml n c R NA ME G 3e x p r e s s i o n i s l o wi np a t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o m a,w h i c h i s c l o s e l y r e l a t e d t o t h ep r o g n o s i so f p a-t i e n t s,a n dh a sah i g hv a l u e i np r e d i c t i n gt h ep o o rp r o g n o s i so fp a t i e n t sw i t hc h o l a n g i o c a r c i n o m a.K E Y WO R D S C h o l a n g i o c a r c i n o m a;L o n gn o n-c o d i n gR NA m a t e r n a l l ye x p r e s s e dg e n e3;P r o g n o s i s;D e g r e eo ft u m o rd i f f e r e n t i a t i o n;T NMs t a g i n g;L y m p hn o d em e t a s t a s i s;V a s c u l a r i n f i l t r a t i o n 胆管癌属恶性肿瘤的一种,起源于胆管上皮细胞,其病理生理机制尚不清楚,因此临床尚未找到有效的针对性治疗手段。当前胆管癌最有效治疗手段为手术,但其早期临床症状并不明显,多数患者因此未能及时就医,确诊时已错过最佳手术时机,导致患者生存率低,复发率高,预后较差1-3。相关研究发现,胆管癌的发病与多种基因的失调有一定联系,其中长链非编码R NA(L o n gn o n-c o d i n gR NA,l n c R NA)与胆管癌的病理生理过程密切相关。l n c R NA起初被认为是基因组转录的“噪音”,不具有生物学功能,然而近年来发现l n c R NA在转录、拼接等过程中发挥重要作用,并影响肿瘤的恶性进展过程4-6。虽然关于l n c R NA的研究进展迅猛,但是绝大部分l n c R NA的功能仍然未了解清楚。母系表达基因3(M a t e r n a l l ye x p r e s s e dg e n e3,ME G 3)是 一 种 印 记 基 因,编 码 与 肿 瘤 发 生 相 关 的l n c R NA,可 作 为 一 个 新 型 的l n c R NA肿 瘤 抑 制 因子7-8。目前有关血清l n c R NA ME G 3与胆管癌关系的研究报道较少。因此,本研究通过检测胆管癌患者血清l n c R NA ME G 3水平,分析其与患者预后的关系,初步探讨血清l n c R NA ME G 3水平在胆管癌中的作用,以期为胆管癌的临床诊疗及预后评估提供一定理论依据。1 资料与方法1.1 一般资料 选取2 0 1 5年1 2月至2 0 2 0年3月于保定市第一中心医院就诊的胆管癌患者9 2例为研究对象(胆管癌组),患者均行根治性切除术治疗。其中,男性4 7例,女性4 5例;年龄4 87 1岁,平均(5 9.5 16.4 3)岁;体重指数(BM I)1 7.1 32 3.9 2k g/m2,平均(1 9.5 42.3 9)k g/m2;肿瘤部位中,肝门及肝内胆管5 5例,胆管中下段3 7例;肿瘤直径0.0 5)。本研究在医院伦理委员会批准下进行,受试者均对本研究知情同意,并签订协议书。1.2 研究方法1.2.1 样本采集:采集受试者空腹静脉血5m l(胆管癌患者入院后2 4h内,体检健康者体检时),4下以3 7 0 0r/m i n离心1 6m i n分离血清,于-8 0 冰箱保存待检。1.2.2 血清l n c R NA ME G 3表达水平检测:取血清样本,采用T R I z o l试剂(批号:S L 2 0 9 4 1,杭州赛澜生物技术有限公司)提取血清中总R NA,采用反转录试剂(批号:S L 5 7 1 9 2,杭州赛澜生物技术有限公司)得到c D NA,以此为模板进行荧光定量P C R反应(试剂盒批号:H J-1 0 6 4 R,湖南 远泰生物技 术 有 限 公 司),以GA P DH为内参,反应体系共2 0l:P C R试剂1 0l,c D NA4l,正、反向引物各1l,d d H2O4l。反应程序:9 2 预变性6 0s;9 5 3 0s,5 6 3 0s,7 2 3 0s,4 0个循环后,7 2 延伸1 0m i n。引物由深圳世立基因生物有限公司设计合成,以2-C t法计算血清中l n c R NA ME G 3相对表达量。引物序列见表1。表表11 基因引物序列基 因正向引物序列反向引物序列l n c R NA ME G 35-A C A TA G G T G TA G C C T G G T G-35-T G T G G C T AA G T C T G AAA C T-3G A P DH5-G C C A G T G T C T T C C G T C C G-35-C T A T C G C AA G C G G TA G G C-31.3 预后随访 以门诊与电话相结合的方式进行随访,随访时间3 6个月,无失访。以术后第1天为随访46112 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l起始日期,以患者死亡(癌症原因)或期满为截止日。根据预后情况分为预后不良组(4 4例,患者死亡)和预后良好组(4 8例,患者存活)。1.4 统计学方法 采用S P S S2 4.0统计学软件对数据进行分析。以 例(%)表示计数资料,行2检验;以(xs)表示计量资料,行t检验;采用S p e a r m a n法分析胆管癌患者血清l n c R NA ME G 3表达水平与肿瘤分化程度、T NM分期、淋巴结转移、血管浸润的相关性;采用多因素L o g i s t i c回归分析胆管癌患者预后不良的影响因素;采用受试者工作特征(R O C)曲线评价血清l n c R NA ME G 3对胆管癌患者预后不良的预测价值;P0.0 5为差异有统计学意义。2 结 果2.1 胆管癌组与对照组患者血清l n c R NA ME G 3表达水平比较 胆管癌组血清l n c R NA ME G 3表达水平显著低于对照组(0.6 20.0 8与1.0 00.0 3,t=4 2.6 6 0,P0.0 5)。预后不良组肿瘤低分化、T NM分期期、有淋巴结转移、有血管浸润比例高于预后良好组(均P0.0 5)。表表22 预后良好组与预后不良组患者临床资料及病理特征比较项 目分 类预后良好组(n=4 8)预后不良组(n=4 4)t/2值P值年龄(岁)5 9.1 26.3 65 9.9 46.5 10.6 1 10.2 7 1男/女(例)2 5/2 32 2/2 20.0 4 00.8 4 2BM I(k g/m2)1 9.1 52.0 41 9.9 72.7 71.6 2 60.0 5 4肿瘤部位 例(%)肝门及肝内胆管2 8(5 8.3 3)2 7(6 1.3 6)0.0 8 80.7 6 7胆管中下段2 0(4 1.6 7)1 7(3 8.6 4)肿瘤直径 例(%)3c m3 2(6 6.6 7)3 0(6 8.1 8)0.0 2 40.8 7 73c m1 6(3 3.3 3)1 4(3 1.8 2)肿瘤分化程度 例(%)中高分化3 8(7 9.1 7)2 0(4 5.4 5)1 1.1 9 80.0 0 1低分化1 0(2 0.8 3)2 4(5 4.5 5)TNM分期 例(%)-期4 0(8 3.3 3)2 1(4 7.7 3)1 3.0 2 70.0 0 1期8(1 6.6 7)2 3(5 2.2 7)淋巴结转移 例(%)无3 3(6 8.7 5)1 0(2 2.7 3)1 9.5 3 30.0 0 1有1 5(3 1.2 5)3 4(7 7.2 7)血管浸润 例(%)无3 4(7 0.8 3)1 1(2 5.0 0)1 9.2 9 90.0 0 1有1 4(2 9.1 7)3 3(7 5.0 0)2.3 预后良好组与预后不良组患者血清l n c R NAME G 3表 达 水 平 比 较 预 后 不 良 组 血 清l n c R NAME G 3表达水平显著低于预后良好组(0.4 10.0 5与0.8 10.1 1,t=2 2.1 1 0,P0.0 5)。2.4 胆管癌患者血清l n c R NA ME G 3表达水平与肿瘤分化程度、T NM分期、淋巴结转移、血管浸润相关性分析 胆管癌患者血清l n c R NA ME G 3表达水平与肿瘤分化程度呈正相关,与T NM分期、淋巴结转移、血 管 浸 润 均 呈 负 相 关(r=0.5 2 2、-0.6 2 5、-0.6 8 0、-0.5 4 9,均P0.0 5)。2.5 胆管癌患者预后不良影响因素L o g i s t i c回归分析 见表3。以胆管癌患者是否预后不良(否=0,是=1)为因变量,以肿瘤分化程度(中高分化=0,低分化=1)、T NM分期(-期=0,期=1)、淋巴结转移(无=0,有=1)、血管浸润(无=0,有=1)及血清l n c R NA ME G 3(连 续 变 量)为 自 变 量,进 行 多 因 素L o g i s t i c回归分析。结果显示,肿瘤低分化、T NM分期期、有淋巴结转移以及血清l n c R NA ME G 3低表达是胆管癌患者预后不良的独立危险因素(均P0.0 5)。表表33 胆管癌患者预后不良影响因素L o g i s t i c回归分析项 目S EW a l d2值P值O R值9 5%C I肿瘤分化程度0.6 7 90.2 4 67.6 1 80.0 0 61.9 7 21.2 1 83.1 9 4TNM分期0.7 8 10.2 5 89.1 6 40.0 0 22.1 8 41.3 1 73.6 2 1淋巴结转移0.8 3 80.3 4 65.8 6 70.0 1 52.3 1 21.1 7 34.5 5 5血管浸润0.3 1 10.3 1 50.9 7 60.3 2 31.3 6 50.7 3 62.5 3 1l n c R NA ME G 30.8 0 40.3 2 16.2 7 00.0 1 22.2 3 41.1 9 14.1 9 12.6 血清l n c R NA ME G 3对胆管癌患者预后不良的预测价值 见图1。R O C曲线分析结果显示,血清5611陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l2 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9l n c R NA ME G 3预测胆管癌患者预后不良的曲线下面积为0.8 2 0(9 5%C I:0.6 8 30.9 5 7),截断值为0.6 2 0,敏感度为8 7.1 0%,特异度为7 0.8 0%。图1 血清l n c R NA ME G 3对胆管癌患者预后不良的预测价值R O C曲线3 讨 论胆管癌发生率呈逐年升高趋势,病因不明,起病隐匿,恶性程度较高,目前尚缺乏高灵敏度和特异度的生物学标志物用于诊断,大多患者确诊时往往已处于晚期,因此很难做到早期诊断和预后评估,目前其治疗手段以手术为主,以放化疗为辅,但预后在通常情况下较差,复发率高1 0-1 2。因此,需要寻找影响胆管癌预后的敏感生物学标志物以评估预后。l n c R NA广泛存在于生物体内并参与许多生理、病理进程,具有多种调控功能,且能够介导多种肿瘤的发生与发展1 3-1 5。近年来,随着基因工程学与生物信息学的发展,越来越多的研究1 6-1 8表明,l n c R NA参与癌基因的表达,在多种肿瘤中的重要作用不断被揭示,其在结肠癌等许多消化系统恶性肿瘤中都存在功能异常,且与肿瘤预后有关。研究1 9-2 1显示,l n c R NA在胆管癌患者非正常组织(肿瘤组织)中的表达与其在正常组织中的表达有巨大差异,l n c R NA可能确实参与了胆管癌的发生,而在癌症患者的癌症组织中出现异常表达的l n c R NA或许可以作为胆管癌早期诊断或预后评估的重要生物学标志物。l n c R NA ME G 3定位于人染色体1 4 q 3 2.3,是一种具有抑癌作用的l n c R NA,在癌组织中可能低表达,而高表达于正常人类组织,可通过抑制肿瘤血管生成阻止肿瘤恶性进展。有研究8,2 2报道,l n c R NA ME G 3可发挥抑癌基因作用,在肿瘤组织中表达缺失,这种异常的缺失可能参与肿瘤新血管的部分生成过程,并发展为促肿瘤的恶性作用,并且l n c R NA ME G 3含量的异常变化或许与 肿瘤细胞 的 增 殖 呈 负 相 关,即l n-c R NA ME G 3高表达可能对肿瘤细胞增殖的抑制具有重要作用,且l n c R NA ME G 3低表达患者预后较差。徐瀚 斌 等2 3研 究 表 明,在 胃 癌 组 织 中l n c R NAME G 3表达降低,而l n c R NA ME G 3表达降低预示着胃癌患者病情恶化及较差的预后。本研究结果显示,胆管癌患者血清l n c R NA ME G 3表达水平较健康人低,表明l n c R NA ME G 3参与胆管癌的发生。本研究还发现,预后不良组肿瘤低分化、T NM分期期、有淋巴结转移、有血管浸润比例均显著高于预后良好组,血清l n c R NA ME G 3表达水平显著低于预后良好组,且胆管癌患者血清l n c R NA ME G 3表达水平与肿瘤分化程度呈正相关,与T NM分期、淋巴结转移、血管浸润均呈负相关,提示血清l n c R NA ME G 3低表达与胆管癌患者病情进展和不良预后有关,其表达水平降低可能促进肿瘤血管生成,继而参与了肿瘤患者病情的不良发展,与患者预后不良有关。本研究还显示,肿瘤低分化、T NM分期期、有淋巴结转移、血清l n-c R NA ME G 3低表达是胆管癌患者预后不良的独立危险因素,表明血清l n c R NA ME G 3可能通过影响肿瘤细胞增殖等过程参与胆管癌进展,进而影响患者预后。R O C曲线分析结果表明,血清l n c R NA ME G 3水平对胆管癌患者的预后不良具有一定的预测价值,其可能用于胆管癌患者预后的评估。综上所述,胆管癌预后不良患者血清l n c R NAME G 3表达降低,是影响胆管癌患者预后的重要因素,对胆管癌患者的预后不良具有一定的预测价值,可能是 评 估 胆 管 癌 患 者 预 后 的 潜 在 参 考 指 标。但l n c R NA ME G 3在胆管癌进展及预后中的作用是一个复杂的过程,其具体作用机制仍需进一步研究。参考文献1 M a c i a sR I R,C a r d i n a l eV,K e n d a l lT J,e t a l.C l i n i c a l r e l e v a n c eo fb i o m a r k e r s i nc h o l a n g i o c a r c i n o m a:C r i t i c a l r e v i s i o na n df u-t u r ed i r e c t i o n sJ.G u t,2 0 2 2,7 1(8):1 6 6 9-1 6 8 3.2 D e n gM,R a nP,C h e nL,e t a 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