紫花苜蓿总黄酮不同提取方法的比较与分析_刘聪颖.pdf

第 43 卷 第 2 期 高 师 理 科 学 刊 Vol.43 No.2 2023 年 2 月 Journal of Science of Teachers College and University Feb.2023 文章编号：1007-9831（2023）02-0066-06 紫花苜蓿总黄酮不同提取方法的比较与分析 刘聪颖1，2，杨镇才1，2，吴稳1，2，张沐曦1，2，李晨阳1，2，李珊珊1，2，刘丽杰1，2，李波1，2（齐齐哈尔大学 1.生命科学与农林学院，2.抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）摘要：以龙牧 801 苜蓿干草粉为实验材料，应用索氏提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等提取紫花苜蓿总黄酮，分析不同提取方法对苜蓿总黄酮提取率的影响，优化苜蓿总黄酮的提取工艺结果表明，3 种提取方法对苜蓿总黄酮提取量大小为超声波辅助法微波辅助法索氏提取法，不同提取方法提取苜蓿总黄酮时，各种因素的影响各不相同，索氏提取时提取温度的影响最大，微波辅助提取时微波功率的影响最大，超声波辅助提取时超声波功率的影响最大超声波辅助提取法最优工艺参数为物料比 140，乙醇体积分数 60%，功率 144 W，提取时间 40 min，该工艺条件下苜蓿总黄酮平均提取量为 5.090 mgg-1 关键词：紫花苜蓿；总黄酮；提取方法 中图分类号：Q81 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1007-9831.2023.02.014 Comparison and analysis of different extraction methods of total flavonoids from alfalfa LIU Congying1，2，YANG Zhencai1，2，WU Wen1，2，ZHANG Muxi1，2，LI Chenyang1，2，LI Shanshan1，2，LIU Lijie1，2，LI Bo1，2（1.School of Life Sciences，Agriculture and Forestry，2.Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）AbstractAbstract：Longmu 801 alfalfa dry powder was used as experimental material Extracted total flavonoids from alfalfa by soxhletextraction，ultrasonic assisted extraction and microwave assisted extractionAnalyze the influence of different extraction methods on the extraction rate of alfalfa total flavonoids，and optimize the extraction process of alfalfa total flavonoidsThe results showed that the extraction amount of total flavonoids from alfalfa by the three extraction methods was as follows，ultrasonic assisted method microwave assisted method soxhlet extraction methodDifferent factors have different effects on the extraction of total flavonoids from alfalfa by different extraction methodsSoxhlet extraction has the most influence on extraction temperatureMicrowave power has the greatest influence on microwave assisted extractionThe influence of ultrasonic power on ultrasonic assisted extraction is greatestThe optimum technological parameters of ultrasonic assisted extraction were material ratio 140，ethanol volume fraction 60%，power 144 W，treatment time 40 min Under this technological condition，the average extraction amount of total flavonoids from alfalfa was 5.090 mgg-1 Key wordsKey words：alfalfa；total flavonoids；extraction method 收稿日期：2022-09-27 基金项目：2022年黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（S202210232103）；齐齐哈尔大学2022年研究生创新科研项目（YJSCX2022019）作者简介：刘聪颖（2002-）女，河北衡水人，在读本科生E-mail： 通信作者：李珊珊（1983-），女，黑龙江泰来人，教授，博士，从事生物化学研究E-mail： 第 2 期 刘聪颖，等：紫花苜蓿总黄酮不同提取方法的比较与分析 67 紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是我国重要的豆科牧草，其含有的黄酮类化合物是紫花苜蓿在生长过程中积累的一类重要的次级代谢产物，具有独特的营养和保健功效，可调节脂肪代谢和免疫功效，备受国内外学者的关注1目前，黄酮类化合物的提取方法较多，有超声波提取法、微波提取法、响应面法等2，但存在效率较低、成本较高、环境污染较大等问题3前人有关苜蓿中总黄酮提取工艺的研究已具有一定基础，张羽男4等探讨了紫花苜蓿总黄酮的微波辅助提取工艺条件，最佳提取条件：pH 为 10.00，固液比为150，功率为 140 W，提取时间为 30 s；胡桂莲5对超声辅助提取紫花苜蓿黄酮类物质工艺进行了优化，结果显示，影响黄酮类物质提取率的因素为料液比超声时间酶解时间超声温度，优化条件为物料比130，超声时间 30 min，超声温度 50，酶解时间 1 h；郭慧敏6等比较不同生育期紫花苜蓿总黄酮的差异，超声波提取的总黄酮含量明显高于微波提取法，盛花期采收的叶片中的总黄酮含量最高 本文以紫花苜蓿为材料，比较索氏提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法对总黄酮提取量的影响，获得最佳提取方法和工艺条件，为开发利用具有药用价值的苜蓿提供参考依据 1 实验材料、仪器与试剂 1.1 实验材料 “龙牧801”紫花苜蓿（齐齐哈尔大学苜蓿种植实验基地）于盛花期收割其茎叶部分，置于避光通风处阴干，后用高速多功能粉碎机将其粉碎成草粉，收集干草粉保存备用 1.2 仪器与试剂 YB-1500A高速多功能粉碎机（永康市速锋工贸有限公司）；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；DL360-E超声波清洗仪（上海之信仪器有限公司）；S7G88C微波炉（苏州三星电子有限公司）；SCT-06索氏提取器（杭州汇尔其一设备有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）芦丁标准品（上海源叶生物科技有限公司）；石油醚（湖北成丰化工有限公司）；无水乙醇（北京市津同乐泰化工产品有限公司）；氢氧化钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；亚硝酸钠（茂名市雄大化工有限公司）；九水硝酸铝（江苏普乐司生物科技有限公司）以上试剂均为分析纯 2 实验方法 2.1 标准曲线的绘制 将芦丁为标准品，用 60%的乙醇溶解，配制成 0.2 mgmL-1芦丁标准品溶液备用依次吸取 0，1，2，3，4，5，6 mL 标准品溶液，加入 60%乙醇（5 mL）、5%NaNO2溶液（1 mL）、10%Al（NO3）3溶液（1 mL）、4%的 NaOH 溶液（10 mL）静置 15 min，再加去离子水定容至 25 mL，使标准品溶液浓度分别为 0.000，0.008，0.016，0.024，0.032，0.040，0.048NaNO2-Al（NO3）3为显色剂，在=510 nm 测定吸光度，以芦丁质量浓度为 x 轴，吸光度为 y 轴，绘制标准曲线获得回归方程为 Y=13.893X-0.005 9（R2=0.997 3）2.2 样品溶液的制备 2.2.1 索氏提取法提取苜蓿总黄酮 准确称取 2.00 g 苜蓿干草粉，制成滤纸包置于索氏提取器中，在收集瓶中按设定好的物料比加入一定体积分数的乙醇，按照相应的提取温度和提取时间进行回流提取，各处理样品重复提取 3 次提取结束后真空抽滤，弃去植物残渣留滤液备用，所得滤液用等体积石油醚多次萃取去除叶绿素等杂质 收集萃取后的苜蓿总黄酮提取滤液，用旋转蒸发仪进行减压蒸发，直至液体无乙醇味 收集减压蒸发完毕后的滤液，用体积分数为 60%的乙醇重新定容至 50 mL 备用，所得液体即为苜蓿总黄酮粗提液 2.2.2 微波辅助提取苜蓿总黄酮 准确称取 2.00 g 苜蓿干草粉置于三角瓶中，按照设定的物料比加入一定体积分数的乙醇，在室温 120 rmin-1条件下震荡浸泡 1 h，浸泡完毕后将材料放在微波炉中，按照设置参数进行微波处理，各处理样品重复提取 3 次处理完后按照 2.2.1 的方法进行抽滤，减压蒸发，重新定容，所得液体即为苜蓿总黄酮粗提液利用微波炉对样品进行处理时，在转盘中央放置装有水的大烧杯用于吸热，将待处理样本的三角瓶摆放在大烧杯周围，每次处理 10 s 后将三角瓶取出，降至室温后再进行下一次处理 68 高 师 理 科 学 刊 第 43 卷 2.2.3 超声波辅助提取苜蓿总黄酮 样品前期处理同 2.2.2 方法 浸泡完毕后放置于超声波清洗仪中，按照设置的参数进行超声波处理，各样品重复提取 3 次处理完后按照 2.2.1 的方法进行抽滤，减压蒸发，重新定容，所得液体即为苜蓿总黄酮粗提液 2.2.4 正交实验因素水平 依据前期索氏提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法的各单因素对影响苜蓿总黄酮提取量的实验结果，对 3 种苜蓿总黄酮提取方法进行 L9（34）正交实验，正交实验因素水平见表 13 表1 索氏提取实验因素和水平 水平/因素 A 物料比/gmL B 乙醇体积分数（%）C 回流时间/h D 提取温度/1 120 60 2.5 85 2 130 70 3.0 90 3 140 80 3.5 95 表2 微波辅助提取实验因素和水平 水平/因素 A 物料比/gmL B 乙醇体积分数（%）C 微波时间/s D 微波功率/W 1 120 40 20 300 2 130 50 30 450 3 140 60 40 600 表3 超声波辅助提取实验因素和水平 水平/因素 A 物料比/gmL B 乙醇体积分数（%）C 超声波时间/min D 超声波功率/W 1 120 50 30 144 2 130 60 40 180 3 140 70 50 252 2.3 总黄酮含量测定方法 取 5 mL 提取液置于具塞刻度的试管中，按照 2.1 中标准曲绘制的方法进行显色反应，在 510 nm 下测定其 OD值并代入回归方程，计算样品中的总黄酮含量，公式为c Vnym=，式中：y 为总黄酮含量（mg g-1）；c 为提取液质量浓度（mgmL-1）；V为提取液体积（mL）；m 为干草粉质量（g）；n 为稀释倍数 2.4 苜蓿总黄酮的定性检测 2.4.1 总黄酮-NaOH 反应 取苜蓿总黄酮提取液 5 mL 于试管中，向其中加入 1 mL 浓度为 1 molL-1的NaOH 溶液，轻微震荡混匀，观察并记录其颜色反应73 2.4.2 总黄酮-FeCl3反应 称取 0.5 g FeCl3，用 20 mL 无水乙醇充分溶解，水定容至 50 mL，配制成质量浓度为 10 mgmL-1的 FeCl3溶液取苜蓿总黄酮提取液 5 mL 于试管中，30条件下水浴保温，向其中滴加FeCl3溶液，观察其颜色变化73 2.4.3 盐酸-镁粉实验 量取苜蓿总黄酮提取液 1 mL 于试管中，向其中加入少量镁粉，缓慢滴加浓盐酸，观察颜色变化在另一试管中加入等体积的苜蓿总黄酮提取液，只加入浓盐酸作为对照，排除本身颜色干扰73 2.4.4 总黄酮-H2SO4反应 取苜蓿总黄酮提取液 5 mL 于试管中，向其中加入 1 mL 浓硫酸，轻微摇晃，混匀后喷于定性滤纸上，吹干，观察并记录干燥后的颜色变化8-9 2.5 验证性实验 称取 4 份苜蓿干草粉备用，每份 1.00 g，由 2.2 实验所确定的最佳工艺作验证实验，按 2.3 的步骤测其吸光度，并计算总黄酮提取量 2.6 数据处理与分析 采用 Excel 2010 对数据进行整理，SPSS 19.0 分析软件对正交实验的结果进行分析 3 结果与分析 3.1 苜蓿总黄酮的定性检测结果 根据黄酮类化合物分子中交叉共轭体系、助色团数目、取代基位置不同，在强酸性或强碱性条件下可第 2 期 刘聪颖，等：紫花苜蓿总黄酮不同提取方法的比较与分析 69 与某些金属离子等发生反应，产生颜色变化 苜蓿总黄酮对各金属离子等的颜色反应及鉴定结果见表4 根据其颜色反应的变化可以推测本文方法中提取的苜蓿总黄酮提取液中主要含有黄酮类及黄酮醇类物质 表4 苜蓿总黄酮与酸、碱及不同金属离子颜色反应 反应体系 项目 氢氧化钠 浓硫酸 三氯化铁 盐酸-镁粉 颜色反应 亮黄色 深黄色 黄绿色 黄色 推测结果 黄酮类或异黄酮类 黄酮类或异黄酮类 黄酮类及黄酮醇类 黄酮类 3.2 正交实验结果分析 3.2.1 索氏提取法提取苜蓿总黄酮 在索氏提取法提取苜蓿总黄酮的单因素实验结果基础上进行正交实验，结果见表 5由表 5 可见，根据 K 值，当物料比为 130，乙醇体积分数为 70%，回流时间为 2.5 h 时，提取温度为 95，苜蓿总黄酮提取量最高由 R 值结果可知，R4R3R1R2，表明索氏提取法的 4 种因素对苜蓿总黄酮提取量的影响依次为提取温度回流时间物料比乙醇体积分数，该法提取苜蓿总黄酮最佳工艺水平组合为 A2B2C1D3 表5 索氏提取法正交实验结果 组别 A 物料比/gmL B 乙醇体积分数（%）C 回流时间/h D 提取温度/总黄酮提取量/mgg-1 1 120 60 2.5 85 1.220 2 120 70 3.0 90 1.361 3 120 80 3.5 95 2.125 4 130 60 3.5 90 2.005 5 130 70 2.5 95 2.544 6 130 80 3.0 85 1.060 7 140 60 3.0 95 1.889 8 140 70 3.5 85 1.517 9 140 80 2.5 90 2.071 K1 4.706 5.113 5.836 3.797 K2 5.609 5.422 4.154 5.437 K3 5.477 5.257 5.647 6.558 R 0.903 0.309 1.682 2.762 因素主次 3 4 2 1 最优水平 A2 B2 C1 D3 3.2.2 微波辅助提取法提取苜蓿总黄酮 在微波辅助提取法提取苜蓿总黄酮的单因素实验结果基础上进行正交实验，其结果见表 6由表 6 可见，根据 K 值，当物料比为 130，乙醇体积分数为 60%，微波时间为 30 s，微波功率为 450 W 时，苜蓿总黄酮提取量最高由 R 值结果可知，R4R3R2R1，表明超声波辅助提取的4个因素对紫花苜蓿总黄酮提取量的影响依次为微波功率微波时间乙醇体积分数物料比，该法提取苜蓿总黄酮最佳工艺水平组合为 A2B3C3D2 表6 微波辅助法正交实验结果 组别 A 物料比/gmL B 乙醇体积分数（%）C 微波时间/s D 微波功率/W 总黄酮提取量/mgg-1 1 120 40 20 300 1.520 2 120 50 30 450 1.778 3 120 60 40 600 1.808 4 130 40 30 600 1.641 5 130 50 40 300 1.761 6 130 60 20 450 2.004 7 140 40 40 450 1.937 8 140 50 20 600 1.664 9 140 60 30 300 1.685 K1 1.702 1.699 1.729 1.655 K2 1.802 1.734 1.701 1.906 K3 1.762 1.832 1.835 1.704 R 0.100 0.133 0.134 0.251 因素主次 4 3 2 1 最优水平 A2 B3 C3 D2 70 高 师 理 科 学 刊 第 43 卷 3.2.3 超声波辅助提取法提取苜蓿总黄酮 在超声波辅助提取法提取苜蓿总黄酮的单因素实验结果基础上进行正交实验，其结果见表 7由表 7 可见，根据 K 值，当物料比为 140，乙醇体积分数为 60%，超声波 40 min，超声波功率为 144 W 时，苜蓿总黄酮提取量最高由 R 值结果可知，R4R1R2R3，表明超声波辅助提取的 4 个因素对紫花苜蓿总黄酮提取量的影响依次为超声波功率物料比乙醇体积分数超声波时间，该法提取苜蓿总黄酮最佳工艺水平组合为 A3B2C2D1 表7 超声波辅助法正交实验结果 组别 A 物料比/gmL B 乙醇体积分数（%）C 超声波时间/min D 超声波功率/W 总黄酮提取量/mgg-1 1 120 50 30 144 2.044 2 120 60 40 180 2.878 3 120 70 50 252 1.196 4 130 50 50 180 2.556 5 130 60 30 252 1.914 6 130 70 40 144 2.794 7 140 50 40 252 2.107 8 140 60 50 144 3.502 9 140 70 30 180 2.806 K1 2.039 2.236 2.255 2.780 K2 2.421 2.765 2.593 2.747 K3 2.805 2.265 2.418 1.739 R 0.767 0.529 0.338 1.041 因素主次 2 3 4 1 最优水平 A3 B2 C2 D1 3.3 种不同方法提取苜蓿总黄酮的比较 从索氏提取法、微波辅助法、超声波辅助法提取苜蓿中总黄酮的提取量验证实验来看（见表 8），超声波辅助法适宜提取苜蓿的总黄酮，其提取量最高，提取效率明显优于索氏提取法和微波辅助提取法从 3种方法提取的结果看，用不同提取方法进行苜蓿总黄酮提取时，各种因素的影响各不相同，索氏提取时提取温度的影响最大，微波辅助提取时微波功率的影响最大，超声波辅助提取时超声波功率的影响最大 表8 3种方法提取苜蓿总黄酮的验证实验 mgg-1 总黄酮提取量 组别 索氏提取法 微波辅助提取法 超声波辅助提取法 1 2.284 2.158 2 1.997 2.163 3 2.203 2.181 4 2.059 2.214 4.908 4.951 4.994 5.325 平均提取量 2.136 2.179 5.090 4 讨论 黄酮类化合物虽然具有极性，但较难溶于水，对乙醇等有机溶剂的亲和性更高，因此常选择合适的有机溶剂进行浸泡提取索氏提取法提取总黄酮的基本原理与浸提热回流法相同，但浸提热回流法提取时间长、速率慢陈兵兵10等研究了宁夏紫花苜蓿总黄酮提取工艺，通过加热回流对乙醇浓度、回流时间、固液比、提取温度等进行了正交实验，获得最佳提取工艺为回流时间 6 h，物料比为 140，乙醇体积分数为50%，温度为 70，总黄酮提取量为 8.78 mgg-1与本文中优化索氏提取法提取苜蓿总黄酮各因素水平有一定差异，最佳工艺组合为物料比 130，乙醇体积分数 70%，回流时间 2.5 h，提取温度为 95，总黄酮提取量为 2.136 mgg-1两者得到的总黄酮提取量比本文的方法略低，但回流时间大大缩短，若想有效提高总黄酮类的提取量，可在溶剂浸提法的基础上改善提取环境 微波和超声波辅助提取法广泛应用在黄酮类化合物，目前用微波和超声波辅助提取苜蓿总黄酮的研究鲜有报道张咏梅11等研究“甘农 3 号”紫花苜蓿黄酮提取量的乙醇浓度、微波功率、物料比、提取时间的正交实验，最佳工艺为乙醇浓度 40%，物料比 130，微波功率 500 W，提取时间 60 s，此工艺条件下黄酮提取量为 4.88 mgg-1本文中微波辅助法提取紫花苜蓿总黄酮最佳工艺水平组合：物料比 130，乙第 2 期 刘聪颖，等：紫花苜蓿总黄酮不同提取方法的比较与分析 71 醇体积体积分数 60%，微波时间 30 s，微波功率为 450 W，总黄酮提取量为 2.179 mgg-1与前人研究比较总黄酮得率略低，但微波辅助法提取工艺的各因素水平基本一致 许英一12等研究紫花苜蓿叶总黄酮的超声波提取工艺，在单因素实验的基础上设计正交实验，最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数 70，提取温度 60，超声波时间 30 min，超声功率 180 W，总黄酮得率为6.43 mgg-1本文超声波辅助法提取苜蓿总黄酮的正交实验，获得最优工艺参数为物料比 140，乙醇体积分数 60%，功率 144 W，提取时间 40 min，总黄酮平均提取量为 5.090 mgg-1，与前人研究超声波辅助法提取苜蓿总黄酮的结果基本一致 通过对 3 种苜蓿总黄酮提取方法的比较发现，索氏提取法的提取工艺方便简单，但耗时长于微波辅助法和超声波辅助法，不适用于工业化提取；微波辅助提取法虽然处理时间短，但微波处理过程温度不易控制，苜蓿黄酮的提取量与索氏提取法比较差异不大，不适宜大规模提取；超声波辅助提取法利用超声波的空化作用，产生振动加速苜蓿细胞内总黄酮的释放，提取操作简单，提取效率优于索氏提取法和微波辅助法，可以大规模提取，工业化生产采用超声波辅助法提取效果较好但在实际工作中可以根据具体情况选择适合的提取方法，以加快植物次生代谢产物的开发和利用 5 结论 本文采用正交实验方法比较索氏提取法、超声提取法、微波提取法对苜蓿总黄酮提取量的影响不同提取方法提取苜蓿总黄酮时，各种因素的影响各不相同，超声波辅助法优于微波辅助法和索氏提取法超声波辅助提取法最优工艺参数为物料比 140，乙醇体积分数 60%，功率 144 W，提取时间 40 min，此工艺下苜蓿总黄酮平均提取量为 5.090 mgg-1 参考文献：1 王成章，文开新，史莹华，等紫花苜蓿黄酮的提取与纯化工艺初探J草地学报，2013，21（2）：365-371 2 容庭，马新燕，李贞明，等正交法比较两种新会柑果肉中总黄酮提取工艺J广东畜牧兽医科技，2022，47（5）：13-17，63 3 刘朝旭，王玮，马东来甘草总黄酮的不同提取方法比较及其抗氧化活性研究J精细与专用化学品，2018，26（12）：27-30 4 张羽男，黄淼，张宇，等紫花苜蓿总黄酮的微波辅助提取及其体外抗肿瘤活性研究J时珍国医国药，2014，25（6）：1300-1302 5 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