饲料中添加刺五加对吉富罗非.及肠道消化酶和微生物的影响_李全杰.pdf

为明确饲料中添加刺五加(Acanthopanax senticosus)超微粉对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)脂质沉积、抗氧化能力及肠道消化酶和微生物的影响,通过为期8周的饲养试验,在饲料中添加4的刺五加超微粉(中草药添加剂),对比研究饲料添加刺五加后吉富罗非鱼肠道消化酶、肝脏生化指标和肠道微生物组成的变化。结果表明:(1)饲料添加4的刺五加超微粉可以显著提高肠道消化酶(淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶)含量,罗非鱼生长速度和饲料利用效率均显著升高;(2)饲料添加4的刺五加超微粉可以显著降低肝脏甘油三酯(Triglyceride,TG)和总胆固醇(Total cholesterol,TC)水平,同时肝脏丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量降低、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性升高;(3)饲料添加4的刺五加超微粉可以显著影响肠道微生物组成,提升肠道微生物alpha多样性,部分多样性指数与淀粉酶、脂肪酶、SOD显著正相关,与TC、TG显著负相关;(4)变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)是吉富罗非鱼肠道优势菌门。筛选出的核心差异菌属是显著富集于对照组的肠弧菌属(Enterovibrio)、鲸杆菌属(Cetobacterium)和霍氏弧菌属(Grimontia),显著富集于刺五加添加组的劳森氏菌属(Lawsonia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和短螺旋体属(Brevinema),在吉富罗非鱼肠道内存在着一定丰度的潜在致病菌。(5)PICRUSt2功能预测表明代谢(Metabolism)在一级功能层显著富集,对照组疾病(Human diseases)代谢通路相对丰度显著高于刺五加添加组,两个处理组在二级功能层有相似的分布特征,肠道菌群的多样性功能将在代谢中发挥重要作用。综上,饲料中添加刺五加超微粉可以影响吉富罗非鱼的肠道酶活、肝脏生化指标和肠道菌群组成和功能,促进罗非鱼的健康生长。关键词:刺五加;生长;肠道微生物;吉富罗非鱼中图分类号:S965.1 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2023)09-1396-13 自2000年以来,中国一直是全球最大的鱼类生产国和贸易国,其在全球水产养殖业中发挥着巨大作用1。2020年中国水产养殖产量达到5.21010 kg,水产养殖面积703万公顷2。但是随着集约化养殖的快速发展,包括土地和水资源限制、水生生态系统破坏、疾病频发、尾水处理及水产品安全和质量等问题逐渐凸显,制约了我国水产养殖业的绿色、高效发展3。在高密度养殖条件下,饲养动物的肠道健康尤为重要。许多微生物栖息在动物的肠道中,在维持肠道环境平衡和宿主健康方面发挥着至关重要的作用4。肠道微生物对宿主的新陈代谢5,6、生长发育7,8和免疫力9,10等都有重要作用。集约化的养殖模式大大提高了养殖密度,高密度易对养殖动物形成应激,导致其对疾病的抵抗力下降,随之而来的是养殖过程中抗生素和化学药品的激增,不仅容易导致耐药性和食品安全等问题,残留在养殖水体中的化学物质会对整个水生生态系统造成风险11。人们对环境保护和食品安全的重视程度与日俱增,绿色、健康的水产养殖业是未来发展的核心思想,与此同时,污染少、功能全面的饲料添加剂是提高养殖效率、减少药物使用的有效补充。研究结果表明,具有营养和药理特性的中草药在开发新型水产饲料添加剂的研究中具有巨大的第 47 卷 第 9 期水 生 生 物 学 报Vol.47,No.9 2023 年 9 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAS e p.,2 0 2 3 收稿日期:2022-07-10;修订日期:2022-09-05基金项目:国家特色淡水鱼产业技术体系项目(CARS-46)资助 Supported by the earmarked fund for CARS-46作者简介:李全杰(1991),男,硕士研究生;主要从事工程化养殖研究。E-mail:通信作者:徐钢春,研究员,博士生导师;E-mail:潜力12,13。其中刺五加(Acanthopanax senticosus)是中国一味传统中草药,五加科植物的根和根茎在收割后进行晾晒后可以作为药材使用。它含有皂苷、多糖和黄酮类等多种生物活性物质,同时还富含营养成分(微量元素和氨基酸等)14,15。目前大量的研究均证实了刺五加对机体的积极作用,包括促进生长16、增强免疫17,18、提高抗氧化能力19、缓解炎症20及调节脂质代谢21。同时刺五加作为一味使用已久的中药,其来源广泛、毒副作用较小,有可能是一种优质的水产养殖饲料添加剂。超微粉碎是把原材料经特殊工艺加工成,进而形成微米甚至纳米级的微粉,通过增加微粒的表面积,可以提高有效成分在体内的吸收利用22。我们使用超微粉碎工艺对刺五加进行处理,通过提高刺五加中有效成分的吸收,可以降低刺五加的添加量,提升使用效率。吉富罗非鱼(Genetically improved farmed tilapia,GIFT,Oreochromis niloticus)是我国罗非鱼产业的一个明星品种,其生长速度快、抗逆和抗病性能佳、鱼片产量高15。目前在罗非鱼产业发展中,部分养殖户养殖技术缺乏、疾病频发、滥用鱼药,造成鱼体内存在严重药物残留,同时药物防控效益逐渐下降,不利于提高罗非鱼产量和品质。本研究通过为期8周的饲养试验,对比研究在饲料中添加4的刺五加超微粉(中草药添加剂)对吉富罗非鱼肠道消化酶含量、肝脏生化指标和肠道微生物组成的影响,以期为中草药刺五加在水产养殖中的高效使用供数据支撑,也为吉富罗非鱼的健康养殖提供理论依据。1 1 材料与方法 1.11.1 实验动物试验用吉富罗非鱼来源于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴基地,挑选大小一致、活力好、无伤病的个体。饲养于南京农业大学无锡渔业学院水产温室内,采用可以控温的循环水养殖系统,每日定时(8:00和16:00)投喂颗粒饲料。罗非鱼暂养期间投喂市售商品颗粒饲料(天邦,中国)。1.21.2 试验饲料制备与试验设计准备表 1所示的饲料原料和刺五加超微粉,其中刺五加超微粉购自北京渔经生物技术有限责任公司,使用超微粉碎工艺进行制备,通过破碎植物药材的细胞壁,利用流体力学和机械途径将较大的中药颗粒粉碎成1015 m小颗粒,有效成分中总多糖占11.30%,总黄酮占1.41%;饲料原料均购自通威股份有限公司无锡分公司,预混料购自溧阳正昌饲料科技有限公司。根据实验室前期开展关于饲料添加刺五加对吉富罗非鱼生长的试验结果表明24是较为适宜的添加量,试验设计分别配置对照组(C)和实验组(T)试验饲料,对照组添加4.0微晶纤维素,实验组添加4.0刺五加超微粉。试验饲料组成及营养水平如表 1所示。将160尾吉富罗非鱼平均体重(8.320.15)g随机分为两组,每个处理组设置4个重复,每个重复20尾。养殖试验为期8周,在控温循环水养殖系统进行,每个养殖桶体积600 L,试验期间水体持续曝气增氧。在试验期间,试验鱼每日投喂2次(8:00和16:00),饱食投喂,每2d换水1/3。维持水温(281),溶氧5 mg/L,pH 7.47.8,氨氮0.1 mg/L,亚硝酸盐0.01 mg/L。1.31.3 样本采集采样前吉富罗非鱼禁食1d,每个养殖桶随机选取3尾鱼,每个处理组共计12尾,测量体重,计算增重率(Weight gain rate,WGR)、特定生长率(Specificgrowth rate,SGR)、饲料利用效率(Feed efficiency,FE)和摄食率(Feeding rate,FR)。用100 mg/L MS-222预先麻醉后解剖取出肝脏和肠道(整个肠道,包含部分未消化食糜),组织在液氮中速冻后80冰表 1 试验饲料组成及营养水平Tab.1 Composition and nutrient levels of experimental diets分组GroupCT原料Ingredient鱼粉Fish meal10.0010.00次粉Wheat middlings10.6010.60玉米淀粉Corn starch16.8016.80大豆油Soybean oil5.005.00豆粕Soybean meal16.0016.00棉籽粕Cottonseed meal16.0016.00菜籽粕Rapeseed meal16.0016.00预混料Premix#3.503.50氯化胆碱Choline chloride0.500.50微晶纤维素Microcrystalline cellulose5.605.20刺五加超微粉A.senticosus ultrafine powder0.000.40合计Total100100营养水平(测定值)Chemical composition(Determined)粗蛋白质Crude protein28.5528.14粗脂肪Crude lipid6.376.74注:#每千克预混成分为(Contents per kg premix):VA 170430 KIU;VD 2885 KIU;VE570 mg;VK 60200 mg;VB1110 mg;VB2170 mg;VB6110 mg;VB120.5 mg;VC3400 mg;肌醇 inositol1700 mg;烟酰胺nicotinamide628 mg;泛酸pantothenic acid514 mg;叶酸folic acid50 mg;铁 Fe28008500 mg;铜 Cu 80290 mg;锌 Zn 17003400 mg;锰Mn 8002000 mg;碘 I 1632 mg;硒 Se 714 mg;钙 7%14%;总磷 6.4%9 期李全杰等:饲料中添加刺五加对吉富罗非鱼脂质沉积、抗氧化能力及肠道消化酶和微生物的影响1397箱保存待测。同时统计每个养殖桶存活的鱼总数,计算存活率(Survival rate,SR)。1.41.4 肝脏生化指标和肠道消化酶测定根据以下公式计算WGR、SGR、FE和FR:WGR(%)=100(WtW0)/W0SGR(%/d)=100(lnWtlnW0)/tFE(%)=100(WtW0)/FFR(%)=100F/(Wt+W0)/2t式中,W0为试验鱼的初重(g);Wt为试验鱼的末重(g);F为饲料总重;t为饲养天数。将冻存的肝脏和肠道组织置冰上解冻,吸干表面水分后称取大约0.1 g组织样品,加入9倍机体(m/v)的预冷磷酸盐缓冲溶液,机械研磨均匀后在4、3000 r/min离心10min,弃去沉淀,制成组织匀浆。根据试剂盒说明书所示方法测定肝脏总胆固醇(Total cholesterol,TC;A111-1-1,单试剂GPO-PAP法)、甘油三酯(Triglyceride,TG;A110-1-1,单试剂GPO-PAP法)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA;A003-1-2,TBA法)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD;A001-3-2,WST-1法)和肠道淀粉酶(Amylase;C016-1-1,淀粉-碘比色法)、胰蛋白酶(Trypsin;A080-2-2,紫外比色法)、脂肪酶(Lipase;A054-2-1,比色法)、总蛋白(Total protein;A045-4-2,BCA法)。试剂盒购自南京建成生物工程有限公司(南京,中国)。1.51.5 DNA提取和16S rDNA测序取肠道样本(80冰箱冻存)放置在冰块上解冻,放入研钵后加入液氮研磨至,使用预先冷冻处理的2 mL离心管,称量100 mg左右样本进行总DNA提取。样品使用TIANGEN粪便提取试剂盒(DP328)提取肠道微生物总DNA,操作根据试剂盒说明进行,提取完毕后使用NanoDrop Lite微量核酸检测仪进行浓度测定并使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。采用的16S rDNA引物为341F:5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3;805R:5-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,对目标片段使用AxyPrepPCR Cleanup Kit回收试剂盒进行回收。纯化后的PCR产物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Qbit 荧光定量系统上对文库进行定量,合格的文库浓度应在2 nmol/L以上。将合格的上机测序文库(Index 序列不可重复)梯度稀释后,根据所需测序量按相应比例混合,并经NaOH 变性为单链进行上机测序,使用NovaSeq测序仪进行2250 bp的双端测序。采用杭州联川生物有限公司的NovaSeq PE250平台进行高通量测序。1.61.6 数据处理和分析采用SPSS 22.0软件处理所得数据先使用Sha-piro-Wilk和Levene 检验对数据的正态性和方差同质性进行分析,然后使用t检验进行显著性分析。结果以平均值标准差(meanSD)表示。根据Illumina MiSeq平台双端测序的重叠关系,将序列拼接(merge)成一条序列tags,同时过滤Reads的质量和合并的效果。将序列相似度大于97%的相似序列聚类为OTU(Operational Taxonomic Units)。根据已有细菌和真菌的分类学数据库将OTUs进行分类和标注。Alpha多样性用于分析样本物种多样性的复杂性,具有4个指标Observed_Spieces、Shannon、Simpson和Chao1。Alpha和Beta多样性由QIIME流程分析,Alpha多样性显著性检验采用Wilcoxon秩和检验,Beta多样性采用ADONIS分析。用Wilco-xon秩和检验确定样品间相对丰度差异的显著性。显著差异肠道菌群的筛选使用LefSe分析,设定P4。利用PICRUSt2对肠道菌群功能进行预测,使用Wilcoxon秩和检验对预测的功能进行差异分析。在各显著性检验中,显著差异*P0.05、*P0.01、*P0.001和*P0.0001。2 2 结果 2.12.1 刺五加超微粉对吉富罗非鱼生长性能的影响如表 2所示,实验组的WGR、SGR和FCR均要显著高于对照组(P0.05),实验组FR和SR与对照组相比无显著差异。2.22.2 刺五加超微粉对吉富罗非鱼肝脏生化指标的影响如表 3所示,饲料中添加刺五加后罗非鱼肝脏SOD活性显著升高,但是无显差异(P=0.05)。添加刺五加后肝脏MDA、TC和TG含量显著降低(P0.05)。2.32.3 刺五加超微粉对吉富罗非鱼肠道消化酶的影响如表 3所示,饲料中添加刺五加超微粉后,肠道淀粉酶(Amylase)、脂肪酶(Lipase)和胰蛋白酶(Trypsin)含量均显著升高(P0.05)。表 2 刺五加超微粉对吉富罗非鱼生长性能的影响Tab.2 Effect of A.senticosus supplementation on growth perfor-mance of GIFT分组Group增重率WGR(%)特定生长率SGR(%/d)饲料利用效率FE(%)摄食率FR(%)存活率SR(%)C1218.8328.134.470.0370.233.104.320.1695.001.77T1371.7825.51*4.680.02*73.581.35*4.260.1293.751.25注:同列数据上标*表示差异显著(P0.05);下同Note:Values with*superscripts mean significant differences(P0.05).The same applies below1398水 生 生 物 学 报47 卷 2.42.4 刺五加超微粉对吉富罗非鱼肠道微生物多样性的影响Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性,处理组的Observed_species、香农-威纳指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)和Chao1指数均显著高于对照组(P0.05;图 1a)。Beta多样性又称生境间的多样性,是指沿环境梯度不同生境群落之间物种组成的相异性或物种沿环境梯度的更替速率。主成分分析算法(Princi-pal Component Analysis,PCA)是最常用的线性降维方法。如图 1b所示,同一处理组之间样本聚集,而不同处理组之间样本区分明显,表明不同处理之间吉富罗非鱼样本肠道微生物组成存在显著差异(R=0.711,P=0.001)。通过斯皮尔曼相关性分析,我们发现肠道消化酶中淀粉酶和shannon指数(R=0.414,P=0.044)显著正相关,脂肪酶和shannon指数(R=0.561,P=0.004)及simpson指数(R=0.507,P=0.011)显著正相关(表 4)。而肝脏生化指标中TC、TG均和Observed_spieces显著负相关(R=0.561,P=0.004;R=0.448,P=0.028);SOD则是同Shannon指数(R=0.437,P=0.033)及simp-son指数(R=0.449,P=0.028)显著正相关。2.52.5 刺五加超微粉对吉富罗非鱼肠道微生物组成的影响在门分类水平上(图 2a),平均相对丰度大于1%的菌门共计7个:变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。差异分析(图 2bh)表明,处理组梭杆菌门相对丰度显著高于对照组(P0.05),而放线菌门和螺旋体门相对丰度显著低于对照组(P0.05)。进一步确定与饲料添加刺五加超微粉相关的肠道微生物核心菌群,使用不同差异分析方法进行筛选。通过韦恩图(图 3c)可知,刺五加添加组特有OTUs为1976个,占63.90%,要显著多于对照组特有OTUs的155个(9.20%)。采用曼哈顿图展示Meta-genomeSeq 分析筛选出具有富集趋势的OTUs。两个处理组显著差异的OTUs(25个)大部分集中在变形菌门(21个)。显著富集于对照组的OTUs都归属于变形菌门(12个)。相较于对照组,刺五加添加组显著富集的OTUs,分布在变形菌门(9个)、梭杆菌门(2个)和拟杆菌门(2个)。随机森林分析筛选出在科水平上重要度排名前五的是:富集于对照组的弧菌科(Vibrionaceae)和梭杆菌科(Fusobacteriaceae),富集于刺五加添加组的莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)和黄杆菌科(Fla-vobacteriaceae)。通过LEfSe分析,筛选出P4的已知差异菌属共计7个,显著富集于对照组的是肠弧菌属(Enterovibrio)、鲸杆菌属(Cetobac-terium)和霍氏弧菌属(Grimontia);显著富集于刺五加添加组的是劳森氏菌属(Lawsonia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和短螺旋体属(Brevinema)。2.62.6 吉富罗非鱼肠道微生物的功能路径预测使用PICRUSt2基于获得的OTUs进行菌群功能分析,利用KEGG(Tyoto encyclopedia of genes andgenomes)数据库对获得的数据进行比对,所有肠道样本菌群功能涉及6类一级生物代谢通路(图 4a),其中相对丰度处于显著优势的是代谢(Metabolism),其相对丰度分别为47.59%和46.43%。在 一级功能层中,对照组疾病的相对丰度显著高于刺五加添加组(P0.05)。进一步对预测功能在二级功能层进行分析(图 4b),共计获得38个二级通路。其中,在两个处理组相对丰度均大于5%的有膜转运(Mem-brane transport)、氨基酸代谢(Amino acid metabo-lism)、碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism)、复制和修复(Replication and repair)和能量代谢(Ene-rgy metabolism)。在二级功能层中,对照组膜转运、氨基酸代谢、能量代谢的相对丰富显著高于刺五加添加组(P0.05)。3 3 讨论 3.13.1 刺五加超微粉对吉富罗非鱼生长和生化指标的影响中草药富含有丰富的营养和生物活性物质,可以促进机体新陈代谢,且有利于动物体的生长和免疫23。在关于刺五加的诸多研究中均证实了这一点。例如,刺五加提取物被证实可以显著促进断奶仔猪的生长性能24;刺五加水提物显著提升黄鳝表 3 刺五加超微粉对吉富罗非鱼肝脏生化指标和肠道酶活的影响Tab.3 Effects of A.senticosus supplementation on liver biochemical and intestinal enzymes of GIFT分组GroupTC(mmol/gtissue)TG(mmol/gtissue)MDA(mmol/gprot)SOD(mg/g prot)Amylase(ng/mg prot)Trypsin(ng/mg prot)Lipase(ng/mg prot)C0.220.050.210.0343.598.2225.593.7673.4113.31100.4311.3932.256.51T0.190.03*0.180.03*34.097.46*34.205.4089.2118.28*119.5224.05*41.518.04*9 期李全杰等:饲料中添加刺五加对吉富罗非鱼脂质沉积、抗氧化能力及肠道消化酶和微生物的影响1399(Monopterus albus)和杂交黄颡鱼(Tachysurus fulvid-racoPseudobagrus vachellii)的生长发育20,25。我们的研究结果也再次证实了这一点,在饲料中添加4的刺五加超微粉后吉富罗非鱼的增重率、特定增长率和饲料利用效率均有明显的提升。刺五加含有的活性成分被证实可以促进动物肠道的发育和促进消化腺的分泌26。在本次试验中,刺五加添加组罗非鱼肠道的消化酶(脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶)含量均显著提升,促进机体更好地吸收和利用营养物质,促进罗非鱼的生长和提升饲料利用率。肝脏是大部分动物最重要的实质性器官,具有旺盛的新陈代谢功能。在一般情况下,机体的抗氧化系统可以高效去除机体产生的活性氧。而当机体受到应激等不利因素影响时,大量活性氧不能被抗氧化系统及时清除,就会对细胞产生氧化损伤27。SOD就是机体抗氧化系统中的关键性酶之一。MDA是机体不饱和脂肪酸受到氧自由基攻击后产生的物质,会进一步引起细胞损伤,其含量可以评价机体内活性氧以及脂质过氧化水平,进而反映细胞损伤情况28。在饲料添加刺五加超微粉后,实验结束时吉富罗非鱼肝脏的MDA含量显著低于对照组,SOD活性则显著高于对照组,表明刺五加可以提高罗非鱼的抗氧化能力,有效减轻肝脏损伤。肝脏也是机体进行脂质合成与代谢的器官。和对照组相比,刺五加添加组肝脏组织中TC和TG的含量均显著下降。我们推测刺五加对机体脂质代谢具有促进作用。刺五加中的有效成分(皮质醇)被研究证实可以减少肝脏的脂质沉积、降低胰岛素浓度,改善肝脏脂肪变性29。集约化高密度水产养殖业通常都是精养模式,导致养殖鱼类脂肪肝等肝脏病变频发30。患病鱼类体表病理特征不明显,往往不易及时发现。然而,在养殖过程中患病鱼类常常会表现出生长缓慢,抗应激能力低、肉品质差等问题,这给养殖业的健康发展带来诸多负面影响31。刺五加中富含皂苷、多糖、黄酮及多种微量元素及氨基酸等,这些化学成分具有明显的药理和保健作用。刺五加中的多种天然营养成分和生物活性物质可以促进肠道的消化吸收功能。刺五加多糖具有显著增强免疫功能和抗氧化活性的作用,能够通过提高抗氧化酶活性来增强机体的抗氧化能力。刺五加作为饲料添加剂可以促进机体的脂代谢,降低肝脏的脂质沉积,同时增强肝脏对自由基的清除作用,增强抗氧化能力,对促进水产动物健康养殖起积极作用。3.23.2 刺五加超微粉对吉富罗非鱼肠道微生物结构的影响在我们先前开展关于鱼类肠道微生物的研究0CTCTCTCT100200300400500600abObserved_speciesShannonSimpsonChaol*2345670.60.81.001002003004005006007008000.40.200.30.20.10.0PCA1(45.78%)PCA2(24.89%)CTPCA AnalysisR=0.711P=0.001 图 1 添加刺五加对吉富罗非鱼肠道微生物Alpha多样性(a)和Beta多样性(b)的影响Fig.1 Effect of A.senticosus supplementation on Alpha diversity(a)and Beta diversity(b)of GIFT1400水 生 生 物 学 报47 卷中发现,肠道微生物组成受到饲料营养元素组成的显著影响32,33。本研究则表明,少量添加的饲料添加剂也会显著改变吉富罗非鱼的肠道微生物结构。PCA分析结果表明,随着8周的养殖试验,罗非鱼肠道的微生物组成发生了显著变化。Alpha 多样性是反映肠道微生物丰富度和均匀度的综合指标,是分析微生物群落结构的重要参数。微生物多样性与机体健康密切相关,物种多样性可以有效提高肠道菌群的稳定性和功能性34,35。与正常条件下饲喂的动物相比,在无菌条件下喂养100OthersBacteroidetesSpirochaetesActinobacteriaVerrucomicrobiaFirmicutesFusobacteriaProteobacteriaabc9050403020100ProteobacteriaFusobacteria*8070605040CTCT806040200051015defghFirmicutesVerrucomicrobiaActinobacteriaSpirochaetesBacteroidetesCTCT0510CT1520253005101520*CT05CT051015CT1015图 2 添加刺五加对吉富罗非鱼肠道微生物组成(门水平)的影响Fig.2 Effect of A.senticosus supplementation on microbial composition(phylum level)表 4 吉富罗非鱼生化指标和Alpha多样性斯皮尔曼相关性分析Tab.4 Spearmans r correlation coefficient between Alpha diversity and physiological parameters in GIFT指标IndexObserved_SpiecesShannonSimpsonChao1RPRPRPRPAmylase0.3040.1490.4140.0440.3970.0550.3110.139Trypsin0.2230.2950.2730.1970.3160.1320.0510.812Lipase0.240.2590.5610.0040.5070.0110.2150.313TC0.5610.0040.2720.1990.0780.7170.3070.145TG0.4480.0280.3820.0660.3380.1060.2720.199MDA0.2430.2520.310.1410.3240.1220.1120.602SOD0.3620.0820.4370.0330.4490.0280.3990.053注:正值表示多样性指标和生化指标正相关,负值表示多样性指标和生化指标负相关。显著相关的指标以粗体标注(P0.05)Note:Positive values indicate positive correlations and negative values indicate inverse correlations between diversity index and eachphysiological parameter.Significant values(P0.05)are indicated in bold font9 期李全杰等:饲料中添加刺五加对吉富罗非鱼脂质沉积、抗氧化能力及肠道消化酶和微生物的影响1401f_Enterobacteriaceaef_Brevinemataceaef_Deinococcaceaef_Spartobacteria_genera_incertae_sedisf_Actinomycetales_unclassifiedf_Rhodobacteraceaef_Streptococcaceaef_Sphingomonadaceaef_Mycobacteriaceaef_Methylobacteriaceaef_Spartobacteria_unclassifiedf_Pseudomonadaceaef_Xanthomonadaceaef_Aeromonadaceaef_Porphyromonadaceaef_Flavobacteriaceaef_Desulfovibrionaceaef_Moraxellaceaef_Fusobacteriaceaef_Vibrionaceae00.250.500.75MeanDecreaseGini*00.20.40.6Relative abundanceg_Lawsoniag_Acinetobacterg_Pseudomonasg_Brevinemag_Enterovibriog_Vibrionaceae_unclassifiedg_Cetobacteriumg_Grimontia6 5 4 3 2 1 0123456TCTC1076cd155453TC12ab1.22.43.61086log2(adj-P)lg(CPM/n)420AcidobacteriaBacteroidetesCandidatus_saccharibacteriaFusobacteriaPlanctomycetesProteobacteriaVerrucomicrobiaTenericutesSpirochaetesFirmicutesDeinococcus-thermusCyanobacteriaChloroflexiChlamydiae图 3 添加刺五加后吉富罗非鱼肠道微生物核心物种的影响Fig.3 Effect of A.senticosus supplementation on intestinal microorganisms core taxa of GIFT方形代表没有显著差异的OTUs,三角形代表显著上升或者下降的OTUs,不同颜色表示OTUs所属的门,图案的大小表示不同的相对丰度,虚线对应P值(FDR校正)显著性阈值0.05OTUs that has no significant difference are depicted as square.OTUs that are significantly enriched and depleted are depicted as triangle.Colors are used to denote the different taxonomic groups(Phylum level).The size of the pattern indicates different relative abundance.Thedashed line corresponds to the P value(FDR)threshold of significance(=0.05)1402水 生 生 物 学 报47 卷的动物更加容易受细菌感染,肠道免疫功能也更加薄弱36。因此,较高的多样性被认为是肠道微生物健康的重要标志。和对照组相比,饲料中添加刺五加后微生物多样性明显提升。通过斯皮尔曼相关性分析我们发现,肠道消化酶、肝脏SOD活性同Shannon指数和(或)Simpson指数显著正相关,TC、TG则和Observed_spieces显著负相关。综合这些结果,我们认为刺五加超微粉不仅可以促进机体生长和脂代谢,也可以提高肠道微生物多样性。与此同时,我们猜测,刺五加对机体生长和健康的促进作HeatmapTCab020406080100CTAmino acid metabolismBiosynthesis of other secondary metabolitesCarbohydrate metabolismEnergy metabolismEnzyme familiesGlycan biosynthesis and metabolismLipid metabolismMetabolism of cofactors and vitaminsMetabolism of other amino acidsMetabolism of terpenoids and polyketidesNucleotide metabolismXenobiotics biodegradation and metabolismFolding,sorting and degradationReplication and repairTranscriptionTranslationMembrane transportSignal transductionSignaling molecules and interactionCell growth and deathCell motilityTransport and catabolismCancersCardiovascular diseasesImmune system diseasesInfectious diseasesMetabolic diseasesNeurodegenerative diseasesCirculatory systemDigestive systemEndocrine systemEnvironmental adaptationExcretory systemImmune systemNervous systemCellular processes and signalingGenetic information processingMetabolismPoorly characterized0426Relative abundance(%)81012MetabolismGenetic information processingEnvironmental information processingHuman diseasesCellular processesOrganismal systemsUnclassified*图 4 添加刺五加后吉富罗非鱼肠道微生物功能的影响Fig.4 Effect of A.senticosus supplementation on intestinal microorganisms function of GIFT9 期李全杰等:饲料中添加刺五加对吉富罗非鱼脂质沉积、抗氧化能力及肠道消化酶和微生物的影响1403用,在一定程度上有可能是通过影响肠道菌群组成和其代谢产物达成的,这也是我们进一步研究的重点。在门水平上,占绝对优势的菌门是变形菌门(Proteobacte