蓖麻根腐病抗性鉴定及其SSR标记的初步建立.pdf

.():/.:./.刘海燕 陆建农 殷学贵 等.蓖麻根腐病抗性鉴定及其 标记的初步建立.广西植物():.():.蓖麻根腐病抗性鉴定及其 标记的初步建立刘海燕 陆建农 殷学贵 顾帅磊 谢 钰 张柳琴黄冠荣 刘朝裕 张肖肖 左金鹰(广东海洋大学 滨海农业学院 广东 湛江 )摘 要:蓖麻根腐病是茄腐镰孢菌()引起的根部病害严重影响蓖麻产量 抗源缺乏制约了抗病品种的选育 为寻找抗病种质、建立抗性分子标记该研究对 份蓖麻材料的抗性进行了表型和分子标记鉴定 结果表明:()浓度为 个的孢子悬浮液灌根是一种有效的接种方法以接种后枯萎天数为基础的 级评价法可作为鉴定标准()鉴定出 份抗病材料其中高抗为 份()野生材料中抗病材料比率()远高于栽培材料()建议将野生材料尤其是中国华南野生材料的研究利用作为今后抗病育种的重要方向()初步建立了 个与抗性关联的 标记 该研究结果提供了有效的根腐病抗性鉴定方法和评价标准筛选出了一批育种迫切需要的抗病基因资源初步建立了可用于辅助选择的 标记为蓖麻抗根腐病育种奠定了重要基础关键词:蓖麻 根腐病 抗病性鉴定 茄腐镰孢菌 孢子悬浮液 中图分类号:文献标识码:文章编号:()():.:().收稿日期:基金项目:广东省科技计划项目()第一作者:刘海燕()硕士研究生研究方向为作物遗传育种().通信作者:殷学贵博士教授硕士研究生导师研究方向为蓖麻种质资源与遗传育种().().()()().().:蓖麻()属于大戟科蓖麻属植物一年生草本或多年生草质木本是重要的工业用油作物 蓖麻的主要经济价值在于蓖麻油 由于独特的理化性质蓖麻油广泛应用于航空航天、机械制造、医药化工、纺织印染等领域(.)随着经济的发展国内外对蓖麻油的需求持续增加市场供不应求 然而由于缺乏高产抗病品种近十几年来我国蓖麻种植面积持续减少蓖麻籽进口依赖率持续高达以上蓖麻病害种类繁多中国报道的有 多种(汤健蓉等)国外报道的有 多种(.)其中枯萎病是最主要的病害其病原菌为尖孢镰刀菌蓖麻专化型(.)目前枯萎病还没有统一的鉴定方法和评价标准 国外常用的接种方法有浸根法(.)、病盆法(.)、灌 根 法(.)和浸种法(.)浸根法和病盆法工作量大且繁琐不适合大批量鉴定浸种法虽然操作简单但接种感染率低其可靠性还有待验证(.)灌根法操作简单只要选择适宜的菌液浓度即可模拟大田发病条件对材料作出客观评价 国内根据茎叶病斑大小及数量将枯萎病抗性划分为 共 个等级(沙洪林等刘伟等)国外主要根据发病率(.)、死亡天数(.)和枯萎天数(.)进行抗性评价随着蓖麻在华南地区种植面积的增加发病程度也日趋严重平均发病率为 严重的地块超过 甚至全田死亡 经采样分离和基因组测序鉴定证明最主要的病害是根腐病病原菌为茄腐镰孢菌()(.)除病原菌不同之外根腐病发病症状与枯萎病完全相同均表现为根部维管组织变黑、叶片萎蔫、最后整株枯萎、根系腐烂而死亡 目前尚无根腐病抗性鉴定方法、评价标准和抗性种质资源筛选方面的研究报道蓖麻是一个遗传多样性很低的物种(.)近 年 来 等()将目光投向了野生材料证明野生材料的遗传多样性高于栽培材料而中国华南野生材料的遗传多样性又高于已报道的其他蓖麻群体(汪亚菲等 .杨婷等)其中中国广东的材料遗传多样性最高其次是中国广西中国海南的最低(汪亚菲等 .)这意味着野生蓖麻材料尤其是中国华南野生蓖麻材料中可能蕴藏着更多的抗性材料本研究以 份蓖麻材料为对象通过对其进行表型和分子标记鉴定拟探讨以下问题:()期刘海燕等:蓖麻根腐病抗性鉴定及其 标记的初步建立蓖麻根腐病抗性鉴定的有效方法和标准()对野生材料尤其是中国华南野生材料的育种价值作出科学评价筛选出一批育种急需的抗病资源()建立可用于辅助选择的分子标记为蓖麻抗根腐病育种奠定重要基础材料与方法.试验材料.蓖麻材料供试材料由 部分组成:一是广东海洋大学蓖麻课题组提供的 份自交系和杂交种二是来自 个国家 个地区的 份自交系、杂交种和少量野生材料三是 份中国华南野生材料.供 试 菌 株 供 试 菌 株 为 茄 腐 镰 孢 菌()由广东海洋大学滨海农业学院植物病理研究室分离、保存和提供.材料的种植用.的次氯酸钠溶液浸泡种子 经自来水清洗后用 温水浸种 洗净后播种于盛有灭菌营养基质的育苗盘每穴播 粒种子 当幼苗四叶一心时进行人工接种 在接种后第 天选择规格一致的幼苗移栽到花盆中每盆 棵每个材料 盆.孢子悬浮液的制备及接种方法将试管保存的茄腐镰孢菌转接到 培养基上培养 打取直径.的菌饼接种到 培养基中扩繁 后加入无菌水刮取表面菌丝 层纱布过滤后用血球计数板在光学显微镜下计算分生孢子的数量用无菌水将孢子浓度调至 个 四叶一心时采用灌根法接种即在每株幼苗根际周围的基质中注射 孢子悬浮液 接种后的材料置于温室内培养温度 、相对湿度 自然光照明.抗病性鉴定采用接种后的枯萎天数和发病率作为评价指标只要有枯萎就算发病 接种后每天调查不同材料的发病时间、发病株数并计算发病率和抗病材料比率直至无新的发病株出现(本试验为)才停止调查抗性评价标准:级(高抗)以上 级(中抗)级 级 级 发病率()(发病株数/调查株数)抗病材料比率()(级材料数 级材料数)/材料总数 .抗病性分子标记的建立.基因组 的提取与检测采用改良的 法()提取基因组 用的琼脂糖凝胶电泳检测 的完整性用 仪器检测 的质量和浓度统一稀释至 后 保存备用.多态性引物的筛选先构建极端抗、感材料的 混池用于筛选多态性引物 再用小群体抗、感个体验证筛选出的多态性引物并对非多态性引物进行再次筛选以防多态性引物的遗漏.扩增及产物鉴定使用 的反应体系包括模板 ()、引物 ()、(、.、聚合酶.、.)、扩增程序:预变性 变性 复性 延伸 共 个循环 终延伸 保存 扩增在()型 仪进行 扩增产物用 非变性聚丙烯酰胺凝胶分离 恒压电泳分离.银染、水洗、显影后读带.基因型数据的读取 采用、数据记录电泳分离结果在相同位置上有带记为 无带记为.相关回归分析 参照单标记定位原理(翟虎渠和王健康)对 份材料作抗性和分子标记间的回归分析若回归关系显著则为抗病分子标记 用 .统计分析软件处理相关数据结果与分析.菌株的培养和孢子悬浮液的制备培养基上菌株长势良好(图:)光学显微镜下分生孢子形态正常(图:)经镜检孢子浓度为 个.抗病性鉴定不同材料的发病率存在明显差异(表)最低的为 有 份材料均为高抗最高的为有 份材料发病最快均为高感表明发病条件充分、抗性鉴定结果可靠(图)广 西 植 物 卷.菌落正面.菌落背面.分生孢子 标尺.图 茄腐镰孢菌的菌落及显微形态图.(接种后第 天).(接种后第 天)./(接种后第 天)./(接种后第 天).().()./()./().图 蓖麻材料的根腐病发病症状.期刘海燕等:蓖麻根腐病抗性鉴定及其 标记的初步建立 份材料中抗性从 到 级分别有 份()、份()、份()、份()和 份()(图)抗病材料比率为 抗病材料中中国华南野生材料占(表)野生材料的抗病材料比率()明显高于栽培材料()其中中国华南野生材料为 非洲野生材料为 份栽培材料中来自中国广东海洋大学、中国云南、以色列、印度和法国的材料抗病比例分别为、和(表)图 不同抗性等级蓖麻材料所占比例.不同来源的材料中各抗性级别的材料比例有较大差异(表)中国广东海洋大学材料中最抗()和最感材料()的比例均较高可能与所用的亲本有关 其亲本一类是中国华南野生材料另外一类是农艺性状较好但抗病性较差的国内栽培材料中国云南材料中高抗材料比例()较高可能是因为云南蓖麻资源本身很丰富另外可能与东南亚热带种质资源的利用有关发病率和抗病等级基本呈一致趋势(表)份高抗材料的发病率均为 抗性 级的材料虽然同一等级下发病率变化范围较大但总的趋势是等级越高发病率越高反之亦然另外越是感病材料发病率变化范围也越大 级的材料发病率变化范围分别为 以内、.抗病分子标记的建立.的提取琼脂糖凝胶电泳显示条带无明显拖尾现象/比值在.之间这说明 提取质量较好可用于 扩增.多态性引物的筛选从 对带型清晰、多态性好的引物中筛选出 对多态性 引物用于 份材料的基因组扫描(图).分子标记.样品编号.图 引物 扩增图谱.抗病标记的确定 对多态性引物共扩增出 个等位变异每对引物可检测到 个平均为.个 对 引物与抗病性之间的相 关 性 显 著 或 极 显 著 它 们 是、和(表)抗病性分别与这 对引物扩增出的 条带之间回归关系显著或极显著(表)是可能的抗病分子标记按单个标记统计携带以上 个标记的材料中抗病 材 料 比 率 分 别 为.、.、.、.、.、.、.和.其中 级材料比率分别为.、.、.、.、.、.、.和.(表)只携带单一标记的抗病材料占材料总数的.(表)反映了携带标记材料的整体抗病趋势不同抗病材料携带的标记种类和数目不尽相同(表)反映了蓖麻根腐病抗性遗传机制的复广 西 植 物 卷表 份蓖麻材料抗根腐病鉴定结果 材料来源份数抗性级别发病率()材料来源份数抗性级别发病率()中国华南野生 中国广东海洋大学 中国云南 埃塞俄比亚以色列泰国刚果(布)印度哈萨克斯坦缅甸莫桑比克中国台湾 法国中国山东 中国山西 菲律宾中国新疆 表 不同发病率下各级别材料所占比率 发病率()总数 级 ()级 ()级 ()级 ()注:为材料数目 为比率 下同:.期刘海燕等:蓖麻根腐病抗性鉴定及其 标记的初步建立表 对 引物信息 引物正向引物序列()()反向引物序列()()退火温度 ().表 与抗病性关联的分子标记 标记皮尔逊相关系数回归显著性回归方程.注:表示.表示.:.杂性 不同抗病材料携带的抗病标记数为 个随着标记数的增加 抗病材料比率呈现先升后降的趋势 大部分抗病材料携带 个标记 但是携带 个标记的材料其抗病材料比率并非最高携带不同标记的材料中都有一些材料表现感病(表)甚至不含抗病标记的材料也有表现抗病的(表)这可能是某些抗病基因之间存在负向互作及标记与抗病基因之间交换重组所致有待进一步研究讨论与结论目前国内外尚无蓖麻根腐病统一的鉴定方法和评价标准 等()和 等()的研究结果表明在蓖麻枯萎病的抗性鉴定中采用孢子悬浮液灌根接种法更接近于大田发病条件其抗性评价结果更为客观 本研究参考枯萎病鉴定的经验形成了根腐病的鉴定方法即孢子浓度为个的孢子悬浮液灌根接种以接种后的枯萎天数划分抗性等级 此法创造了充分的发病条件对材料抗性作出了客观评价这一结果与 等()的研究结果相似 本研究还证明了枯萎天数与发病率的一致性因此建议后续在对大批量材料进行鉴定时可以把枯萎天数作为评价标准在对重点材料进行深入鉴定时除枯萎天数外还可将发病率作为参考标准目前国内外尚无蓖麻根腐病抗性种质筛选的报道 因此本研究筛选出的 份抗病材料(包含 份高抗)为抗根腐病育种提供了一批急需的基因资源这将扭转抗源缺乏的被动局面为抗病育种迈出了坚实的一步 野生材料的抗病材料比率()远高于栽培材料()这可能是因为野生材料保留了更高的遗传多样性蕴含着更 多 的 抗 性 基 因(毕 川 等 .范伟等 陆建军等)中国华南野生材料的抗病材料比率()高于整个野生材料群体这与它们具有更高的遗传多样性密切相关(汪亚菲等 .杨婷等)而且根腐病作为华南地区的主要病害与该地区特有的自然气候土壤条件密不可分由于长期的自然选择使中国华南野生材料进化出了相应的防御机制因此表现出较高的抗性 基于野生材料具有较高的遗传多样性和抗根腐病比率可能在枯萎病和灰霉病等其他主要病害中也表现出较高的抗性 因此野生材料不失为一个研究切入点建议在今后的抗病育种中可以加强野生材料尤其是中国华南野生材料的研究和利用本研究采用的引物筛选方法 既避免了多态广 西 植 物 卷表 携带不同标记的材料数及其比率 标记总数()级 ()级 ()级 ()级 ()级 ().表 抗病标记数目与抗病材料比率间的关系 标记数目 总数()级 ()级 ()级 ()级 ()级 ().性引物的遗漏又大大减轻了工作量在后续研究中 可以采用此法对自然群体进行引物筛选 虽然限于单标记定位法本身的局限性以及多态性引物数量、标记与基因间的遗传距离等原因建立的这 个抗病标记仍有待进一步研究但这些标记可以用于大批量材料根腐病抗性的辅助选择 建议后续可以把这些标记作为候选的抗病基因进行深入研究为基因挖掘和分子育种奠定重要基础综上所述本研究为蓖麻根腐病抗性鉴定提供了有效的方法和评价标准为育种提供了一批急需的抗病基因资源提出野生材料尤其是中国华南野生材料的研究利用是今后抗病育种的重要方向初步建立了抗根腐病 分子标记为蓖麻抗根腐病的基因挖掘和分子育种奠定了重要基础参考文献:.(.).():.(.).():.期刘海燕等:蓖麻根腐病抗性鉴定及其 标记的初步建立.(.).():.:.毕川.蓖麻亲缘关系与配合力分析及遗传图谱构建.湛江:广东海洋大学:.():.():.():.().:.范伟.基于全基因组重测序的蓖麻()群体遗传分析.北京:中国农业科学院:.(.).:.():.刘伟 冷廷瑞 张云万 等.蓖麻枯萎病药剂防治的初步研究.吉林农业科学():.:.陆建军.蓖麻重要农艺性状关联分析及野生种基因组组装.武汉:中国科学院大学(中国科学院武汉植物园):.(.)().():.():.():.沙洪林 薛丽静 金哲宇 等.蓖麻枯萎病抗病性鉴定方法及抗病资源筛选研究.吉林农业科学():.():.(.).():.():.(.).:.汤健蓉.湛江地区蓖麻真菌性病害病原鉴定.湛江:广东海洋大学:.():.汪亚菲陆建农 施玉珍 等.基于 标记的华南野生蓖麻遗 传 多 样 性 分 析.分 子 植 物 育 种 ():.():.():.():.杨婷 陆建农 张丹 等.华南野生蓖麻种质资源的分类与评价.中国油料作物学报():.:.翟虎渠 王健康.应用数量遗传学.北京:中国农业科学技术出版社:.():.(责任编辑 邓斯丽 王登惠)广 西 植 物 卷