苍耳子散治疗季节性变应性鼻炎的药理实验与作用机制研究变应性鼻炎.pdf

基金项目：国家重点研发计划资助项目（）；第六批国家老中医药专家学术经验继承项目（）作者简介：王宇婷（），女，硕士，医师，研究方向：中医治疗耳鼻喉科疾病，：通信作者：王嘉玺（），男，本科，主任医师，研究方向：中西医结合治疗耳鼻喉科疾病，：苍耳子散治疗季节性变应性鼻炎的药理实验与作用机制研究变应性鼻炎王宇婷李金飞徐文龙刘荟菁王嘉玺（北京中医药大学东方医院，北京，；北京中医药大学东直门医院通州院区，北京，；大兴区妇幼保健院，北京，）摘要目的：基于网络药理学方法分析苍耳子散治疗季节性变应性鼻炎的作用机制，为经典方剂临床拓展运用及疗效评价提供参考。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（）获取苍耳子、辛夷、白芷、川芎的主要化学成分及其靶点，根据毒药物动力学（）筛选中药活性组分，并应用网络图像化软件 构建苍耳子散活性成分及作用靶点网络；通过人类基因信息数据库（）获取季节性变应性鼻炎相关靶点；应用 构建蛋白质 蛋白质相互作用（）网络，将网络提取的关键靶点提交至 数据库，分析其参与的生物过程。将药物靶点与疾病靶点取交集基因后，利用注释、可视化和富集分子功能数据库（）进行基因本体（）富集分析和京都基因与基因组百科全书（）通路富集分析，构建“成分 靶点 通路”网络。通过构建卵清蛋白（）大鼠变应性鼻炎模型对筛选的靶点应用酶联免疫吸附试验（）进行验证。结果：苍耳子散治疗季节性变应性鼻炎的核心的活性成分为柚皮苷、谷甾醇、木犀草素等，核心靶点有前列腺素内过氧化物合酶（）、磷脂酰肌醇 激酶 催化亚基（）、蛋白激酶 （）、肿瘤坏死因子（）、肾上腺素受体（）、表皮生长因子受体（）、白细胞介素 （）等。苍耳子散治疗季节性变应性鼻炎的生物学通路主要作用于钙信号通路、缺氧诱导因子 （）信号通路、样受体信号通路、信号通路等，其功能主要为调节炎症反应及免疫相关细胞因子的表达等。动物实验结果显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清 、表达均显著上调（），同时 干扰素（）表达显著下调（）；与模型对照组比较，苍耳子散组大鼠血清 、表达显著下调（），同时 表达显著上调（）。结论：本研究通过网络药理学方法分析发现苍耳子散通过多靶点、多通路治疗季节性变应性鼻炎，并利用变应性鼻炎大鼠模型初步验证 、的表达在苍耳子散治疗后明显降低，表明其可能是苍耳子散治疗季节性变应性鼻炎的关键靶点。关键词苍耳子散；季节性变应性鼻炎；网络药理学；活性成分；靶点；生物过程；信号通路；炎症反应 ，（，；，；，）：，（），（）（），（）（）（），“”（）（）：，世界中医药 年 月第 卷第 期 ，（），（）（），（），（）：，；中图分类号：；文献标识码：季节性变应性鼻炎（，）是 介导的型变态反应，表现为季节性反复发作的鼻塞、喷嚏、流清涕等症状，为临床常见病。发病率与空气中 浓度正相关 。治疗方面，中医药在延缓发作频率和减少发作症状上有独特的优势 。苍耳子散作为中医治疗 的传统经典名方，其作用机制值得深入挖掘与研究。中药复方的作用机制具有多靶点、多层次、范围广的优势。网络药理学是基于多学科理论基础，除医学、生物学外，包括计算机科学、生物信息学等，并整合多种研究手段而形成的研究方法 。应用网络药理学对中药复方作用机制进行研究，有助于揭示中药复方科学内涵、发现作用靶点、为实验验证中药复方治疗的靶点提供方向。资料与方法 苍耳子散相关靶点基因筛选在中药系统药理学数据库与分析平台（，）中，设置口服生物利用度（，）、类药性（，），对化合物在动物体内的毒药物动力学特征 吸收、分布、代谢和排泄（，）进行初筛，查找味中药活性成分 。为标准化蛋白质靶点信息，统一在 数据库（：）对化合物作用的蛋白质靶点进行规范。同时根据已发表的文献报告补充未预测到的活性化合物的已知靶点。苍耳子散药物活性成分与靶点网络构建应用 图像化软件对生物活性成分及作用靶点进行相关网络构建，其中用“节点（）”表示苍耳子散药物组成、活性成分、作用靶点，用“边（）”表示节点之间的关系 。同时应用相关插件进行网络特征分析，以明确苍耳子散中关键活性成分和作用靶点，最终目的为结合文献分析其中的相互作用。相关靶基因筛选以“”“”为关键词在人类基因信息数据库（，：，）中筛选 相关作用靶点。并根据经验设定 大于中位数的目标靶点为 的潜在靶点。苍耳子散活性成分 靶点蛋白质 蛋白质相互作用（，）网络构建通过 数据的构建与挖掘，建立靶点的直接、间接调控作用关系网络，从而更清晰地呈现药物活性成分与靶点间的结合形式及重要节点的挖掘。为探究苍耳子散组方相关靶点与 靶点间的相互作用，首先应用 中 插件分别对 组靶点进行 网络构建，将生物种类设定为“”，身份识别导出类型设定为“”，其余设置均为默认设置，得到 网络之后应用 工具对 组 进行融合构建 网络。通过网络拓扑分析插件 并结合相关文献，连接度中心性（，）、介度中心性（，）、紧密中心性（，）、网络中心性（，）和局部边连通性（，）等指标进行筛选，其中 值大于所有节点 值中位数 倍的节点为网络中的重要节点（）。再筛选其他几个指标中大于中位数的节点，即关键靶点。将关键靶点提交至 数据库（：）构建 网络模型，分析其参与的生物过程，并对其功能进行描 ，述 。相关靶点生物学功能与信号通路的富集分析将苍耳子散活性成分靶点与 靶点取交集，并通过 语言绘制韦恩图，得到共同靶点 个。应用可视化和富集分子功能（，）数据库（：）进行基因本体（，）富集分析，功能注释聚类以及 和京都基因和基因组百科全书（，）通路映射 。将 个靶基因输入列表，标识选择“”进行分析，得到数据结果并进行可视化处理。苍耳子散活性成分 靶点 信号通路网络图构建运用 构建苍耳子散活性成分 靶点 信号通路网络图，利用 分析活性成分及靶点的网络拓扑参数，包括 、等进一步分析得到核心靶点及主要活性成分。动物实验验证 动物 无特定病原体（，）级 大鼠 只，雄性，周龄，体质量 ，购自北京维通利华实验动物科技有限公司，许可证号：（京），饲养于北京中医药大学东方医院实验动物中心屏障动物饲养室。饲养环境：大鼠按照组别分笼饲养，房间内每隔 进行明暗交替，室内温度保持在 ，相对湿度 ，自由饮水和进食。适应性饲养。本研究通过伦理委员会审批（伦理审批号：）。药物苍耳子散颗粒剂组成：苍耳子 、辛夷 、白芷 、薄荷 。购自北京康仁堂药业有限公司并提供质量控制检测，使用前采用沸水溶开至浓度 ，以便后续灌胃使用。试剂与仪器 酶联免疫吸附试验（，）试剂盒（上海抚生实业有限公司，货号：）；白细胞介素（，）试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司，货号：）；干扰素（，）试剂盒（上海联祖生物科技有限公司，货号：）；前列腺素内过氧化物合酶（，）试剂盒（上海沪震生物科技有限公司，货号：）；试剂盒（上海优科唯生物科技有限公司，货号：）；蛋白激酶 （，）试剂盒（博尔森科技有限公司，货号：）；氢氧化铝（上海麦克林生化科技有限公司，货号：）。低温离心机（安徽科大中佳，型号：）；酶标仪（赛默飞世尔科技公司，型号：）；恒温水浴锅（常州朗越仪器制造有限公司，型号：）；电子天平（常州奥豪斯仪器有限公司，型号：）。方法 分组与模型制备分组：正常对照组、模型对照组及苍耳子散组，每组 只。模型制备：按文献 造模方法制备变应性鼻炎 大鼠模型，共 只。基础致敏阶段：以 卵清蛋白（，）作为抗原，氢氧化铝粉末作为佐剂，混悬于 氯化钠溶液中，作为致敏剂。采用腹腔注射法，每只大鼠 ，隔日 次，共进行 次基础致敏，用时 。正常对照组大鼠腹腔注射等容积的生理盐水。局部刺激阶段：第 天，采用滴鼻法，以 生理盐水溶液滴入大鼠两侧鼻孔，每侧 ，次 ，正常对照组大鼠以等容积的生理盐水进行滴鼻。大鼠鼻部行为学症状总评分大于 分为变应性鼻炎模型制备成功。给药方法苍耳子散组给予苍耳子散颗粒 灌胃，模型对照组和正常对照组大鼠灌胃给予等容积的生理盐水。次 ，共灌胃 。检测指标与方法末次给药 后，用 水合氯醛麻醉，腹主动脉取血 ，在离心管中静置 后，于 离心机中离心 ，离心半径为 ，收集血清，于 冰箱中储存备用。检测前取出，室温环境下放置 后按照 试剂盒说明书要求进行处理，检测大鼠血清中 、含量。统计学方法采用 统计软件进行数据分析，其中计量资料以均数 标准差（珋 ）表示，组间比较采用单因素方差分析，以 为差异有统计学意义。结果 苍耳子散组方活性成分初步筛选共提取苍耳子化学成分 个、辛夷化学成分 个、白芷化学成分 个、薄荷化学成分 个，对 特征筛选后共获得苍耳子活性成分 个、辛夷活性成分 个、白芷活性成分 个、薄荷活性成分 个。见表 。苍耳子作用靶点 个、辛夷作用靶点 个、白芷作用靶点 个、薄荷作用靶点 个，合并后删除重复值共得到靶点 个。世界中医药 年 月第 卷第 期表 苍耳子散活性成分药物分子编码标记分子名称口服生物利用度（）类药性苍耳子 苍耳子 （，）（，），苍耳子 苍耳子 苍耳子 （，）（），苍耳子 苍耳子 苍耳子 辛夷 辛夷 （，）（，），辛夷 （，）（，），辛夷 辛夷 辛夷 辛夷 辛夷 （，）（，），辛夷 辛夷 辛夷 辛夷 （，），（，），辛夷 辛夷 辛夷 白芷 白芷 白芷 白芷 续表 苍耳子散活性成分药物分子编码标记分子名称口服生物利用度（）类药性白芷 白芷 （）白芷 白芷 （）白芷 白芷 （），白芷 白芷 白芷 白芷 白芷 白芷 白芷 白芷 ，白芷 ，白芷 薄荷 薄荷 薄荷 薄荷 薄荷 薄荷 薄荷 薄荷 薄荷 苍耳子散治疗相关靶点预测与活性成分 靶点网络构建利用网络图形化工具 对上述生物活性成分及预测的作用靶点进行关系网络绘制和分析，得出节点共 个，边共 条。通过网络拓扑分析确定苍耳子散发挥作用的生物活性成分主要为尼迪林（）、异二氢呋喃醌 （）、加尔格雷芬（）、木犀草素（）、腺苷醇 （）、谷甾醇（）等，主要作用靶点为 、肾上腺素受体（，）、等。见图 。相关靶点筛选从 数据库获得 靶点 个。根据经验设定 大于中位数 的目标靶点为 的潜在靶点，最终得到 个 相关关键基因。构建苍耳子散治疗 的 网络及获取核 ，心靶点对药物靶点进行 网络构建得到 个节点，条边，对疾病靶点进行 网络构建得到 个节点，条边。将结果应用 工具进行融合构建 网络，得到 个节点、条边的融合网络（）。通过网络拓扑分析插件 分析得到结果，设定 值 倍中位数，筛选得到核心网络。通过设定网络中 、及 中位数的节点得到 核 心 作 用 靶 点。见 图 。核 心 靶 点 输 入 数据库中再进行 网络构建，分析其参与的生物过程并进行基因本体（，）功能描述。见表 。相关靶点生物学功能与信号通路的富集分析首先将苍耳子散活性成分靶点与 靶点取交集，得到共同靶点 个。见图 。应用 数据库进行基因注释富集分析，功能注释聚类以及 通路映射。结果可见多个靶点的功能与炎症介质及氧化应激有关。其中苍耳子散治疗 主要参与的生物过程包括基因表达的负调控（）、对缺氧的反应（）、内皮细胞增殖的正调控（）、图 苍耳子散活性成分与靶点网络图 苍耳子散治疗 的 网络构建与关键靶点筛选流程表 苍耳子散 靶点 网络功能描述基因本体名称描述 ：代谢过程（）：基因表达的负调控（）：核酸代谢过程（）：调控基因表达（）：含核碱基的化合物代谢过程（）世界中医药 年 月第 卷第 期图 苍耳子散成分 靶点韦恩图胞外信号调节激酶（，）和 级联的负调控（）、肿瘤坏死因子产生的负调控（）、前列腺素的生物合成过程（）、炎症反应（）等。相关靶点调节 的功能主要富集于血红素结合（）、前列腺素 内过氧化物合酶活性（）、双加氧酶活性（）、一氧化氮合酶调节剂的活性（）、过氧化物酶活性（）等。参与的信号通路包括钙信号通路、缺氧诱导因子 （，）信号通路、样受体信号通路、活化蛋白激酶（，）信号通路、肿瘤坏死因子（，）信号通路、血管内皮生 长 因 子（，）信号通路、叉头盒 （，）信号通路等。见表 ，图 。表 苍耳子散治疗 靶点通路富集结果名称靶点靶点数值 ，（），（），（），图 苍耳子散治疗 靶点的 分析 ，图 苍耳子散治疗 靶点的 分析 苍耳子散活性成分 靶点 信号通路网络图构建运用 构建苍耳子散活性成分 靶点 关键信号通路网络图。见图 。应用 内置的 插件分析网络拓扑学参数，得到核心的活性成分及核心作用靶点。结果提示前 位活性成分如下：柚皮苷、谷甾醇、木犀草素、阿沙西汀及芦荟大黄素，活性成分相关的 、及 。见表 。图 苍耳子散成分 靶点 通路网络 在网络中的 为 ，为 ，为 ，预测 为苍耳子散治疗变表 苍耳子散主要活性成分网络节点特征参数成分编码名称 柚皮苷 谷甾醇 木犀草素 阿沙西汀 芦荟大黄素 应 性 鼻 炎 最 主 要 靶 点。、表皮生长因子受体（，）、亦为相对重要的靶点。见表 。苍耳子散对大鼠血清中 、表达量的影响模型对照组大鼠血清中 、的含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（），苍耳子散组大鼠血清中 、水平均明显低于模型对照组，差异有统计学意义（）；与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清中 含量明显降低，差异有统计学意义（），苍耳子散组大鼠血清中 较模型对照组升高，差异有统计学意义（）。见表 。讨论 属于中医学“鼻鼽”范畴，是临床常见病，如治疗不及时可出现鼻息肉及哮喘等疾病。中药复方在预防及治疗季节性发作方面有独特优势，尤其在改善鼻塞、流涕等症状方面拥有极大潜力。孙珊等 通过干祖望脱敏汤合苍耳子散治疗 临床观察中发现纯中医组、纯西医组、中西医结合组均为治疗 有效方法，中西医结合组远期疗效更优，证属风邪所致者均可本方加减治疗。牛银花和侯红枝 通过玉屏风合苍耳子散治疗持续性肺气虚型 发现，玉屏风和苍耳子散能够调节患者体内表 苍耳子主要活性成分靶点网络节点特征参数靶点 靶点 表 各组大鼠血清中 、的表达比较（珋 ，）组别 正常对照组 模型对照组 苍耳子散组 注：与正常对照组比较，；与模型对照组比较，世界中医药 年 月第 卷第 期 细胞因子失衡状态，缓解患者鼻黏膜炎症反应，从而改善患者症状表现。王龙妹等 发现，苍耳子水煎液对细胞免疫作用明显。另外，在 豚鼠模型研究中发现，苍耳子水提取物可以改善 豚鼠的过敏性症状，同时减轻 豚鼠鼻黏膜的病理改变，降低血清中 水平，升高 的水平，从而调节 细胞因子平衡，降低血清 水平，发挥疗效 。在临床研究中发现肺气失宣为鼻鼽主要病机，诸病源候论鼻病诸侯 载：“肺气通于鼻，其脏有冷，冷随气入乘于鼻，故使津涕不能自收。”故中医认为鼻鼽多因体虚卫表不固，风寒乘虚而入，上犯鼻窍，肺气失宣，津液内停，鼻窍壅塞，遂致鼻塞、喷嚏、流清涕 。另有研究认为本病多分为以下 个证型：肺气虚寒，卫表不固；脾气虚弱，清阳不升；肾阳不足，温煦失职；肺经伏热，上犯鼻窍 。其中以肺气虚寒为常见证型，治疗原则以温肺散寒、疏风通窍为主。苍耳子散出自 严氏济生方，为治疗鼻科疾病的经典方剂，文中所述：“辛夷仁半两，苍耳子两钱半，香白芷一两，薄荷叶半钱，上晒干，为细末，每服两钱，食后用葱、茶清调下。”现代则多以汤剂葱茶调服。方中苍耳子、辛夷发散风寒，通鼻窍，苍耳子兼祛风湿；白芷祛风、燥湿、消肿、止痛。薄荷性味辛凉，疏散风热，清利头目，防止辛温药助阳太过。组方主治肺气虚寒证的鼻鼽患者，亦可配伍健脾益肾，或清热凉血药治疗其他证型的患者，发挥其疏风通窍的功效。本研究应用网络药理学的方法对苍耳子散治疗 的关键活性成分进行分析，提示主要活性成分为柚皮苷、谷甾醇、木犀草素等。相关实验基础研究表明，柚皮苷腹腔注射能显著抑制 致敏模型小鼠的气道高反应性和气道重塑，抑制支气管肺泡灌洗液（，）中 、水平升高及核因子 （，）的活化 。谷甾醇是一种天然植物，具有抗炎活性，能够显著抑制 、诱导型一氧化氮合酶（，）和环氧合酶 （，）等炎症介质的表达，并下调抗炎细胞因子（）的表达。同时抑制 激活和 促分裂原活化的蛋白激酶（，）的表达 。在细 胞 实 验 研 究 中 发 现 木 犀 草 素 通 过 和 信号通路抑制 刺激的肥大细胞中 的产生，抑制炎症反应相关通路 和 的活化 。本研究结果表明，苍耳子散治疗 的靶点主要集中在 ，而 、亦为重要的调节靶点。是生物活性脂类调节物包括前列腺素、血栓烷和前列环素等各家族的前体。和 都是膜整合蛋白。人 基因则被定位于 ，约为 大小，包含 个外显子和 个内含子，且外显子 显著大于外显子 ，包含 编码区和全长为 的 非翻译区。前列腺素（，）的形成高度依赖于这些细胞中 的表达。通过 通路能够诱导 的产生，其作用机制为 增加了 基因的转录。另一方面，抑制 和蛋白质的表达，以及类前列腺素的产生 。通过对药物和疾病融合后的关键网络进行 功能富集分析显示，苍耳子散能够通过调控 代谢过程、调控基因表达、核酸代谢过程、含核碱基的化合物代谢过程对 发挥作用。在对相关通路富集分析研究中发现苍耳子散调治 中，重要的通路包括钙信号通、信号通路、样受体信号通路、信号通路、信号通路、信号通路、信号通路等。直接介导 和 的转录，从而诱导血管通透性和炎症反 应，抑 制 改 善 了 气 道 中 的 过 敏 表型 。此外，抑制后，气道高反应性显著降低 。样受体信号通路与 的研究亦发现，引起 的 样受体 （，）主要为 、及 ，是 下游信号转导通路，以 和 组成的二聚体形式发挥作用，激活核内相关转录过程，使炎症反应细胞因子表达增多，促进大量炎症反应，同时诱导 表达细胞因子，导致 及 细胞因子失衡发生 。另外，我们通过 大鼠 模型进行靶点验证，研究发现苍耳子散可调节 相关介质 、的表达，且苍耳子散治疗后 、药物靶点的 表达较模型对照组均有显著差异。研究结果表明苍耳子散中各活性成分可对不同靶点进行调控，而各个关键靶点又可介导不同的生物过程与信号通路，其与中医药治疗疾病多靶点、多途径的作用特点不谋而合。在应用网络药理学分析中，我们初步探究了苍耳子散治疗 的调节网络，为临床运用提供了一定依据。本研究的不足之 ，处在于应通过实验进一步验证相关指标和靶点，为疗效评价提供指标，尽早服务于临床。利益冲突声明：无。参考文献 柴先奇，黄若葵，邓敏鑫 粤北地区过敏性鼻炎发病率与 相关性的临床研究 中国现代药物应用，（）：崔鲁佳，张丽，李金飞，等 刘大新教授治疗鼻鼽患者 例的中药频率分析 全科口腔医学（连续型电子期刊），（）：但文超，何庆勇，曲艺，等 基于网络药理学的枳术丸调治血脂异常的分子机制研究 世界科学技术 中医药现代化，（）：，：，：，：，：，（）：，：，（）：苗明三，项丽玲，苗艳艳 变应性鼻炎动物模型制备规范（草案）中草药，（）：孙珊，招敏娟，梁佩玲，等 干祖望脱敏汤合苍耳子散治疗变应性鼻炎临床观察 光明中医，（）：牛银花，侯红枝 玉屏风合苍耳子散治疗持续性肺气虚型变应性鼻炎疗效及对血清 细胞因子表达的影响 四川中医，（）：王龙妹，傅惠娣，周志兰 枸杞子、白术、细辛、苍耳子对白细胞介素 受体表达的影响 中国临床药学杂志，（）：夏召，张海新，许天启，等 苍耳子的化学成分研究 中国中药杂志，（）：谭丽，王玉芳 迟华基教授苍耳子散治疗鼻鼽的经验 中国中医药现代远程教育，（）：陈利，张燕平，刘小东，等 基于数据挖掘技术探讨李声岳治疗变应性鼻炎用药规律 贵阳中医学院学报，（）：李沛波，王永刚，吴灏，等 柚皮苷及其苷元柚皮素的呼吸系统药理作用研究概述 药学研究，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）（），：（收稿本文编辑：张晓辉）世界中医药 年 月第 卷第 期