JJF 1665-2017流式细胞仪校准规范-(高清原版）.pdf

中华人民共和国国家计量技术规范J J F1 6 6 52 0 1 7流式细胞仪校准规范C a l i b r a t i o nS p e c i f i c a t i o nf o rF l o wC y t o m e t e r s 2 0 1 7-1 1-2 0发布2 0 1 8-0 2-2 0实施国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布市场监管总局市场监管总局流式细胞仪校准规范C a l i b r a t i o nS p e c i f i c a t i o nf o rF l o wC y t o m e t e r sJ J F1 6 6 52 0 1 7 归 口 单 位:全国生物计量技术委员会 主要起草单位:中国计量科学研究院 参加起草单位:贝克曼库尔特商贸中国公司北京深迈瑞医疗电子技术研究院有限公司碧迪医疗器械(上海)有限公司 本规范委托全国生物计量技术委员会负责解释J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局本规范主要起草人:张 玲(中国计量科学研究院)刘瑛颖(中国计量科学研究院)隋志伟(中国计量科学研究院)参加起草人:潘 娜(贝克曼库尔特商贸中国公司)董丽芳(北京深迈瑞医疗电子技术研究院有限公司)宋志华 碧迪医疗器械(上海)有限公司J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局目 录引言()1 范围(1)2 引用文件(1)3 术语(1)3.1 等量可溶性荧光分子(1)4 概述(1)5 计量特性(1)5.1 分辨力(1)5.2 线性相关系数(1)5.3 检出限(1)5.4 漂移(1)5.5 重复性(1)5.6 示值误差(1)6 校准条件(2)6.1 环境条件(2)6.2 标准物质和校准设备(2)7 校准项目和校准方法(3)7.1 分辨力(3)7.2 线性相关系数(3)7.3 检出限(4)7.4 漂移(4)7.5 重复性(5)7.6 示值误差(5)8 校准结果表达(5)9 复校时间间隔(6)附录A 校准原始记录参考格式(7)附录B 校准证书内页推荐格式(9)附录C 示值误差校准不确定度评定示例(1 0)J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局引 言本规范主要参考了J J G1 0 6 12 0 1 0 液体颗粒计数器和医药行业标准Y Y/T0 5 8 82 0 0 5 流式细胞仪。本规范为首次发布。J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局流式细胞仪校准规范1 范围本规范适用于基于荧光检测原理的分析型流式细胞仪的校准。其他类型的流式细胞仪(以下简称仪器),可参照本规范执行。2 引用文件本规范引用了下列文件:J J F1 0 7 12 0 1 0 国家计量校准规范编写规则J J F1 2 6 5 生物计量术语及定义凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规范。3 术语J J F1 2 6 5定义的及以下术语和定义适用于本规范。3.1 等量可溶性荧光分子 m o l e c u l e so f e q u i v a l e n t s o l u b l e f l u o r o c h r o m e,ME S F颗粒发出的荧光信号强度相当的可溶性荧光素分子的物质的量浓度。用于表示颗粒发出的荧光信号强度。4 概述流式细胞仪由液流系统、光学系统、检测系统和分析系统四部分组成(见图1)。测量原理为鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束,与水平方向的激光束垂直相交,染色的细胞受激光照射后发出荧光或产生散射光,这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收,经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息,就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。5 计量特性5.1 分辨力5.2 线性相关系数5.3 检出限5.4 漂移5.5 重复性5.6 示值误差1J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局图1 流式细胞仪组成示意图6 校准条件6.1 环境条件实验室环境应当满足仪器厂家的安装要求:环境温度(1 53 0);相对湿度7 0%。6.2 标准物质和校准设备6.2.1 标准物质单一荧光强度的荧光微球标准物质;多重荧光强度混合荧光微球标准物质;计数荧光微球标准物质;淋巴细胞计数标准物质。校准时应采用有证标准物质,相对扩展不确定度不超过2 0%(k=2)。6.2.2 化学试剂去离子水(1 8.2Mc m,0.2 2m滤膜过滤);0.1m o l/L磷酸钠缓冲液p H(7.27.4)。6.2.3 校准设备移液器,量程(2 0 010 0 0)L,B级及以上。校准设备需经检定合格。2J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局7 校准项目和校准方法7.1 分辨力仪器经预热,进入正常工作状态。在装有0.5m L经过0.2 2m滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中,移取0.5m L单一荧光强度的荧光微球标准物质,充分混匀后上机实验。记录前向角散射光和4 8 8n m激发下两个荧光通道,包括绿色荧光(F I T C异硫氰酸荧光素)、橙红色荧光(P E藻红蛋白)。收集门内有效信号1 00 0 0个,按式(1)计算前向角散射光和两个荧光通道中校准微球峰宽的相对标准偏差(R S D),以表示分辨力。R S D=1 0 0%(1)式中:R S D 相对标准偏差,%;颗粒分布的标准差;颗粒分布的平均值。7.2 线性相关系数在装有1m L经过0.2 2m滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中加入2 0L多重荧光强度混合荧光微球标准物质,充分混匀后上机实验,记录4 8 8n m激发下绿色荧光(F I T C)、橙红色荧光(P E)通道信号。对试验结果进行直方图分析,荧光强度从低到高至少5种不同的荧光强度峰(峰的数量和强度取决于所采用的多重荧光强度水平标准微球标准物质),每个峰收集1 00 0 0个门内有效信号,得到每个峰的平均荧光强度。根据校准微球标准物质证书提供的各个峰的等量可溶性荧光分子(ME S F),将各峰的ME S F取对数l g(ME S F),简化表示为y,各峰测量的平均荧光强度取对数l g(F I T C)或l g(P E),简化表示为x,将两者线性回归得到方程y=k x+b,按式(2)分别计算两个通道的线性相关系数(r)。r=ni=1(xi-x)(yi-y)ni=1(xi-x)2ni=1(yi-y)2(2)式中:r 线性相关系数;xi 第i个峰的荧光强度的对数值;x 每个峰的荧光强度的对数值的平均值;yi 多重荧光强度混合微球标准物质中各个水平的荧光微球的ME S F的对数值;y 多重荧光强度混合微球标准物质中的荧光微球的ME S F的对数值的平均值;n 峰的个数。3J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局7.3 检出限针对绿色荧光(F I T C)和橙红色荧光(P E)荧光通道,采用方法7.2中得到的线性回归方程y=k x+b,按式(5)计算无荧光标记的空白微球的平均荧光强度值对应的ME S F即为荧光检出限(L O D)。线性回归方程的斜率k为:k=ni=1(xi-x)(yi-y)ni=1(xi-x)2(3)截距b为:b=y-kx(4)则检出限(L O D)的计算公式为:l g(L O D)=k x0+b(5)式中:L O D 检出限;xi 第i个峰的荧光强度的对数值;x 每个峰的荧光强度的对数值的平均值;x0 无荧光标记的空白微球的测得的荧光强度的对数值;yi 多重荧光强度混合微球标准物质中各个水平的荧光微球的ME S F的对数值;y 多重荧光强度混合微球标准物质中的荧光微球的ME S F的对数值的平均值;n 峰的个数;k 线性回归方程的斜率;b 线性回归方程的截距。7.4 漂移将周围环境温度控制在允许范围(设定温度3)内,在装有1m L经过0.2 2m滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中,加入数滴单色荧光微球标准物质,充分混匀后上机试验,记录前向角散射光和4 8 8n m激发下绿色荧光(F I T C)、橙红色荧光(P E)通道的信号,收集1 00 0 0个以上门内有效信号。测试完成后,利用直方图分析试验结果,计算标准微球的平均荧光强度值(F L0);连续开机2h后,在相同流式细胞仪设置和荧光通道电压值的条件下重复前述试验步骤,得到标准微球的平均荧光强度值(F L1),按式(6)计算F L0,F L1的相对漂移率(D)来表示稳定性。D=F L1-F L0F L01 0 0%(6)式中:D 相对漂移率;F L0 初始时各通道信号峰的平均强度;4J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局F L1 2h后各通道信号峰的平均强度。7.5 重复性将淋巴细胞标准物质(取1 0 0L淋巴细胞标准物质,按比例添加抗原决定簇C D 4抗体,轻柔涡旋充分混匀,避光存放半小时,使C D 4抗体与细胞充分结合)标记好C D 4抗体后上机测试,收集1 00 0 0个以上门内有效信号。重复测量6次,依次记录每次测量的C D 4阳性细胞占总淋巴细胞的百分比,按式(7)计算C D 4阳性细胞数量占总淋巴细胞的百分比的相对标准偏差(R S D),作为重复性的评价。R S D=ni=1(ri-r)2n-11r1 0 0%(7)式中:R S D 相对标准偏差,%;ri C D 4阳性细胞数量单次测量结果;r C D 4阳性细胞数量n次测量平均值;n 测量次数。7.6 示值误差按照7.5测量重复性实验中得到的C D 4阳性细胞占总淋巴细胞的百分比,计算平均值。按式(8)计算示值误差。参考附录C评估示值误差校准不确定度。r=r-rs(8)式中:r C D 4阳性细胞所占比例的示值误差,%;r C D 4阳性细胞所占比例的测量平均值;rs 淋巴细胞标准物质C D 4阳性细胞所占比例的标准值。8 校准结果表达经校准后的流式细胞仪应填发校准证书,校准证书应符合J J F1 0 7 12 0 1 0中5.1 2的要求。校准证书至少包括以下信息:a)标题,如“校准证书”或“校准报告”;b)实验室名称和地址;c)进行校准的地点(如果不在实验室内进行校准);d)证书或报告的唯一性标识(如编号),每页及总页数的标识;e)送校单位的名称和地址;f)被校对象的描述和明确标识;g)进行校准的日期,如果与被校结果的有效性和应用有关时,应说明被校对象的接受日期;h)如果与校准结果的有效性和应用有关时,应对抽样程序进行说明;i)对校准所依据的技术规范的标识,包括名称及代号;5J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局j)本次校准所用测量标准的溯源性及有效性说明;k)校准环境的描述;l)校准结果及测量不确定度的说明;m)校准证书或校准报告签发人的签名、职务或等效标识以及签发日期;n)校准结果仅对被校对象有效地声明;o)未经实验室书面批准,不得部分复制证书或报告的声明。9 复校时间间隔流式细胞仪复校间隔建议一般不超过1年。由于复校时间间隔的长短是由仪器的使用情况、使用者、仪器本身质量等诸因素所决定的,因此,送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔。如果对仪器的检测数据有怀疑或仪器更换主要部件及修理后应对仪器重新校准。6J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局附录A校准原始记录参考格式仪器名称型号制造厂商出厂编号委托单位名称联系人地址电话实验室温度实验室湿度校准日期证书编号记录编号标准物质编号校准人核验人A.1 分辨力(R S D)标准物质F S CF I T C单一荧光强度微球标准物质A.2 线性相关系数(r)与检出限(L O D)标准物质F I T C荧光强度值F I T C等量荧光分子ME S F相关系数r%检出限L O DME S F多重荧光强度混合微球标准物质标准物质P E荧光强度值P E等量荧光分子ME S F相关系数r%检出限L O DME S F多重荧光强度混合微球标准物质7J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局A.3 重复性(R S D)与示值误差(r)标准物质C D 4阳性细胞数占总淋巴细胞数的百分比平均值重复性R S D%示值误差r%淋巴细胞计数标准物质A.4 漂移(D)检测项目F S CF I T C起始信号强度2h后信号强度相对漂移率D%8J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局附录B校准证书内页推荐格式序号校准项目校准结果1分辨力测量值:2线性相关系数测量值:3检出限测量值:4漂移测量值:5重复性测量值:6示值误差测量值:不确定度:(k=2)9J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局附录C示值误差校准不确定度评定示例C.1 测量方法细胞表面标志物测量的示值误差是用淋巴细胞标准物质经过抗体染料标记后直接测量而得,测量得到的C D 4阳性细胞占总淋巴细胞的百分比,多次测量取平均值,再减去标准物质的标准值得到示值误差。C.2 测量模型细胞表面标志物测量的示值误差r:r=r-rs(C.1)式中:r C D 4阳性细胞所占比例的示值误差,%;r C D 4阳性细胞所占比例的测量平均值;rs 淋巴细胞标准物质C D 4阳性细胞所占比例的标准值。C.3 不确定度来源和标准不确定度评定根据校准方法,相对示值误差的不确定度来源分别为示值重复性引入的不确定度和标准物质引入的不确定度。C.3.1 重复性引入的不确定度淋巴 细 胞 计 数 标 准 物 质 连 续 测 量6次 的 测 量 值 为:5 1.2%,5 3.1%,4 9.4%,4 8.1%,5 2.9%,5 1.8%。根据贝塞尔公式测量重复性的不确定度u(r)为:u(r)=ni=1(ri-r)2n-1=0.0 2 0(C.2)式中:u(r)淋巴细胞重复测量的不确定度;ri C D 4阳性细胞数量单次测量结果;r C D 4阳性细胞数量n次测量平均值;n 测量次数。C.3.2 标准物质引入的不确定度u(rs)是标准物质标准值的不确定度,根据标准物质证书提供的扩展不确定度Us和包含因子ks,则:u(rs)=Usks=0.0 3 0(C.3)C.3.3 标准不确定度分量一览表C D 4阳性细胞比例示值误差测量结果的标准不确定度分量见表C.1。01J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局表C.1 C D 4阳性细胞比例示值误差测量结果的标准不确定分量一览表标准不确定度分量ui来源标准不确定度u(r)测量重复性0.0 2 0u(rs)淋巴细胞标准物质0.0 3 0C.4 合成标准不确定度示值误差的相对不确定度为:u(r)=u(r)2+u(rs)2=(0.0 2 0)2+(0.0 3 0)2=0.0 3 6C.5 扩展不确定度包含因子k=2,对应于9 5%的包含概率,则C D 4阳性细胞占总淋巴细胞的百分比测量示值误差的校准扩展不确定度可以表示为:U=ku(r)=20.0 3 6=0.0 7 211J J F1 6 6 52 0 1 7市场监管总局市场监管总局