基于DNA条形码技术的徐闻角尾海域夏、秋季仔稚鱼鉴定研究.pdf

渔业研究，（）：收稿日期：基金项目：广东省大学生创新创业训练计划项目（）；国家自然科学基金青年基金（）作者简介：王思进（），男，本科生，主要从事渔业资源生物学研究。：通信作者：侯 刚（），男，副教授，博士，主要从事南海鱼类早期资源研究。：王思进，王锦润，陈妍颖，等 基于 条形码技术的徐闻角尾海域夏、秋季仔稚鱼鉴定研究 渔业研究，（）：基于 条形码技术的徐闻角尾海域夏、秋季仔稚鱼鉴定研究王思进，王锦润，陈妍颖，侯 刚（广东海洋大学水产学院，广东 湛江）摘要：采用 条形码技术的标准 基因片段作为 条形码，对徐闻角尾珊瑚礁海域夏、秋季仔稚鱼进行分子鉴定，并探讨其在鱼类早期阶段物种鉴定的适用性。本研究共获得 条仔稚鱼样品 序列，其中有 个序列鉴定到种水平、个序列鉴定到目、科、属水平。本研究共成功鉴定了 个类群，隶属 目 科 属，其中 个类群鉴定到种的水平，个类群鉴定到属的水平，个类群鉴定到科的水平，个类群鉴定到目的水平，另有 个类群未能鉴定。在科级水平上，虾虎鱼科种类和数量最多，种类数占比为，数量占比为 ；其次为鲾科，种类数占比为 ，数量占比为 。以上研究结果表明，依据 条形码技术鉴定徐闻珊瑚礁海域的仔稚鱼，鉴定到种的水平比例偏低，成鱼 条形码序列的缺乏是一个重要因素。因此，亟需构建本海域分布的鱼类 条形码数据库，并结合传统形态学方法，以便更加准确地鉴定仔稚鱼物种。关键词：仔稚鱼；条形码；物种鉴定；珊瑚礁；徐闻中图分类号：文献标识码：文章编号：（）珊瑚礁作为热带、亚热带海洋鱼类重要的产卵、育幼场，受到广泛关注。但是由于人类活动以及全球气候变化影响，世界范围内的珊瑚礁生态系统受到了严重威胁。例如世界最大珊瑚礁群 澳大利亚大堡礁的活珊瑚覆盖率已由 年的 下降到 年的；加勒比海的活珊瑚覆盖率由 年的 下降到 年的。中国南海珊瑚礁中，广东大亚湾的活珊瑚覆盖率由 年的 下降到 年的 ；海南三亚鹿回头的活珊瑚覆盖率由 年的 下降到 年的；西沙永兴岛由 年的下降到 年的。珊瑚礁生态系统的严重退化，势必威胁到依靠其栖息和繁育的海洋鱼类。珊瑚礁生态系统的科学管理与保护，日益受到世界范围内海洋环保工作者的重视。徐闻珊瑚礁（）位于广东省雷州半岛西南部，从徐闻西连一直分布到角尾南岭海域，是中国大陆珊瑚礁分布的最北端，也是大陆沿岸面积最大、种类最多、唯一发育和保存最完好的珊瑚岸礁。徐闻国家级珊瑚礁保护区（面积约 ）即位于此。徐闻珊瑚礁海域鱼类资源十分丰富，曾报道鱼类 种。该海域亦是鱼类重要的产卵、育幼场，渔业研究第 卷但未见有关该海域的鱼卵、仔稚鱼相关研究的报道。近年来，随着全球气候变化和环境污染的加剧，徐闻珊瑚礁保护区活珊瑚覆盖率仅为 年的，栖息地生境退化十分严重，已影响到其对鱼类的产卵、育幼功能。因此，对徐闻珊瑚礁海域鱼类的产卵育幼场、产卵亲体和幼鱼资源的保护工作迫在眉睫。摸清该海域鱼卵、仔稚鱼的种类组成与分布是开展珊瑚礁鱼类资源保护与恢复工作的重要前提。鱼类早期生活史阶段作为鱼类生活史中的一个重要环节，其成活率的高低直接关系到年际补充量的大小，是引起种群数量变动和年龄结构变化的主要原因。由于仔稚鱼形态特征复杂多变，可用于鉴定的可识别的形态特征相对较少，因而基于传统形态分类学的鉴定往往在准确性方面存在较大的局限性。南海海洋鱼类超过 种，但是可参考的仔稚鱼形态学图鉴种类不足 种，加之传统的形态学鉴定需要长期训练和很丰富的鉴定经验，因此寻求更为稳定、可靠的分类鉴定方法，是开展鱼类早期资源研究的关键。条形码技术，即利用线粒体细胞色素 氧化酶亚基 （，）基因的一段约 长度的基因片段进行物种鉴定的技术，因其鉴定快速、操作便捷和较为可信，为仔稚鱼的分类鉴定研究创造了机遇。已有许多研究表明，条形码是一种鉴定仔稚鱼的较为可靠的方法，例如 等应用 条形码成功鉴定了莫雷阿岛的 尾仔稚鱼；等结合成鱼 条形码鉴定了墨西哥尤卡坦半岛的仔稚鱼；等基于 条形码技术鉴定了南海 种甲醛保存的仔稚鱼。此外，截至 年 月，数据库中已经包含了 种鱼类 个序列，为仔稚鱼的分子鉴定提供了便利和参考。为更准确地了解徐闻珊瑚礁海域仔稚鱼种类组成，本研究选取了 年徐闻角尾海域夏、秋季的仔稚鱼为研究对象，根据形态学初步筛选部分仔稚鱼样本进行扩增和测序，通过与公共数据库的匹配来实现仔稚鱼的分子鉴定，并探讨了 条形码技术在徐闻珊瑚礁海域仔稚鱼分类中的适用性，以期为徐闻珊瑚礁海域的产卵育幼场保护和渔业资源的可持续利用提供数据支撑和理论依据。材料与方法 数据来源仔稚鱼样品来自徐闻角尾海域的 年度夏、秋季鱼类浮游生物调查。采样工具为定置网（网口长 、宽 ，网目大小为 ）和大型浮游生物网（长 ，网口直径为 ，网目大小为 ）。采样时期选定调查月份的大潮时期，浮游生物网采集时间为：，采集白天的鱼卵、仔稚鱼（站位 ）；定置网的下网时间为：翌日：，利用潮汐采集晚上的仔稚鱼（站位 ）。使用浮游生物网进行水平拖网调查，拖时为 ，拖速为 节。水平拖曳时，于浮游生物网上方悬挂适量的浮子，以保证拖曳时网口既不沉入水底又能刚好完全没入水中。样品采集后一部分迅速固定于乙醇溶液保存，另一部分固定在 甲醛溶液保存，然后带回实验室。具体采样时间和站位如表 所示。提取与目的片段扩增将乙醇溶液保存的仔稚鱼逐一挑选出后，首先按照形态进行初步鉴定，对准备 提取的样品进行编号，用蔡司体式显微镜（）拍照，然后每个样本独立放入装有预冷过的乙醇溶液的 离心管中备用。使用预冷的超纯水中洗脱酒精约，使用 基因组 小量制备试剂盒（优逸兰迪，苏州）提取，置于 下保存。鱼类 基因片段扩增通用引物：和：。扩增总体积为，包括 、每种引物 （）、总 模板和 （总 模板 ）。条件为：预变性 ；变性，退火，延伸，个循环；最后 延伸。产物经 琼脂糖凝胶电泳检测合格后送武汉天一辉远双向测序。第 期王思进等：基基于于 条条形形码码技技术术的的徐徐闻闻角角尾尾海海域域夏夏、秋秋季季仔仔稚稚鱼鱼鉴鉴定定研研究究表 徐闻角尾海域具体采样时间和站位 采样时间 站位经纬度 水深 、数据分析获取双向测通的测序结果后，通过 中的 对序列进行拼接，去除两端引物，获得长度为 左右的 序列。将 序列与 系统（，）中的序列进行匹配度层次分析，分析时仅选择已公布登入号（）的物种序列。在前 匹配度序列最高的物种中，分别界定为最佳匹配物种（）和次佳匹配物种（），记录对应鱼种的学名、匹配相似度以及序列号。在前 个匹配度序列中，无次佳匹配物种时记为。根据序列与最佳匹配物种和次佳匹配物种的遗传相似度，当最佳匹配物种相似性 和次佳匹配物种相似性或 时，将仔稚鱼序列界定为 ；当最佳匹配物种相似性 和次佳匹配物种相似性 时，将仔稚鱼序列界定为 ；当最佳匹配相似性和次匹配物种相似性时，将仔稚鱼序列界定为 。使用 软件检查简并碱基，删除低质量的序列，基于 （）模型，采用邻接法（，法）构建系统进化树来验证比对结果。结果与分析 样品序列扩增与分析本研究共测序了 尾徐闻角尾珊瑚礁海域的仔稚鱼，双向测通 序列 个，去除低质量的 个序列后，最终获得 个高质量的序列，占比总测序的 ，纳入后续分析。使用 相似性阈值界定，有 序列（）的最佳匹配度在 之间；次佳匹配的相似性在 之间。在 个仔稚鱼序列中，有 个序列，归属于 ，占总比为 ；有 个序列，归属于 ，占总比为 ；有 个仔稚鱼序列，归属于，占总比为 （图）。图1仔稚鱼匹配分布散点图Fig.1The scatter plot of matching degree of fishlarvae and juvenile最佳匹配物种/%Best match species次佳匹配物种/%Nearest match species1009896949290888684828010098969492908886848280CaseCaseCase 种类鉴定通过 系统序列比对，共界定出 个类群，其中（）共界定出 个类群到种水平，占比为；共界定出 个类群到属水平（），个类群到科水平（）、个 类 群 到 目 水 平（），占 比 为；（）共界定出 个类群，未能归类，占比为 （图、图）。树分析表明，仔稚鱼类群划分为 个可操作单元（，图）。其中，最佳匹配物种红狼牙虾虎渔业研究第 卷鱼（）和次佳匹配物种雷氏鳗虾虎鱼（）、鳗虾虎鱼（）一起形成一个支系（），数据库中的鱼类种名与序列可能存在分类分歧，该支系仅能界定到虾虎鱼科；少棘胡椒鲷属（）（）形成独立的 个支系，且节点支持率较高（），可能存在潜存种或者错误鉴定。结合 数据库和 法，共成功鉴定出 个类群，隶属 目 科 属（表）；未鉴定出 个类群。在 个类群中，年夏、秋季鉴定出 个类群（）；年鉴定出 个类群（）；年鉴定出 个类群（）。以鲈形目种类最多，共计 个类群，隶属 科 属，数量占比。科级别以虾虎鱼科种类最多，共计 个类群，数量占比；其次为鲾科，出现 个类群，数量占比（表）。表 基于 条形码技术鉴定的仔稚鱼类群名录 目科属种 类群 样品量年份 鲱形目鳀科侧带小公鱼属侧带小公鱼属 鲱形目 鲻形目鲻科鲻科 银汉鱼目银汉鱼科下银汉鱼属凡氏下银汉鱼 鲉形目鲬科瞳鲬属日本瞳鲬 鲬科 鲈形目科九棘鲈属横纹九棘鲈 科属多鳞 鲹科副叶鲹属副叶鲹属 鲾科仰口鲾属大鳞仰口鲾 鲾科 鲾科 第 期王思进等：基基于于 条条形形码码技技术术的的徐徐闻闻角角尾尾海海域域夏夏、秋秋季季仔仔稚稚鱼鱼鉴鉴定定研研究究续表 目科属种 类群 样品量 年份 银鲈科银鲈属长棘银鲈 缘边银鲈 石鲈科少棘胡椒鲷属少棘胡椒鲷属 鲷科鲷属金头鲷 石首鱼科黄姑鱼属黄姑鱼 叫姑鱼属叫姑鱼属 科科 鳚科肩鳃鳚属斑点肩鳃鳚 科属弯棘 塘鳢科嵴塘鳢属锯嵴塘鳢 虾虎鱼科细棘虾虎鱼属犬牙细棘虾虎鱼 头纹细棘虾虎鱼 颊沟虾虎鱼属单色颊沟虾虎鱼 缟虾虎鱼属裸项缟虾虎鱼 舌虾虎鱼属舌虾虎鱼属 虾虎鱼科 渔业研究第 卷续表 目科属种 类群 样品量 年份 虾虎鱼科 带鱼科带鱼科 鲽形目舌鳎科须鳎属日本须鳎 舌鳎科 合计 讨论 条形码技术在仔稚鱼鉴定中的适用性条形码思想最早应用于 年，为美国宾夕法尼亚州大学生物学家丹詹森对哥斯达黎加西北部的 多种昆虫寄生虫进行编目。等于 年首次构思出采用一段 序列来标记物种的想法；年首次提出了“采用 序列作为生物分类系统的主要平台”这一 分类学观点；年，等 发现利用的一段约 长度的 基因片段，能够在分子水平上成功地对物种进行区分；年，等开发的鱼类通用引物得到广泛应用，并极大地促进了鱼类相关研究的发展；年，条形码被首次报道应用于仔稚鱼的鉴定。由于鱼卵、仔稚鱼 含量较少，因而采样时容易保存不当，或者提取 时出现丢失、断裂和易污染，测序时序列杂峰和简并碱基较多，以及易测序出非目的基因等，鱼卵、仔稚鱼 基因片段扩增成 功 率 变 化 较 大，在 之间。本研究中，扩增出的高质量序列占比为 （），低质量序列占比为 （），但是依然有 仔稚鱼没有被成功测序，意味着有更多的仔稚鱼类群有待结合形态学而被鉴定出。基于 比对和 法分析，本研究只鉴定出 个类群到种的水平（占比为），另外有 个物种存在鉴定分歧，仅能鉴定到科、属或者目的水平（，占比为），其可能是存在近期分化的物种或者错误分类所致（图）。另外，还有 个类群未 能 通 过 系 统 比 对 鉴 定（占 比 为），意味着在研究海域可能还有很多的鱼种缺乏 条形码数据库。南海幅员辽阔，地处“珊瑚大三角”西北缘，鱼类生物多样性很高，特有鱼类种类繁多，是世界上鱼类生物多样性热点区域。尽管南海属于西太平洋，但是鱼类区系却属于印度马来西亚区系，这也导致南海海域与太平洋迥然不同的鱼类区系分布，这在一定程度增加了使用太平洋海域的仔稚鱼书籍鉴定南海的仔稚鱼种类的困难，而通过分子技术来进行仔稚鱼鉴定，则需要构建一个较为可靠的南海海域的 条形码数据库。因而，将 条形码技术与传统形态学鉴定相结合，是解决南海鱼卵、仔稚鱼分类鉴定的重要途径。徐闻角尾珊瑚礁海域夏、秋季仔稚鱼的种类组成本研究调查水域主要集中在徐闻珊瑚礁角尾海域，位于琼州海峡最西北侧，紧邻徐闻珊瑚礁国家级保护区。该海域海洋气候条件与紧邻的北 第 期王思进等：基基于于 条条形形码码技技术术的的徐徐闻闻角角尾尾海海域域夏夏、秋秋季季仔仔稚稚鱼鱼鉴鉴定定研研究究图2基于CO基因序列构建的邻接树Fig.2 The neighbor-joining tree obtained based on COsequences部湾相近，属于亚热带热带海域，鱼类均以暖水性和热水性为主。本研究共成功鉴定出仔稚鱼 个类群，隶属 目 科 属。其中以鲈形目种类最多，共计 个类群，隶属 科 属。渔业研究第 卷科级别以虾虎鱼科种类最多，共计 个类群，到属水平的隶属 属。与杨国欢等先前调查的徐闻珊瑚礁鱼类名录相比，在 个鉴定到种水平的仔稚鱼中，仅有多鳞（）和长棘银鲈（）种为共有种，而本研究独自出现的仔稚鱼物种占比达 ，意味着徐闻珊瑚礁海域鱼类多样性非常丰富，可能还会有更多的栖息鱼类出现。在本研究中，鉴定的 个类群中，仅横纹九棘鲈（）等 个种类为礁盘鱼类（），占比较小（），未出现隆头鱼科等典型的珊瑚礁鱼类的仔稚鱼。在调查海域，近 年来扇贝类养殖发展迅速，养殖密度很大，海水水质下降，以及活珊瑚覆盖率很低，可能会导致该海域鱼类群落发生改变，珊瑚礁鱼类早期资源补充受到了很大的影响。在未来有待于扩大采样范围，发现更多的仔稚鱼物种，以更全面地反映徐闻角尾海域仔稚鱼的物种多样性。参考文献：，（）：，：，：，（），：，（）：李颖红，黄小平，岳维忠，等 西沙永兴岛珊瑚礁鱼礁坪生物生态学研究 海洋与湖沼，（）：黄晖，张浴阳，连健生 徐闻西岸造石珊瑚礁的组成及空间分布 生物多样性，（）：杨国欢，侯秀琼，陈春亮，等 徐闻珊瑚礁保护区鱼类种类组成初步研究 水产科学，（）：曹文宣，常剑波，乔晔，等 长江鱼类早期资源 北京：中国水利水电出版社，（）：，：，：，：，：，：，：，：，：，：第 期王思进等：基基于于 条条形形码码技技术术的的徐徐闻闻角角尾尾海海域域夏夏、秋秋季季仔仔稚稚鱼鱼鉴鉴定定研研究究 ，：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：林君卓，吴昊，陈凯，等 条形码在厦门湾鱼卵和仔稚鱼分类鉴定中的应用 渔业研究，（）：徐春燕，庄之栋，马超，等 基于 和 基因片段鉴定厦门海域的仔稚鱼 渔业研究，（）：孔啸兰，张帅，陈作志，等 基于 条形码技术的珠江口春季鱼卵和仔稚鱼种类组成和分布特征的研究 海洋学报，（）：，：张仁斋，陆穗芳，赵传絪，等中国近海鱼卵和仔鱼 上海：上海科学技术出版社，万瑞景，张仁斋 中国近海及其邻近海域鱼卵与仔稚鱼 上海：上海科学技术出版社，沖山宗雄 日本産稚魚図鑑 東海：東海大學出版會，侯刚，张辉 南海仔稚鱼图鉴（一）青岛：中国海洋大学出版社，渔业研究第 卷 ，（，）：，：；