北虫草液体菌种培养基优化及胞外多糖抗氧化性初探.pdf

DOI：10.13876/J.cnki.ydnse.230114第 43 卷 第 1 期2024 年 3 月延安大学学报（自然科学版）Journal of Yanan University（Natural Science Edition)Vol.43 No.1Mar.2024北虫草液体菌种培养基优化及胞外多糖抗氧化性初探王逸初1，白妍1，贺晓龙1，2，刘月芹1，2，靳鹏飞1，2，高小朋1，2*（1.延安大学 生命科学学院；2.微生物资源开发与绿色循环利用陕西省高校工程研究中心，陕西 延安 716000）摘要：针对北虫草人工栽培中菌丝液体发酵培养菌丝长速慢，产量不高的问题。研究引入了用于人工栽培的北虫草菌种（Cordyceps militaris），对其液体发酵培养基进行了优化并提取北虫草胞外多糖测定其抗氧化活性。结果表明，单因素筛选实验及Plackett-Burman分析表明最佳碳源、氮源、无机盐分别为蔗糖、酵母粉、磷酸二氢钾。爬坡试验进一步得出，当蔗糖浓度为25 g L-1、酵母粉为6 g L-1、磷酸二氢钾为2 g L-1时，北虫草生物量达到较大值2.113 g L-1。最后经中心组合试验设计和响应面法分析得出，最佳培养基配方为：蔗糖26.364 g L-1、酵母粉6.699 g L-1、磷酸二氢钾2.093 g L-1，此时菌丝干重达到最大值为 2.314 g L-1。验证实验表明结果准确，产量提升了107.34%。对胞外多糖提取物的DPPH自由基及ABTS自由基清除率，超氧阴离子自由基与脂质过氧化抑制率测定试验表明清除率与样品浓度呈正相关。关键词：北虫草；发酵培养基优化；响应面法；中心组合设计；抗氧化性中图分类号：Q939.99 文献标识码：A 文章编号：1004-602X（2024）01-0001-07冬虫夏草（简称虫草）是一种功效可与人参、鹿茸相媲美的珍贵药材1。其含有核苷类、甾醇、糖醇、多糖、多种氨基酸、脂肪酸、维生素、无机元素及多胺类等多种化学成分2，具有抗肿瘤、调节免疫、保护肾脏、抗氧化、抗菌等食药用价值3-4。虫草被过度采挖，造成资源日益枯竭。为了对虫草资源进行保护和发掘，寻求虫草替代品的开发研究势在必行。北虫草又名蛹虫草、北冬虫夏草或蛹草，通过对北虫草和冬虫夏草生物学地位及资源状况、化学成分和安全性评价表明两者相似度很高，甚至北虫草部分成分含量略高于冬虫夏草5。王晓彤等6研究了北虫草与冬虫夏草成分与药理作用，结果表明无明显差异。北虫草（Cordyceps militaris）虫草属，是食药用真菌中的一个重要类群，营养物质含量丰富，具有重要的医药保健和经济价值，是最适合作为野生冬虫夏草的替代品之一7。北虫草的液体发酵研究关系到培养周期，规模化，菌丝质量等，液体发酵能有效提高产量和效益8-9。北虫草人工栽培中，液体菌种发酵培养时菌丝生长速度较慢，菌丝量稀少等方面存在问题。要解决这一问题，则需要对培养基进行优化。为提升液体发酵中菌丝的生物量，已有学者进行了一系列研究。苏丹等10使用正交试验优化了北虫草非营养因素如装液量，接种量等，营养因素如碳源，氮源等方面；郑婷婷等11通过正交设计试验对蛹虫草发酵培养基的接种量，pH及温度等方面优化出最佳结果；张疏雨等12通过单因素实验对北虫草非营养因素如装液量，接种量等四个方面进行了优化。但是仅使用正交试验或者单因素实验只能考虑到少数因素之间的关系，得出的结果可信度不高，且仅能反映局部的关系，目前已有文献的方法主要局限于采用单因素分析和正交试验分析的优化方法12-13，采用响应面法继续系统优化报道较少，而响应面法可以最少的试验数量同时研究收稿日期：2023-11-18基金项目：陕西省创新能力支撑计划资助项目（2023-CX-TD40）；延安市科技计划项目（2020ZDYFZD-02）作者简介：王逸初（1999），男，陕西西安人，延安大学硕士研究生。*通信作者 食用菌专题 延安大学学报（自然科学版）第 43 卷 大量的因素，对试验可提供局部与整体之间的关系，从而得到明确的、科学的结论。基于此，本研究对北虫草液体发酵培养基进行优化，首先通过单因素实验确定影响菌丝生物量各因素的不同水平，再通过Design-Expert软件设计进行Plackett-Burman试验，筛选出对实验结果有显著影响的因素；随后通过最陡爬坡试验确定各因素的中心水平；最后通过中心组合设计、响应面分析，进行优化试验，并提取了北虫草胞外多糖研究其抗氧化性能，为北虫草菌丝体发酵培养及胞外多糖研究提供科学依据。1材料与方法1.1材料、试剂和仪器虫草属北虫草种（Cordyceps militaris）由延安大学生命科学院食用菌分子育种研究室提供。邻苯三酚、三氯乙酸和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）均购自上海麦克林生化科技有限公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）购自四川省维克奇生物科技有限公司；以上试剂均为分析纯。硫代巴比妥酸（BR，上海科丰实业有限公司）。马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）固体培养基和PDA液体基础培养基参照文献方法制备14-15。HC-3518高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；LDZF-75L-I立式高压蒸气灭菌器（上海申安医疗器械厂）。1.2方法1.2.1培养基成分优化1）单因素筛选：碳源分别选取A葡萄糖、B蔗糖和C麦芽糖；氮源选取D蛋白胨、E酵母粉和F硫酸铵；无机盐选取G磷酸二氢钾、H硫酸镁和I硫酸亚铁。具体单因素优化方案见表1。以上实验设置三组重复，25 1、180 r/min、培养5 d，测定各组菌丝体干重。2）Plackett-Burman设计16-17：在单因素的基础上，在实验最佳因素水平处上下各选一个步长进行PB设计，从3种碳源、氮源和无机盐中分别筛选出一种最显著因素。3）最陡爬坡试验：在PB实验的基础上，对筛选出的碳源、氮源和无机盐分别选择出中心点值，进行后续实验18。4）中心组合及响应面分析：在 PB设计和最陡爬坡试验的基础上，采用Design-Expert软件进行中心组合设计，建立3因素3水平的试验设计表，并对结果进行响应面分析。1.2.2验证实验19为了验证模型的准定性和有效性，在培养条件不变的情况下，采用普通PDA培养基和预测的最佳培养基组成分别进行摇瓶培养实验，摇瓶培养5 d后测量菌丝干重（Y），两者参数进行比较。1.2.3北虫草胞外多糖抗氧化能力测定1）发酵液粗多糖提取20，过325目筛分离发酵液与菌丝体，60 恒温水浴浓缩，SEVAG法除蛋白后，醇沉过夜，离心得白色絮状多糖，自然干燥得北虫草胞外多糖，4 保存备用。2）测定胞外多糖抗氧化性，使用常规方法测定DPPH自由基清除率21；ABTS自由基清除率22；超氧阴离子自由基清除率23；脂质过氧化抑制率24，以分光光度计测定吸光度，计算公式如下：清除率(%)=A0-AA0100%（1）其中，A0为空白和对照样管的吸光度，A为加入样品和工作液的吸光度。2结果与分析2.1培养基成分优化结果2.1.1单因素实验结果单因素筛选实验结果如图1所示。由图1A可知，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖浓度太高和太低都不利于北虫草菌丝体的生长，当蔗糖浓度为25 g L-1时，北虫草的菌丝干重最大为 1.109 5 g L-1；当葡萄糖浓度为30 g L-1时，北虫草最大为0.963 0 g L-1。当麦芽糖浓度为25 g L-1时，北虫草的菌丝干重最大为0.676 5 g L-1。由图1B分析，酵母粉、蛋白胨、硫酸铵浓度太高和太低均不利于北虫草菌丝体的生长，当酵母粉浓度表1单因素水平单位：g L-1水平12345碳源A1520253035B1520253035C1520253035氮源D4681012E4681012F4681012无机盐G1.01.52.02.53.0H1.01.52.02.53.0I1.01.52.02.53.02第 1 期王逸初 等：北虫草液体菌种培养基优化及胞外多糖抗氧化性初探为6 g L-1时，北虫草的菌丝干重最大为1.023 5 g L-1；当蛋白胨浓度为8 g L-1时，北虫草的菌丝干重最大为0.787 0 g L-1；当硫酸铵浓度为8 g L-1时，北虫草的菌丝干重最大为0.560 5 g L-1。由图1C分析，磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁浓度太高和太低都不利于北虫草菌丝体的生长，当磷酸二氢钾浓度为1.5 g L-1时，北虫草的菌丝干重最大为0.875 0 g L-1；当硫酸镁浓度为1.5 g L-1时，北虫草的菌丝干重最大为0.665 0 g L-1；当硫酸亚铁浓度为2 g L-1时，北虫草的菌丝干重最大为0.595 0g L-1。2.1.2Plackett-Burman试验分析Plackett-Burman 试验设计及分析结果见表 2、表3。由Design-Expert软件，对表3中数据进行回归分析可得到最优方程：Y=1.75-0.024 8 A+0.114 5 B+0.008 2 C-0.017 0 D+0.122 8 E+0.021 8 F+0.113 2 G-0.018 8 H-0.023 7 I。由表 4可知，回归方程的 F为 28.12，表明模型拟合程度好。对回归方程进行显著性检验，结果表明PF）0.0001，模型效应极显著。试验所建模型中一次项A、B对模型影响都显著（P0.05），交互项中AB、AC、BC均达到极显著水平（P0.05），说明所选模型合适的。响应面结果分析如表8。利用回归方程分析北虫草菌丝干重随各因素变化的响应曲面图，由这些曲面图可以知道B蔗糖、E酵母粉、G磷酸二氢钾各个因素对菌丝生物量的影响，每个响应面代表着两个独立的因素之间的交互作用，另一个因素要保持在水平0。因素响应曲面表5最陡爬坡试验设计及结果单位：g L-1试验号123456B152535455565E2610141822G123456Y2.0902.1131.8751.5821.3391.329表8各因素对北虫草菌丝干重影响的方差分析方差来源模型ABCABACBCA2B2C2残差失拟向纯误差总离差平方和1.570 00.040 90.047 90.009 90.031 70.025 00.023 00.500 90.322 30.427 60.009 30.007 10.002 11.580 0自由度911111111173416均方0.175 00.040 90.047 90.009 90.031 70.025 00.023 00.500 90.322 30.427 60.001 30.002 40.000 5F值132.1330.8936.177.4523.9318.8517.33378.34243.43322.944.49P值0.000 10.000 90.000 50.029 30.001 80.003 40.004 20.000 10.000 10.000 10.090 5显著性significantno significant表6中心组合试验中变量及其水平 单位：g L-1因子BEG水平-1152102562135103表7中心组合试验设计及结果实验号1234567891011121314151617B010-101-110-101000-10E0100101010-1-100-1-10G00011-101-1-11000-100Y/（g L-1）2.3131.9252.2651.4991.9211.6171.5911.7871.6411.6451.6181.5892.3112.3231.6411.6112.291表4单因素对北虫草菌丝干重影响的方差分析方差来源模型ABCDEFGHI残差总离差平方和1.052 00.007 40.157 30.000 80.003 50.181 10.005 70.153 70.004 30.006 70.524 5自由度9111111111211均方0.057 80.007 40.157 30.000 80.003 50.181 10.005 70.153 70.004 30.006 70.002 1F28.123.6076.510.391.6988.062.7874.742.073.27P0.034 80.193 80.012 80.596 40.323 60.011 20.237 30.013 10.286 80.212 3显著性significant4第 1 期王逸初 等：北虫草液体菌种培养基优化及胞外多糖抗氧化性初探如图2、3、4所示；由回归模型可得其最佳培养基组成为：蔗糖26.364 g L-1，酵母粉6.699 g L-1，磷酸二氢钾2.093 g L-1，此时菌丝干重（Y）预测值达到最大值2.314 g L-1。2.1.6验证实验优化前的 3 个摇瓶培养的菌丝干重平均为1.13 g L-1，优化后 3 个摇瓶的菌丝干重平均为2.343 g L-1，产量提升了107.34%。2.2北虫草胞外多糖抗氧化能力测定基于响应面法优化结果配制液体发酵培养基培养北虫草菌丝，将发酵液中胞外多糖提取制成样液测定DPPH自由基及ABTS自由基清除率，超氧阴图3磷酸二氢钾和蔗糖的交互作用图图2酵母粉和蔗糖的交互作用图图4磷酸二氢钾和酵母粉的交互作用图5延安大学学报（自然科学版）第 43 卷 离子自由基与脂质过氧化抑制率。1）DPPH自由基及ABTS自由基测定结果，由图5A可知，北虫草胞外多糖对于DPPH以及ABTS自由基均有显著清除能力，且随着多糖浓度的增加而升高，对于DPPH自由基的清除能力高于ABTS自由基。2）超氧阴离子自由基与脂质过氧化抑制率测定结果，由图5B可知，北虫草胞外多糖对于超氧阴离子自由基与脂质过氧化抑制率均具有清除能力，且随着多糖浓度的提高而上升，但两者相比，北虫草胞外多糖对于超氧阴离子自由基的清除能力明显弱于脂质过氧化抑制率。北虫草胞外多糖抗氧化能力测定结果如图5。3讨论与结论本实验供试菌种为北虫草种，单因素实验表明液体培养的最佳碳源为蔗糖、最佳氮源为酵母粉、最佳无机盐为磷酸二氢钾。经PB试验及中心组合优化及响应面分析，得到优化后培养基配方为：蔗糖 26.364 g L-1、酵母粉 6.699 g L-1、磷酸二氢钾2.093 g L-1，此时菌丝生物量（Y）达到最大值2.314 g L-1。验证实验表明同未优化培养基菌丝干重相比，产量提升了 107.34%。北虫草胞外多糖抗氧化试验表明，其对于DPPH及ABTS自由基清除能力，超氧阴离子自由基与脂质过氧化抑制能力，均有良好的效果。本实验液体培养基优化有效解决了北虫草种液体发酵菌丝生长速度慢，生物量少的问题，目前对于北虫草液体发酵条件优化主要集中于单因素和正交实验方面，结合响应面分析研究较少，且采用响应面分析到多数优化只是简单地结合单因素分析显著性或者直接进行PB设计后响应面分析，缺少如爬坡等关键步骤，使研究结果准确性不足。本试验由单因素筛选、结合PB设计、爬坡试验、中心组合设计及响应面分析，采用严谨的实验设计，以最少的实验数量和时间较为地研究，结果更直观、准确。基于本实验结果为北虫草替代野生冬虫夏草研究的液体菌种实验提供数据支撑。参考文献：1 岑明冬虫夏草综述 J 食用菌科技，1984，3（2）：1-42 严冬，梁举春冬虫夏草化学成分研究综述 J 黑龙江科技信息，2013（5）：963 严冬，梁举春冬虫夏草药理作用研究综述 J 北方药学，2013，10（4）：544 林津晶，王勇冬虫夏草国内文献综述 J 海峡药学，2007，19（5）：8-105 李军，陈广生，方清茂，等人工培养蛹虫草与冬虫夏草的比较研究 J 成都中医药大学学报，2010，33（3）：82-846 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Yueqin1，2，JIN Pengfei1，2，GAO Xiaopeng1，2*（1.School of Life Sciences，Yan an University；2.Engineering Research Center of Microbial Resources Development and Green Recycling，University of Shaanxi Province；Yan an 716000，China）Abstract：Aiming at the problem of slow growth and low yield of mycelia cultured by liquid fermentation in artificial cultivation of Cordyceps militaris.Cordyceps militaris was introduced for artificial cultivation，and its liquid fermentation medium was optimized.Extractive polysaccharide was extracted to determine its antioxidant activity.The results showed：single factor screening test and Plackett-Burman analysis showed that the best carbon source，nitrogen source and inorganic salt were sucrose and yeast powder potassium dihydrogen phosphate，respectively.The climbing experiment further showed that when sucrose concentration was 25 g L-1，yeast powder was 6 g L-1 and potassium dihydrogen phosphate was 2 g L-1，the biomass of Cordyceps militar reached a larger value of 2.113 g L-1.Finally，the optimal medium formula was as follows：sucrose 26.364 g L-1，yeast powder 6.699 g L-1，potassium dihydrogen phosphate 2.093 g L-1，and the maximum dry weight of mycelium reached 2.314 g L-1 by the central combination test design and response surface analysis.The verification experiment showed that the result was accurate and the yield was increased by 107.34%.The removal rates of DPPH free radical and ABTS free radical of exopolysaccharide extract were positively correlated with the concentration of sample.Key words：Cordyceps militaris；optimization of fermentation medium；response surface method；center combination design；oxidation resistance7