UHPLC-MS_MS测定人血浆中的阿普斯特浓度及生物等效性研究.pdf

重点实验室简介国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室于 年 月获批依托单位为山东省食品药品检验研究院合作单位为山东大学和山东省药学科学院 学术委员会主任丁健院士实验室主任王维剑 实验室共有科研人员 人其中高级职称 人博士生导师 人硕士生导师 人博士 人硕士 人 重点实验室配套设施完善面积约 平方米仪器总值 万元 实验室主要围绕仿制药一致性评价开展创新研究和科技攻关解决关键性、前瞻性的技术问题进一步提升我国仿制药研究及评价水平 研究方向:.药品杂质控制研究包括微量和极微量基因毒性杂质快速筛查、杂质谱研究、杂质对照品制备、赋值及毒理学评价等构建药物杂质分离、制备、鉴定、评价的完整体系.特殊制剂溶出方法研究包括多种研究手段的综合运用建立吸入、缓控释制剂、难溶性药物体外评价体系.体内外相关性评价体系研究包括建立基于计算机模拟的体内外相关性评价模型、运用模型开展体外评价方法及质量标准科学性、适用性研究.原辅料关键属性研究包括参比制剂逆向分析、原辅料在制剂中存在状态、性能指标及质量评价研究等领域实验室主任:王维剑主任药师博士山东省食品药品检验研究院院长兼任国家药监局药物制剂技术研究与评价重点实验室副主任兼学术委员山东省药学会药物分析学术委员会学术委员国家药品 检查员国家药监局药品审评中心化学药品审评员山东大学硕士研究生合作导师药学研究杂志主编 长期从事药物质量控制与评价研究工作承担国家科技部重大专项课题 项主持山东省重点研发计划课题 项参与山东省重大科技创新项目 项获山东省科技进步二等奖 项、三等奖 项中国商业联合会科学技术奖特等奖 项、一等奖 项中国药学会科学技术三等奖 项其他科研奖励 余项牵头制定 国际药典标准 项国家药品标准 余项获美国、日本等国际发明专利 项国家发明专利 余项发表学术论文 余篇 收录 余篇 基金项目:山东省重点研发计划(重大关键技术)药物一致性评价共性关键技术研究(.)作者简介:张迅杰女硕士主管药师研究方向:药物分析:.通信作者:咸瑞卿男硕士副主任药师研究方向:药品检验:./测定人血浆中的阿普斯特浓度及生物等效性研究张迅杰贺美莲杭宝建石峰巩丽萍张乃斌咸瑞卿(.山东省食品药品检验研究院国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室山东省仿制药一致性评价工程技术研究中心产业技术基础公共服务平台山东 济南.山东大学药学院山东 济南)摘要:目的 采用超高效液相色谱串联质谱(/)法建立快速、简单、灵敏的测定人血浆中阿普斯特浓度的方法并用于阿普斯特人体生物等效性试验研究 方法 采用蛋白沉淀法处理以阿普斯特作为内标色谱柱为 柱(.)流动相为.甲酸水.甲酸乙腈流速.梯度洗脱采用电喷雾()离子源以正离子方式进行 检测用时 结果 阿普斯特在 (.)范围内线性关系良好准确度和精密度均小于 空腹和餐后条件下阿普斯特片受试制剂、和 的 为参比制剂相应参数的.范围内 结论受试制剂与参比制剂具有生物等效性关键词:阿普斯特超高效液相色谱串联质谱生物等效性人血浆药学研究 .中图分类号:.文献标志码:文章编号:():././(.):/.().(.).(.)(.).().(.).:/银屑病是一种常见的免疫相关的慢性复发性炎症性皮肤病是一种多基因遗传和环境相互作用下主要由细胞免疫异常介导的慢性炎症性增殖性皮肤病 在世界范围内有.亿人患病中国银屑病患者达 万以上 银屑病关节炎是一种与银屑病相关的炎性关节病 白塞病是一种复杂的、原因不明的、多系统受累的慢性自身免疫病阿普斯特是一种口服的环单磷酸腺苷()特异性磷酸二酯酶 ()小分子抑制剂 的抑制能够升高细胞内的 水平降解 可导致免疫细胞激活和促炎细胞因子释放 因此抑制 可能能够降低 介导的炎症反应 阿普斯特片 年 月 日在美国获批上市销售批准的适应证为活动性银屑病关节炎适用光疗或者系统治疗的中度至重度斑块状银屑病和与白塞病相关的口腔溃疡 年 月 批准阿普斯特用于治疗中重度斑块状银屑病 由于其有希望的治疗结果和安全性该药物分子在皮肤病学中变得非常流行 目前国内有关测定人体内阿普斯特血药浓度的方法尚未研究本研究首次建立了一种测定血浆中阿普斯特浓度的超高效液相色谱串联质谱(/)方法该分析方法分析速度快选择性好准确度高灵敏度高基质效应小等优点 此外对该分析方法进行了完整验证以确保数据测定的准确性 利用此方法进行阿普斯特在中国健康受试者空腹及餐后状态下体内的药动学及人体生物等效性研究为阿普斯特相关制剂一致性评价提供依据 实验部分.仪器与试剂 液相色谱质谱联用系统(美国 公司)台式高速冷冻离心机(德国 公司)台式高速冷冻离心机(孔板美国贝克曼库尔特公司)超纯水器(美国 公司)数据处理软件:.(美国 公司).(美国赛默飞世尔公司)阿普斯特对照品(纯度.北京曼哈格生物科技有限公司)阿普斯特对照品(化学纯度.同位素内标纯度.北京曼哈格生物科技有限公司)甲醇、乙腈(色谱纯德国默克公司)甲酸(色谱纯美国 恩科化学)二甲基甲酰药学研究 .胺色谱纯赛默飞世尔科技(中国)科技有限公司 受试制剂:阿普斯特片(规格:批号:)参比制剂:阿普斯特片(规格:批号:生产).分析条件.条件 色谱柱(.)柱温为 流动相 相为.甲酸水 相为.甲酸乙腈采用梯度洗脱洗脱程序为:.流动相 的体积百分含量保持 流动相 的体积含量保持.流动相 的体积百分含量从 下降到.流动相 的体积百分含量从 上升到.流动相 的体积百分含量保持.流动相 的体积含量保持.流动相 的体积百分含量从.上升到流动相 的体积百分含量从 下降到.流动相 的体积百分含量保持流动相 的体积含量保持 流速为.进样量为 .条件采用电喷雾离子源()负离子模式离子源温度参数设置为 检测模式采用多反应监测()模式离子化电压参数设置为 入口电压()参数设置为 碰撞室出口电压()参数设置为 喷雾气():辅助加热气():气帘气:监测离子对:阿普斯特:./.碰撞能量():去簇电压():阿普斯特:./.:.对照品溶液制备.分析物(阿普斯特)工作溶液的配制精密称取阿普斯特适量用 二甲基甲酰胺()配制成质量浓度为.的阿普斯特储备液精密量取 阿普斯特储备液适量置 容量瓶中加 乙腈水溶液至刻度使质量浓度为 阿普斯特工作溶液避光保存于 冰箱中.内标(阿普斯特)溶液的配制 精密称取阿普斯特适量用 二甲基甲酰胺()配制成质量浓度为.的阿普斯特储备液精密移取阿普斯特储备液适量用乙腈水溶液稀释至质量浓度为.阿普斯特工作溶液精密移取阿普斯特工作溶液适量用乙腈溶液稀释至质量浓度为.阿普斯特 工作溶液避光保存于 冰箱中.样品预处理取 深孔 孔板每孔加 血浆样品再加质量浓度为.内标工作溶液(内标工作溶液稀释剂为乙腈溶液)涡旋混合 置 台式高速冷冻离心机(孔板)中离心 ()每孔取 上清液转移至另一 深孔 孔板向新的 孔板中加 乙腈水溶液 稀释涡旋混合 待测.试验设计 本次临床研究筛选 例健康成年受试者所有受试对象均自愿参加本次临床试验且均已签署书面知情同意书并理解研究程序能按试验方案要求完成本研究项目本次临床研究采用单中心、单次给药、随机、开放、双周期、双制剂、双交叉试验设计进行空腹及餐后两种状态下的制剂间生物等效性研究 空腹组 例受试者餐后组 例受试者空腹组和餐后组均随机分为两组每组 人按照给药顺序表分别给予受试制剂和参比制剂 所有受试者给药方法:空腹或者开始高脂餐后 口服 温水服用给药剂量为 第周期 例受试者口服阿普斯特片 (受试制剂)另 例受试者餐后口服阿普斯特片 (参比制剂)后进行第周期交叉给药研究 空腹/餐后试验:在给药 (给药前 内)和.、.、.、.、.、.、.、共 个时间点采集静脉血 空腹/餐后采集的静脉血均置 抗凝真空采血管中 室温放置 离心(条件设定为 、)全血样品于采集完后 内放入离心机 待离心操作结束后 室温分离血浆 分离的血浆样品冷冻保存于超低温冰箱(冰箱温度范围不高于)中用于检测血浆中阿普斯特的血药浓度 方法与结果.方法学验证.线性范围 用移液器取 空白血浆加入 不同浓度的分析物工作溶液使样品中阿普斯特的浓度分别为.、.、.、.、分别按“.”项下方法处理样品按“.”项下条件测定 每个分析批的标准曲线采用双校正样品拟合以阿普斯特与阿普斯特的色谱峰面积比为纵坐标()以血浆中阿普斯特的浓度为横坐标()采取加权(/)最小二乘药学研究 .法进行线性回归求得回归方程为 .决定系数 为.校正样品回算浓度均在要求范围之内说明阿普斯特在.范围内线性良好由此计算的药物浓度准确可靠 本研究方法的定量下限为.信噪比/满足定量要求.残留通过在注射高浓度样品后注射空白基质样品(空白血浆)来评价残留图 为阿普斯特在定量上限()处的选择离子色谱图分析物和内标经色谱分离后分析物(阿普斯特)的保留时间为.内标(阿普斯特)的保留时间为.并得到较好的响应值与峰形 图 为注射定量上限()阿普斯特样品后进样的空白血浆样品色谱图 将图 与图 进行比较发现空白血浆样品的色谱图在阿普斯特与阿普斯特的色谱峰附近中没有干扰峰出现说明该方法的残留小对分析物(阿普斯特)及内标(阿普斯特)的定量均无影响 图 为受试对象服用阿普斯特片 后的血浆样品提取离子色谱图结果表明该研究方法在用于测定实际血浆样品时相应保留时间处无飘移.加标阿普斯特的血浆样品.空白血浆样品.受试者服用阿普斯特片 后的血浆样品.阿普斯特.内标图 人血浆样品的提取离子色谱图.精密度与准确度配制含分析物(阿普斯特)定量下限(.)和低(.)、中(.)、高()水平的质控样品各 份“.”项下方法处理样品在至少 内测定 个不同分析批评价本研究方法的批内、批间准确度和精密度结果见表 表明该研究方法的精密度、准确度均良好符合中国药典 年版(四部)通则 生物样品定量分析方法验证指导原则.选择性取 个受试者的空白血浆制备空白基质样品与定量下限样品空白基质样品除用 乙腈溶液代替内标工作溶液外其余步骤按“.”项下方法处理样品定量下限样品按“.”项下方法处理样品采用“.”项下条件进样分析 本研究 个受试者的空白基质干扰组分在阿普斯特与阿普斯特保留时间处的响应均为 表明该方法具有良好的选择性能区分阿普斯特与阿普斯特与基质中的内源性组分表 准确度与精密度()浓度/批内准确度()精密度()分析批 分析批 分析批 分析批 分析批 分析批 批间准确度()精密度().基质效应取 个受试者的空白基质、个高血脂空白基质及 个溶血空白基质制备不添加待测物和内标的空白基质样品“.”项下方法处理样品向处理后的空白基质样品中分别加入低质控浓度(.)和高质控浓度()阿普斯特与阿普斯特的混合溶液配制基质效应评价样品采用“.”项下条件进样分析所得阿普斯特与阿普斯特响应与相同理论浓度的纯溶液样品的阿普斯特与阿普斯特响应比较用内标归一化的基质因子的变异系数()评价基质效应具体结果见表 结果 个受试者 个高脂及 个溶血的空白基质样品的内标归一化基质因子的 均小于 表明该研究方法的基质效应符合要求表 批不同来源血浆、高脂及溶血的基质效应(.)()分析物基质因子内标基质因子内标归一化的基质因子分析物基质因子内标基质因子内标归一化的基质因子.药学研究 .提取回收率取空白基质按“.”项下方法处理样品加入阿普斯特与阿普斯特进样测定比较二者的响应均值考察阿普斯特(低、中、高 个质控浓度)和阿普斯特的提取回收率 种质控浓度阿普斯特的提取回收率分别为.、.、.阿普斯特 的 提 取 回 收 率 为.说明该研究方法提取回收率较高在处理过程中不会对结果造成影响.稳定性用新鲜制备的标准曲线及质控样品考察放置不同储存条件下的样品中阿普斯特的稳定性分别考察了含阿普斯特的血浆样品反复冻融循环 次的稳定性、血浆样品在室温条件下放置 的稳定性、处理过的血浆样品在自动进样器温度()条件下放置 的稳定性及血浆样品在冷冻条件下()放置 的稳定性 结果见表 结果表明阿普斯特血浆样品在考察条件下稳定表 不同条件下的稳定性考察结果()浓度/室温放置()自动进样器温度下放置 ()长期放置()()()冻融循环(次)().阿普斯特片药代动力学及生物等效性研究使用本研究建立的/方法对血浆中阿普斯特浓度进行测定评价空腹和餐后条件下两制剂之间是否具有生物等效性 以时间为横坐标、测定的阿普斯特血药浓度为纵坐标分别绘制空腹及餐后条件下受试制剂与参比制剂的阿普斯特平均血药浓度时间曲线(见图)图 在空腹()和餐后()条件下阿普斯特的平均血药浓度时间曲线图 用 .软件计算两种阿普斯特片剂的药代动力学参数(、/、)结果见表 主要药代动力学参数(、)经对数转换后进行多因素方程分析同时采用()计算两种制剂的主要药代动力学参数的几何均值的 置信区间()评价两种制剂的生物等效性 例受试者空腹口服阿普斯特片受试制剂和参比制剂的、几何均值比的 置信区间分别落在.、.和.范围内 例受试者餐后口服阿普斯特片受试制剂和参比制剂的、几何均值比的 置信区间分别落在.、.和.范围内 此外本实验中空腹给药后阿普斯特、的个体内变异 分别为.、.、.餐后给药组的个体内变异 分别为.、.、.、和 经对数转换后多因素方差分析结果显示给药周期、给药序列、个体间、制剂间的差异均具有统计学意义(.)表 在空腹和餐后条件下阿普斯特片受试制剂和参比制剂药动学参数()药动学参数(单位)空腹算术均值餐后算术均值受试制剂参比制剂受试制剂参比制剂/./././.(.).(.).().(.)/.(/).结论本研究建立的测定人血浆中阿普斯特含量的方法具有灵敏度高、准确可靠、选择性好、基质效应小、快速简便等优点 该方法使用乙腈对血浆样品进行蛋白沉淀内标工作溶液直接配制到沉淀剂中减少了操作步骤使操作更简化并且有机试剂消耗少大大提高了临床适用性和工作效率选用.甲酸水和.甲酸乙腈为流动相提高灵敏度出峰位置稳定且缩短了单针检测时间该方法使用同位素标记的内标方法的耐用性大大提高此外为了减小该分析方法的基质效应将蛋白沉淀离心后的上清进行 稀释(稀释液:乙腈水)经方法学验证该方法符合生物样本分析要求实际样本再分析的通过率为 将该方法成功应用于临床血药浓度检测结果可靠 本试验为阿普斯特相关制剂药学研究 .的生物等效性研究提供了数据参考适用于阿普斯特的血药浓度检测及其药代动力学研究为阿普斯特制剂一致性评价提供依据研究结果表明空腹和餐后口服阿普斯特片受试制剂和参比制剂的、几何均值比的 均在.等效区间内(包括边界值)符合生物等效性评价标准 此外本试验中空腹和餐后给药后阿普斯特、的个体内变异 均小于 不属于高变异药物、经对数转换后的多因素方差分析结果显示给药周期、给药序列、个体间、制剂间的差异均具有统计学意义(.)研究结果表明两种制剂在空腹和餐后条件下口服给药符合生物等效 另外由药动学参数 可知阿普斯特餐后条件下口服给药生物利用度较空腹条件下高为临床提供更合理的用药指导为患者提供更好的治疗效果参考文献:中华医学会皮肤性病分会银屑病学组.中国银屑病治疗专家共识(版).中华皮肤科杂志():.王丽玮杨莹崔盘根.抗白细胞介素 生物制剂治疗银屑病的疗效和安全性.国际皮肤性病学杂志():.中华医学会皮肤性病学分会银屑病专业委员会.国银屑病诊疗指南(简版).中华皮肤科杂():.:.():.陈茜茜李军霞扶晓兰等.白塞病遗传学研究进展.中华风湿病学杂志():.():.:.():.:.():.():.:.():.国家药典委员会.中华人民共和国药典 年版(四部).北京:中国医药科技出版社:.(收稿日期:)(上接第 页)参考文献:.():.():.():.():.:.(/):.:.(/):.:.():.:.():.冯彩霞修宪田伟等.补体活化的体外评价模型建立及应用.药学学报():.张嘉李贻奎李连达等.补体系统激活在吐温 导致类过敏反应中的作用.毒理学杂志():.刘春琰窦德强.血塞通注射液对人血清补体系统影响的体外研究.辽宁中医杂志():.王珏江颖肖新月等.生物制品用辅料蔗糖中颗粒杂质体外补体激活研究.药学研究():.陈莉婧廖国平汪艳等.清开灵注射液对人血清补体和 细胞影响的体外研究.中国中药杂志():.(收稿日期:)药学研究 .