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菊睛丸改善 D-半乳糖致亚急性衰老小鼠视网膜损伤效应评价与作用机制研究陆韫青1,曹程1,郑嘉妮1,朱梓强1,仝佳祥1,齐程成1,袁磊1,郭盛1,宿树兰1,康宏杰2,段金廒1,朱悦1(1.南京中医药大学药学院,中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程中心,江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,江苏省方剂高技术研究重点实验室,江苏 南京 210023;2.宁夏枸杞创新中心,宁夏 银川 750002)摘要:目的 评价菊睛丸改善 D-半乳糖致亚急性衰老小鼠视网膜损伤效应并探索作用机制。方法 采用小鼠皮下注射 D-半乳糖构建亚急性衰老模型,分别给予西药阳性药 AREDS2、中药阳性药杞菊地黄丸、菊睛丸水提取物低、高剂量组和菊睛丸50%乙醇提取物低、高剂量组。通过光学相干断层成像检查(OCT)检测小鼠视网膜及眼底情况,HE 染色法检测视网膜细胞损伤程度,TUNEL 染色法检测视网膜细胞凋亡情况,试剂盒检测氧化应激因子表达,Western blot 检测小鼠视网膜凋亡和氧化应激通路相关蛋白表达情况。结果 菊睛丸提取物显著增加模型小鼠视网膜厚度(P0.05),改善视网膜损伤并抑制视网膜细胞凋亡(P0.05)。同时,菊睛丸提取物下调 Cleaved Caspase-3 与 Cleaved Caspase-9 凋亡通路蛋白表达(P0.05),上调 Bcl-2/Bax 蛋白表达比值(P0.05)。菊睛丸提取物显著提高抗氧化因子 SOD 与 GSH 等表达(P0.05),减少氧化产物 MDA 产生(P0.05),显著上调抗氧化蛋白 Nrf2 与 HO-1 的表达(P0.05)。菊睛丸水提取物和50%乙醇提取物有相似的作用趋势。结论 菊睛丸改善 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠视网膜损伤,其作用途径与抑制视网膜细胞凋亡并改善氧化应激有关。关键词:菊睛丸;亚急性衰老;视网膜损伤;氧化应激;凋亡中图分类号:R285.5文献标志码:A文章编号:1672-0482(2023)09-0849-11DOI:10.14148/j.issn.1672-0482.2023.0849引文格式:陆韫青,曹程,郑嘉妮,等.菊睛丸改善 D-半乳糖致亚急性衰老小鼠视网膜损伤效应评价与作用机制研究J.南京中医药大学学报,2023,39(9):849-859.Effect Evaluation and Mechanism of Jujing Pills in Improving Retinal Injury in Subacute Aging Mice Induced by D-galactoseLU Yun-qing1 CAO Cheng1 ZHENG Jia-ni1 ZHU Zi-qiang1 TONG Jia-xiang1 QI Cheng-cheng1 YUAN Lei1 GUO Sheng1 SU Shu-lan1 KANG Hong-jie2 DUAN Jin-ao1 ZHU Yue1 1.School of Pharmacy National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and For-mulae Innovative Medicine Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization Jiangsu Province 948南京中医药大学学报 2023 年 9 月第 39 卷第 9 期J Nanjing Univ Tradit Chin Med Vol.39 No.9 Sep.2023收稿日期:2023-07-15基金项目:国家自然科学基金区域创新发展联合基金重点项目(U21A20408);宁夏重点研发计划重点项目(2021BEF01003,2021BEF02012,2022BFH02008);江苏省高等学校基础科学(自然科学)研究重大项目(22KJA360008);江苏省中药资源产业化过程协同创新中心重点项目(ZDXM-2020-03);江苏省研究生科研与实践创新计划(KYCX22_2009)第一作者:陆韫青,女,硕士研究生,E-mail:luckysally131 通信作者:朱悦,男,教授,主要从事中药复方精神与神经药理研究,E-mail:zhuyue ;段金廒,男,教授,博士生导师,主要从事中药资源化学与方剂功效物质基础研究,E-mail:dja Key Laboratory of High Technology Research Nanjing University of Chinese Medicine Nanjing 210023 China 2.Ningxia Innovation Center of Goji Yinchuan 750002 China ABSTRACT OBJECTIVE To evaluate the effect of Jujing Pills on retinal injury in subacute aging mice induced by D-galactose and explore its mechanism.METHODSA subacute aging model was constructed by subcutaneous injection of D-galactose into mice.Western medicine positive drug AREDS2 Chinese medicine positive drug Qiju Dihuang Pills low and high dose groups of water extract of Jujing Pill and low and high dose groups of 50%ethanol extract of Jujing Pill were administered respectively.Optical co-herence tomography OCT was used to evaluate the condition of mouse retina and fundus HE staining was adopted to assess retinal cell damage TUNEL staining was applied to observe retinal cell apoptosis kits were used to measure the expression of oxidative stress factors and western blotting was used to detect the expression of retinal apoptosis and oxidative stress pathway related proteins in mice.RESULTS The extracts of Jujing Pills significantly increased the retinal thickness P0.05 improved the retinal injury and inhibited the apoptosis of retinal cells in model mice P0.05.At the same time Jujing Pills down-regulated the expression of apop-totic proteins such as Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 P0.05 while up-regulated the expression ratio of Bcl-2/Bax P0.05.Jujing Pills also significantly increased the expression of antioxidant factors SOD and GSH P0.05 decreased the pro-duction of oxidative product MDA P0.05 and significantly up-regulated the expression of antioxidant proteins Nrf2 and HO-1 P0.05.The water extracts of Jujing Pills exerted similar retina protection effect with the 50%ethanol extracts.CONCLUSION Ju-jing Pills can improve the retinal injury of subacute aging model mice which is related to the inhibition of retinal cell apoptosis and the improvement of oxidative stress.KEYWORDS Jujing Pills subacute aging retinal injury oxidative stress apoptosis 视觉障碍已与肿瘤、心血管疾病共同成为全球严重影响人类生存质量的疾患。尤其在老龄化日趋加剧的当今社会,视网膜疾病中的年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration,AMD)已成为导致全球范围内老年人失明的最主要疾病1。流行病学研究结果显示,全球4585 岁人群中 AMD患病率约为 8.7%2。到 2040 年,受 AMD 影响的人数预计将增加到 2.88 亿3-4。在中国,AMD 患者累计人数已超 4 000 万,AMD 也是导致视觉障碍的主要原因5。AMD 已成为当今社会重大公共卫生问题2。视网膜特定的高氧分压、高光照暴露、高脂质化合物代谢的生理环境,促进了氧自由基的产生,使视网膜特别容易受到氧自由基以及脂类衍生物修饰的氧化蛋白的损害6,导致视网膜色素上皮细胞凋亡与玻璃膜疣形成,一部分患者引发 Bruch 膜破裂与脉络膜血管新生而导致湿性 AMD7-8。而另一部分患者 出 现 视 网 膜 地 图 样 萎 缩,最 终 形 成 干 性AMD9。目前,所有上市的 AMD 药物均是针对湿性 AMD,以玻璃体内注射抗 VEGF 药物作为治疗手段10。而干性 AMD 至今尚未有上市的治疗药物,仅推荐服用 AREDS2 营养配方补充剂进行预防11。因此,干性 AMD 迫切需要新的预防和治疗方案。中医眼科中多以“视瞻昏渺”“视直如曲”“暴盲”来描述 AMD 导致的视力下降12。菊睛丸始载于北宋(1078 年)太平惠民和剂局方卷之七治眼目疾13,在治疗描述其功效为“补不足,强目力”,主治“肝肾不足,眼目昏暗,瞻视不明,茫茫漠漠,常见黑花,多有冷泪”,与 AMD 尤其是干性 AMD视觉缺失的临床症状高度一致。组方药材中的枸杞子、菊花与肉苁蓉为药食同源药材,巴戟天也为可用于保健食品的中药材,因此该方安全性高,具有良好的开发为食品或保健品的应用前景。基于 AMD 为老年期高发疾病以及氧化应激这一核心病理机制,我们采用小鼠皮下注射 D-半乳糖构建亚急性衰老动物模型14,评价菊睛丸对衰老模型动物视网膜结构影响及其对视网膜氧化应激与细胞凋亡的影响,为衰老所致视网膜部损伤的临床防治与产品开发提供更多的现代科学依据。1 材料1.1 实验动物SPF 级 ICR 小鼠(雄性,8 周龄,体质量 20 22 g),购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,动物许可证号:SCXK(沪)2017-0005,于南京中医药大学动物实验中心 SPF 级屏障设施中常规饲养。普通饲料喂养,自由饮食,温度(232),湿度(602)%,光照周期 12 h。本实验已获得南京中医药大学动物实验伦理委员会的批准,动物伦理号为202201A028。1.2 药材枸杞子(Lycii Fructus,批号:2109099)采购于宁夏明德中药饮片公司,菊花(Chrysanthemi Flos,批号:17320722)、巴戟天(Morinda officinalis How,批号:245200601)、肉苁蓉(Cistanches Herba,批号:260200602)均采购于苏州市天灵中药饮片有限公司,经南京中医药大学段金廒教授鉴定为正品合格药材。PreserVision AREDS2(具体成分剂量为维生素C,100 mg kg-1 d-1;维 生 素E,058南京中医药大学学报 2023 年 9 月第 39 卷第 9 期80 Ukg-1d-1;氧化锌,16 mgkg-1d-1;氧化铜,0.4 mgkg-1d-1;叶黄素,2 mgkg-1d-1;玉米黄质,0.4 mgkg-1d-1)购自博士伦(Bausch Lomb)公司。杞菊地黄丸购自仲景宛西制药股份有限公司(批号:200806)。1.3 实验试剂包埋剂(4583)购自 Sakura 公司。四氟乙烯(Polyfluoroalkoxy,PFA)(G1101)购自武汉塞维尔公司。苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色试剂盒(G1120-10)购自北京索莱宝公司。TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(C1086)购自南京金益柏生物科技有限公司。4,6-二脒基-2 苯基吲哚(DAPI)(D4080)购自 Sigma 公司。蔗糖(57-50-1)、二甲苯(10023418)、无水乙醇(100092683)等购自国药集团化学试剂有限公司。氧化应激标志物检测相关试剂:小鼠超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(A001-3-2)、还原性谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒(A006-2-1)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(A003-4-1)均购自南京建成生物工程研究所。组 织 蛋 白 提 取 相 关 试 剂:RIPA 裂 解 液(P0013B)、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0009)购自上海碧云天生物技术有限公司。蛋白酶抑制剂Cocktail(HY-K0010)购自 MCE 公司。PBS 缓冲液(BL601A,BIOSHARP)购自北京兰杰柯科技有限公司。Western blot 相关试剂:一抗-actin(66009-1-Ig)、Nrf2(16396-1-AP)、HO-1(10701-1-LG)、Cleaved Caspase-3(19677-1-AP)购自武汉三鹰公司,Cleaved Caspase-9(9508S)购自 CST 公司,Bax(sc-7480)、Bcl-2(sc-7382)购自圣克鲁斯生物技术有限公司。二抗 HRP-Linked Anti-mouse IgG(BA1050)、HRP-Linked Anti-rabbit IgG(BA1054)均购自博士德公司。PAGE 凝胶快速制备试剂盒(10%,PG112;12.5%,PG113)购自上海雅酶生物医药科技有限公司。蛋白上样缓冲液(5Loading buff-er)、甘氨酸、Tris 等购自北京索莱宝公司。预染蛋白 Marker(180-6003)、ECL 发光液(180-5001)购自上海天能生命科学有限公司。吐温-20(T8220-500)购自南京何苗生物技术有限公司。未特别说明的试剂如氯化钠等购自国药集团化学试剂有限公司。1.4 实验仪器激光眼科诊断仪(Spectralis OCT,HEIDELBERG公司),多功能酶标仪(Enspire,Perkin-Elmer 公司),微孔板恒温振荡器(ST60-4,Thermo 公司),高速冷冻离心机(Microfuge-22R,BECKMAN 公司),荧光倒置显微镜(AXIO Vert.A1,Zeiss 公司),干式恒温金属浴(SBH130D,STUART 公司),凝胶电泳成像系统(ChemiDoc XRS+Imaging System,BIO-RAD公司)。2 方法2.1 药物制备菊睛丸(JJW)提取制备:按枸杞子 菊花 巴戟天肉苁蓉(3412)比例称取药材共 53 g,制备水提取物与 50%乙醇提取物。水提取物制备按药材质量加入 8 倍量纯水,回流提取 2 h,过滤后加入相同体积纯水重复回流提取 2 h 后过滤,合并 2 次滤液后减压浓缩。50%乙醇提取物制备按药材质量加入 8 倍量 50%乙醇,回流提取 2 h,过滤后加入相同体积 50%乙醇重复回流提取 2 h 后过滤,合并 2 次滤液后减压浓缩。冻干后计算得率,水提取物得率为 45.28%,50%乙醇提取物得率为 50.94%。2.2 动物造模与分组给药健康 ICR 小鼠共 80 只,适应性饲养 1 周后,将动物随机分为 8 组,每组 10 只。动物按如表 1 方式分组,除空白组外,其余每日皮下注射 D-半乳糖700 mgkg-1d-1,持续注射 7 周,建立 D-半乳糖亚急性衰老动物模型。模型建立之后各组灌胃相应药物,灌胃体积为每 10 g 动物灌胃 0.1 mL,持续10 d。采用 AREDS2 作为西药阳性药,采用杞菊地黄丸作为中成药阳性药。菊睛丸提取物动物给药剂量按照太平惠民和剂局方所记载的人用量进行折算,并分为低、高 2 个剂量组。低剂量组根据人用日常剂量折算,高剂量组根据人用日常剂量的 2 倍进行折算。158陆韫青,等:菊睛丸改善 D-半乳糖致亚急性衰老小鼠视网膜损伤效应评价与作用机制研究 第 9 期表 1 动物分组和给药剂量Table 1 Grouping and dosages of animals组别给药剂量空白组(Control)0.9%生理盐水模型组(Model)0.9%生理盐水阳性药组(AREDS2)0.3 gkg-1d-1阳性药组(杞菊地黄丸,QJDH)0.6 gkg-1d-1菊睛丸水提取物低剂量组(JJW-S-L)2.1 gkg-1d-1菊睛丸水提取物高剂量组(JJW-S-H)6.3 gkg-1d-1菊睛丸 50%乙醇提取物低剂量组(JJW-50-L)2.1 gkg-1d-1菊睛丸 50%乙醇提取物高剂量组(JJW-50-H)6.3 gkg-1d-12.3 光学相干断层成像检查(OCT)与视网膜厚度测量小鼠给药周期结束后,1%戊巴比妥钠腹腔注射小鼠(40 mgkg-1),麻醉后使用复方托吡卡胺散瞳10 min,玻璃酸钠保护角膜后佩戴角膜接触镜,进行小鼠眼底 OCT 检测。使用 Image J 对小鼠视网膜横截面图进行平均厚度测量分析小鼠眼底情况。2.4 眼部组织病理形态分析2.4.1 眼部组织切片制作 采用 OCT 拍摄受试动物眼底视网膜结束后,解剖获得动物模型眼球组织,于 4%PFA 固定 24 h,梯度蔗糖、乙醇脱水。之后按步骤浸蜡,再进行 OCT 包埋,用切片机切片,60 烘箱内烘片后最终制作获得模型动物眼球组织病理石蜡切片。2.4.2 眼球组织病理切片 HE 染色将 2.4.1 所得的眼球组织石蜡切片脱蜡之后,按步骤进行 HE染色,纯水慢速洗涤 10 s,乙醇梯度脱水,最后用中性树脂封片。2.5 TUNEL 检测眼部细胞凋亡水平将“2.4.1”所得的眼球组织石蜡切片脱蜡之后,根据 TUNEL 试剂盒标准步骤,避光进行染色,洗涤后 DAPI 染细胞核,乙醇梯度脱水,滴加防荧光淬灭剂后封片。检测模型动物视网膜部细胞凋亡水平。2.6 血清及组织蛋白提取行为学测试结束后,异氟烷吸入麻醉小鼠,眼眶取血,常温条件下800g 离心10 min,小心吸取上清血清。解剖获得模型动物眼球组织,液氮迅速冷冻、粉碎,称取 2030 mg 组织,PBS 制备匀浆(含 Cock-tail 蛋白酶抑制剂),4 条件下 800g 离心 10 min,小心吸取上清。保存于-80 冰箱内待测。按照 BCA 试剂盒所列步骤,建立 BSA 标准曲线,96 孔板加入样品与 BCA 工作液,37 孵育 2030 min,于562 nm 处检测 OD 值,根据标准曲线计算各样品眼球组织蛋白浓度。Western blot 所需的蛋白样品用含 Cocktail 蛋白酶抑制剂的 RIPA 组织裂解液提取制备,提取步骤及蛋白浓度检测步骤同上。2.7 眼球组织及血清中氧化应激标志物水平检测吸取 20 L 待测样品(制备过程 2.6),按照SOD、MDA、GSH 微量法检测试剂盒说明书进行操作,试剂盒中标准品进行梯度稀释后绘制标准曲线,采用酶标法在相应波长处测量吸光度 OD 值,并计算模型动物血清及眼球组织中相关因子表达。2.8 Western blot 法检测小鼠眼部组织目的蛋白表达将 2.6 中 RIPA 裂解液提取所获得的眼球组织蛋白样品,根据所测蛋白浓度加入 PBS 将各样品蛋白浓度稀释至相同水平。将蛋白上样缓冲液与蛋白样品按照 1 4 混合均匀,98 金属浴高温变性15 min,保存于-80 冰箱内待用。按照凝胶试剂盒所列实验步骤,制备 10%、12.5%的 PAGE 凝胶,上样后 120 V 恒压电泳跑至合适位置,切胶后转膜至 PVDF 膜,300 mA 恒流条件转相应时间,5%脱脂奶粉室温下摇床低速封闭2 h,Tris-buffered saline plus Tween(TBS-T)洗膜5 min3 次,孵育目的蛋白一抗 Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1(稀释比例 12 000),4 过夜。恢复室温 1 h 后用 TBS-T洗膜 15 min4 次,加入 2.5%脱脂奶粉稀释配制的二抗 HRP-Linked Anti-mouse IgG/HRP-Linked An-ti-rabbit IgG(稀释比例 110 000),室温下摇床低速孵育 1 h,TBS-T 洗膜 10 min6 次,ECL 显色液显色,凝胶成像曝光检测,利用 Image J 数字成像软件258南京中医药大学学报 2023 年 9 月第 39 卷第 9 期将条带图像进行可视化分析,以-actin 作为内参蛋白,分析计算目的蛋白条带相对灰度值。2.9 统计学方法采用 SPSS24.0 软件进行统计与分析,组间比较采用 One-way ANOVA,数据以P0.05 表示差异有统计学意义。3 结果3.1 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠眼底和视网膜的影响如图 1 所示,模型小鼠视网膜厚度与空白组小鼠相比显著变薄(P0.01),给予菊睛丸后,视网膜有相应增厚的趋势,其中 JJW-S-L 和 JJW-50-L 给药组小鼠视网膜厚度显著增厚(P0.05),与西药阳性药 AREDS2 作用趋势一致(P0.01),作用趋势优于中药阳性药杞菊地黄丸。注:与空白组比较,#P0.01;与模型组比较,P0.05,P0.01。xs,n=5,比例尺=200 m。图 1 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠视网膜厚度的影响Fig.1 Effect of Jujing Pills on retinal thickness of D-galactose injection induced subacute aging model mice 采用 HE 染色评价小鼠视网膜部细胞病理组织形态改变情况,如图 2 所示。空白组 HE 切片显示,小鼠 视 网 膜 厚 度 适 中,内 核 层(INL)、外 核 层(ONL)、丛状层(PL)均清晰可见,各层细胞排列规则、紧密,无炎细胞浸润。模型组小鼠 INL 显著变薄弯曲,部分呈现空泡状,ONL 细胞排列紊乱。感光细胞层局部变薄,RPE 细胞皱缩。菊睛丸提取物均可改善视网膜细胞排列紊乱,恢复视网膜厚度,并且对视网膜 ONL、INL 和 PL 厚度均具有显著的恢复作用。分别测量 ONL、INL、GL 的厚度发现,模型组小鼠视网膜各层厚度显著变薄(P0.05),菊睛丸提取物可以显著增加视网膜各层厚度(P0.05),与西药阳性药 AREDS2 有相同的作用趋势,JJW-S-L、JJW-50-L、JJW-50-H 的作用趋势略优于杞菊地黄358陆韫青,等:菊睛丸改善 D-半乳糖致亚急性衰老小鼠视网膜损伤效应评价与作用机制研究 第 9 期丸。以上病理学 HE 染色结果及视网膜各层厚度的测量结果表明,D-半乳糖注射导致小鼠视网膜细胞排列紊乱,视网膜 ONL、INL 和 PL 变薄,视网膜色素上皮细胞皱缩,菊睛丸水提物和 50%乙醇提取物均可恢复视网膜厚度,改善细胞排列紊乱情况。菊睛丸水提物低剂量组的作用趋势优于杞菊地黄丸。注:与空白组比较,#P0.05,#P0.01;与模型组比较,P0.05,P0.01。xs,n=5,比例尺=50 m。图 2 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠视网膜病理学染色及视网膜厚度的影响Fig.2 Effects of Jujing Pills on retinal pathological staining and retinal layer thickness of D-galactoseinjection induced subacute aging model mice3.2 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型动物眼球组织及血清氧化应激标志物水平的影响如图 3 所示,和空白组相比,模型组小鼠眼球组织中 SOD 活力和 GSH 含量显著下降(P0.01),MDA 含量显著上升(P0.01),表明 D-半乳糖模型动物眼部氧化水平显著增高。与模型组相比,菊睛丸水提取物及 50%乙醇提取物低剂量显著上调眼球组织中 SOD 活力(P 0.01)和 GSH 含量(P0.05,P0.01),显著下调 MDA 含量(P0.01)。提示菊睛丸可通过提高抗氧化酶的表达和降低氧化物的产生来发挥抗氧化作用,作用趋势与 AREDS2 一致,其中对 MDA 表达的效用优于杞菊地黄丸。菊睛丸水提物在上调 SOD、下调 MDA 作用与醇提物的效用相当,上调 GSH 效用优于醇提物。458南京中医药大学学报 2023 年 9 月第 39 卷第 9 期注:与空白组比较,#P0.01;与模型组比较,P0.05,P0.01。xs,n=8。图 3 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠眼球组织氧化标志物水平的影响Fig.3 Effects of Jujing Pills on the levels of oxidation markers in eyeball tissues of D-galactoseinjection induced subacute aging model mice 对小鼠血清氧化应激标志物水平进行检测,考察氧化应激对小鼠全身状况的影响。如图 4 所示,和空白组相比,模型组小鼠血清中 SOD 活力和 GSH含量显著下降(P0.01),MDA 含量显著上升(P0.01),表明 D-半乳糖亚急性衰老模型动物全身氧化水平显著增高。与模型组相比,不同提取溶剂的菊睛丸提取物显著上调血清中 SOD 活力(P0.01)和 GSH 含量(P0.01),显著下调 MDA 含量(P0.01),作用趋势与 AREDS2 一致。菊睛丸 50%乙醇提取物低剂量组具有较优的作用趋势,并优于杞菊地黄丸。注:与空白组比较,#P0.01;与模型组比较,P0.01。xs,n=8。图 4 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠血清氧化标志物水平的影响Fig.4 Effects of Jujing Pills on the level of oxidation markers in serum of D-galactose injectioninduced subacute aging model mice3.3 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠眼球组织抗氧化蛋白表达的影响结果如图 5 所示,模型组小鼠 Nrf2 和 HO-1 蛋白表达较空白组显著下降(P0.05)。给药后,菊睛丸水提取物和 50%乙醇提取物能显著提高抗氧化蛋白 Nrf2 和 HO-1 表达(P0.05,P0.01),作用趋势与 AREDS2 一致,优于杞菊地黄丸。提示菊睛丸可通过调控 Nrf2/HO-1 抗氧化通路发挥抗氧化作用。菊睛丸水提物低剂量组具有较优的作用趋势。558陆韫青,等:菊睛丸改善 D-半乳糖致亚急性衰老小鼠视网膜损伤效应评价与作用机制研究 第 9 期注:与空白组比较,#P0.05;与模型组比较,P0.05,P0.01。xs,n=5。图 5 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠抗氧化蛋白 Nrf2 与 HO-1 表达的影响Fig.5 Effect of Jujing Pills on the expression of antioxidant proteins Nrf2 and HO-1 of D-galactoseinjection induced subacute aging model mice3.4 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠视网膜细胞凋亡的影响进一步采用 TUNEL 染色考察模型小鼠视网膜细胞凋亡情况。如图 6 所示,模型组小鼠视网膜细胞较空白组凋亡显著增强(凋亡细胞呈现绿色荧光,P0.01),给予菊睛丸水提取物和 50%乙醇提取物后,视网膜部细胞凋亡显著减少(P 0.05,P0.01),提示菊睛丸可以通过抑制细胞凋亡保护视网膜部细胞,作用趋势与西药阳性药 AREDS2 一致。菊睛丸水提物高剂量组具有较优的作用趋势。658南京中医药大学学报 2023 年 9 月第 39 卷第 9 期注:与空白组比较,#P0.01;与模型组比较,P0.05,P0.01。xs,n=5,比例尺=50 m。图 6 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠视网膜细胞凋亡的影响Fig.6 Effects of Jujing Pills on retinal cell apoptosis of D-galactose injection induced subacute aging model mice3.5 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠眼球凋亡通路蛋白表达的影响采用 Western blot 法检测小鼠眼球凋亡相关蛋白的表达,考察菊睛丸对凋亡相关通路的调控作用。如图 7 所示,模型组小鼠眼球 Bcl-2/Bax 比值显著降低(P 0.05),凋 亡 蛋 白 Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 表达含量显著增加(P0.05)。给予菊睛丸水提取物和 50%乙醇提取物后,Cleaved Caspase-3 和 Cleaved Caspase-9 表达显著下降(P0.05,P0.01),Bcl-2/Bax 比值显著上升(P0.05,P0.01),作用趋势与 AREDS2 一致。提示菊睛丸调节凋亡通路抑制眼球细胞凋亡。注:与空白组比较,#P0.05;与模型组比较,P0.05,P0.01。xs,n=5。图 7 菊睛丸对 D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠眼球凋亡通路蛋白表达的影响Fig.7 Effect of Jujing Pills on the expression of apoptosis-related proteins in the eyeballs of D-galactoseinjection induced subacute aging model mice4 讨论随着人类平均寿命延长和生育率下降,社会老龄化加剧。按照世界卫生组织标准,我国也即将步入中度老龄化社会15。因此,衰老引起的疾病逐步得到重视,衰老机制和抗衰老措施逐渐成为研究热点。氧化应激学说是目前公认的衰老假说,其核心内容是机体代谢产生的活性氧(ROS)攻击细胞内包括 DNA、蛋白质和脂质等在内的大分子物质而造成758陆韫青,等:菊睛丸改善 D-半乳糖致亚急性衰老小鼠视网膜损伤效应评价与作用机制研究 第 9 期氧化损伤,氧化损伤物质在体内的不断积累导致线粒体功能丧失与生物体衰老16。D-半乳糖本身存在于食物和人体内。长期接触高剂量 D-半乳糖可被半乳糖氧化酶催化转化为醛糖和过氧化氢,产生ROS 而导致氧化应激、炎性反应、线粒体功能障碍和细胞凋亡17。因此 D-半乳糖小鼠皮下注射常用于构建亚急性衰老动物模型而用于抗衰老研究或药物效用评价。在本研究中我们同样发现,D-半乳糖皮下注射导致小鼠视网膜 INL 层显著变薄弯曲,部分呈现空泡状,外核层细胞排列紊乱。感光细胞层局部变薄,视网膜上皮色素细胞皱缩,与干性 AMD临床视网膜萎缩具有高度相似性,同时该病理现象可被唯一推荐的干性 AMD 预防与控制膳食添加剂AREDS218所抑制。与公认的小鼠 NaIO3注射拟干性 AMD 模型19相比,该模型同时还兼具了衰老的因素,更符合 AMD 的实际病理情况。与自然衰老小鼠模型相比,实验周期也大大缩短,因此该模型可作为干性 AMD 病理研究与药物评价模型。中医认为,年事日高,精血暗耗,肝肾渐亏,水不涵木,阴虚火旺,肝阳上亢则疏泄失权,水谷不归正化则湿聚为痰,积聚眼底变生玻璃膜疣;同时,肾精亏虚,肝血不足,气血生化乏源,目睛失养,眼底萎缩,形成干性 AMD。病程进一步发展为肝失疏泄,木横伐土,肝失藏血之责,脾失摄血之权,导致津血不能循经,停留眼底形成瘀血痰湿,形成湿性 AMD。“肝肾不足,阴虚火旺”的病机贯穿于 AMD 病程发展全过程,因此,“滋肝补肾,平肝明目”也相应成为了干性 AMD 遣方用药的主要原则。菊睛丸最早以“傅延年酒”之名记载于唐代王冰元和纪用经,其功效为“利血气,耐老轻身,明目安神,养志,补劳伤”20,记载其具有延缓衰老与明目之效。局方则首次明确了菊睛丸在眼科的具体应用。此后,同样四 味 药 又 以“内 养 丸”“草 还 丹”(圣 济 总录21)与“菊花丸”(三因极一病证方论22)等同方异名见于多本代表性方书著作,且被描述为有清利头目,益寿延年之效,足见该方抗衰老与明目效用之确切。方中枸杞子滋肝血,益肾精,补肝肾阴而明目;肉苁蓉补肾助阳,润燥益精;巴戟天温阳助火,补益精血。三药相伍,阴阳既济,则肝血肾精得充而目明,本患得除。菊花疏风散邪,清热平肝,标患得解;又可籍其升散之功引三药上滋于目,补益肝肾明目之功益彰;复以其“清”之性防枸杞子、肉苁蓉滋腻碍脾,杜巴戟天温燥伤阴之患。同时,方中的枸杞子与菊花为滋肝肾阴常用药对,肉苁蓉与巴戟天为温补肾阳常用药对,共同伍用,不仅体现了中医理论“善补阳者,必于阴中求阳;善补阴者,必于阳中求阴”的治则,更与老年人精血亏虚,肾阳虚衰的体质特征丝丝入扣。与 AMD 的另一味常用中成药杞菊地黄丸偏于补肝肾阴23相比,似乎更吻合老年人易于阴阳两虚的体质特征。而本研究也发现,菊睛丸提取物在改善模型小鼠视网膜厚度、调控氧化应激与视网膜细胞凋亡等环节上,比杞菊地黄丸给药组有更好的改善趋势。现代研究表明,菊睛丸方中药味虽为药食同源类药材,但其所含成分对视疲劳缓解与视网膜保护具有显著效用。枸杞子中所含枸杞多糖可通过抗氧化、调节血管、神经保护以及免疫调节等多种途径发挥视网膜保护作用24;玉米黄质和叶黄素、类胡萝卜素类成分是国际公认的可显著降低白内障与晚期AMD 发生风险的物质25。菊花所含黄酮成分可抵御视网膜色素上皮细胞氧化损伤与细胞凋亡26。本课题组前期研究同样发现,枸杞子和菊花配伍可改善氢醌诱导的 AMD 小鼠视网膜 INL 紊乱,降低视网膜炎症因子的表达,降低多种因素损伤的视网膜部细胞凋亡,增加保护视网膜区细胞结构的完整性,且效用强于单独使用枸杞子27。相对而言,肉苁蓉与巴戟天中的成分对 AMD 的改善作用报道较少,更多则集中于抗衰老的研究,如巴戟天多糖具有抗氧化、抗衰老和免疫调节等功效28,肉苁蓉所含松果菊苷与多糖成分具有提升机体免疫力与调节免疫的效用29。上述研究均充分证明了菊睛丸在抗老年期视网膜退