口咽鳞状细胞癌中HPV DNA检测的研究进展.pdf

王润堃,陆汉强,黄秋生.口咽鳞状细胞癌中 HPV DNA 检测的研究进展J.中南医学科学杂志,2023,51(5):793-796.收稿日期 2022-12-13修回日期 2023-04-20基金项目 江苏省卫生健康委员会(22020056)作者简介 王润堃,硕士研究生,研究方向为头颈部鳞状细胞癌,E-mail 为 wa498192046 。陆汉强,博士,副主任医师,硕士研究生导师,研究方向为头颈部鳞状细胞癌,E-mail 为 。通信作者黄秋生,主任医师,硕士研究生导师,研究方向为头颈部鳞状细胞癌,E-mail 为 。DOI:10.15972/ki.43-1509/r.2023.05.044文献综述口咽鳞状细胞癌中 HPV DNA 检测的研究进展王润堃,陆汉强,黄秋生江苏大学附属医院耳鼻咽喉-头颈外科,江苏镇江 212000摘 要 随着世界范围对烟草、酒精危害认识的增加,烟草、酒精等高危因素引起的口咽鳞状细胞癌(OPSCC)的发病率在世界范围内有所下降,但人乳头瘤病毒(HPV)相关性 OPSCC 的发病率在逐渐上升,其造成的疾病负担也日益加重。目前已经开发了几种用于检测 OPSCC 中 HPV DNA 的方法,每种方法在灵敏度、特异度和操作难度上有着各自的优缺点。本文总结了目前具有前景的检测 OPSCC 中 HPV DNA 的方法,并对目前的研究进展进行综述。关键词 人乳头瘤病毒;口咽鳞状细胞癌;环介导等温扩增技术;数字液滴 PCR;第二代测序中图分类号 R739.8文献标识码 AResearch progress of HPV detection in oropharyngeal cancerWANG Runkun,LU Hanqiang,HUANG QiushengDepartment of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery,Affiliated Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang 212000,Jiangsu,ChinaABSTRACT With the increasing awareness of the harm of tobacco and alcohol worldwide,the incidence of squamouscell carcinoma of the oropharynx(OPSCC)caused by high risk factors such as tobacco and alcohol has decreased world-wide.However,the incidence of human papillomavirus(HPV)-related OPSCC is gradually increasing,and the diseaseburden caused by HPV is also increasing.Several methods have been developed to detect HPV DNA in OPSCC,andthese methods have their own advantages and disadvantages in terms of sensitivity,specificity,and operational difficulty.This article summarizes the current promising methods for the detection of HPV DNA in OPSCC and reviews the current re-search progress.KEY WORDS HPV;OPSCC;LAMP;ddPCR;NGS 口咽鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of theoropharynx,OPSCC)是头颈部鳞状细胞癌的重要组成部分,其常见于舌、咽后壁、腭扁桃体、软腭等部位1。OPSCC 分为两种:由吸烟和饮酒引起的 HPV阴性疾病和由性传播感染人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)引起的 HPV 阳性疾病2。1 口咽鳞状细胞癌的流行病学目前,OPSCC 的全球发病率基本保持稳定,但HPV(+)OPSCC 的发病率却在逐年增加,2021 年全球范围内 HPV(+)OPSCC 的发病率约为 33%3。但 HPV(+)OPSCC 的发病率在不同的区域有着较大的差异,尤其在发达地区,其发病率要明显高于烟草、酒精引起的 HPV(-)OPSCC4-5。造成这种差异的原因可能是发达地区的人群对于性行为思维方式的改变,特别是 20 世纪 50 年代至 60 年代发生的性革命,导致人们初次性行为的年龄降低,同时人们开始热衷于口交6。口交是诱发 HPV(+)OP-SCC 的最大因素7,口咽部感染 HPV 的风险很大程度上取决于近 3 个月来口交的性伴侣数量8。容易罹患 HPV(+)OPSCC 的人群大都有相似的特征,例如多为白种男性人,有过良好的教育及较高的社会地位,很少有吸烟或酗酒史9。397CN 43-1509/R 中南医学科学杂志 2023 年第 51 卷第 5 期2 HPV 的感染及发病机制HPV 通过性传播、母婴传播等途径感染皮肤或者黏膜,进而引起皮肤或黏膜的良、恶性肿瘤10。根据病毒对感染细胞的转化程度,HPV 可以分为两种亚型:高危险型和低危险型。在不同的亚型中,HPV-16、HPV-18 是引起 HPV 相关疾病的主要亚型。目前,HPV-16 被认为是导致 HPV(+)OPSCC的关键亚型1。HPV(+)OPSCC 好发部位大多位于舌根扁桃体和腭扁桃体,一方面其鳞状上皮可以成为遮蔽病毒的场所,另一方面也为病毒进入基底层提供路径11。持续感染是导致癌症发生的关键。当肿瘤抑制基因被破坏,就会出现恶性转化12。HPV 是一种无包膜的小分子环状 DNA 病毒,包括结构蛋白(L1、L2)和功能蛋白(E1、E2、E4、E5、E6、E7)13。E6 和 E7 是主要的癌蛋白,但其余的蛋白在病毒的复制过程中同样至关重要。例如 L1 和 L2 是病毒装配所必需的,而 E1、E2 和 E4 是病毒复制和调节复制所必需的13。E6 和 E7 已经被证实可以分别抑制肿瘤抑制基因肿瘤蛋白 53(tumor protein P53,TP53)和成视网膜细胞瘤基因(retinoblastoma gene,RB)。E6 通过抑制肿瘤抑制基因 TP53,从而促进细胞增殖。E7 通过介导 RB 使得被转录因子 E2F激活的细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂 INK4A 被抑制,从而促进细胞增殖,并连续导致 p16 过表达13。同时,E6 和 E7 之间也具有协同作用,E6 可以抵消 E2F 介导的凋亡,E7 可以保护 E6 免受INK4A 的抑制14。3 口咽鳞状细胞癌中 HPV DNA 的检测随着对 OPSCC 的研究不断深入,多项临床试验表明,HPV(+)OPSCC 对辐射的灵敏度要强于 HPV(-)OPSCC,并且预后更好15。随着根据 HPV 状态选择降级化治疗的证据不断增加,一些研究人员开始倡导针对 HPV(+)OPSCC 患者进行降级化治疗以提高患者的生活质量16。因此,检测 OPSCC患者病变部位的 HPV 具有潜在的治疗意义。目前针对 OPSCC 中 HPV DNA 检测的方法包括 HPVDNA/RNA 聚合酶链式反应(PCR)、p16 免疫组织化学(IHC)和 DNA/RNA 原位杂交(ISH)检测17。PCR 是目前检测 HPV DNA 的金标准,具有高特异度和灵敏度,但存在高成本、耗时长以及实验设备要求高等缺点18。p16 原位杂交的 IHC 染色是PCR 的替代检测标记,具有价格低廉的优点,但其灵敏度和特异度低于 PCR19。并且其结果存在病理学家的主观偏差,容易导致假阳性或者假阴性的发生19。因此,需要一种简单、省事且经济的方法用于检测 OPSCC 患者中 HPV 的状态和亚型。目前,拥有前景的 HPV DNA 检测方法包括环介导等温扩增技术、数字液滴 PCR 以及第二代测序技术,以下将对这三种方法进行一一阐述。3.1 环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)是一种应用等温条件扩增目标DNA 的技术,是一系列 PCR 检测方法的替代20。LAMP 通过设计 4 6 条特异度引物对目标基因的6 8 个不同区域进行识别,同时由于反应过程中焦磷酸镁的沉淀,结果通过肉眼即可观察,无需使用昂贵且耗时的凝胶电泳和分光光度法进行结果统计,不仅节省了费用而且缩短了检测的时间21。已有多种基于 LAMP 的方案用于疟疾及结核病的检测,并且证实其灵敏度和特异度与 PCR 相同22-23。Hagiwara 等24在 2007 年开始将 LAMP 用于检测HPV 高 危 亚 型 引 起 的 生 殖 器 病 变。随 后,Livingstone 等25提出可以将 LAMP 用于检测口咽鳞状细胞癌中 HPV 的高危亚型,指出 LAMP 具有与PCR 相当的灵敏度和特异度,通过使用 PCR 和LAMP 分别检测 OPSCC 中 HPV 的部分高危亚型,结果显示,相比于 PCR,LAMP 的平均灵敏度为99.4%,平均特异度为 93.2%。而最容易引起口咽鳞状细胞癌的 HPV-16、HPV-18,LAMP 检测的灵敏度和特异度分别为 97.6%、80.0%以及 100.0%、97.7%。但在这项研究并未完全指出 LAMP 的检测是否同 PCR 一样需要先进行 DNA 纯化。因此,Ro-hatensky 等26结果表明,LAMP 无需 DNA 纯化即可对 OPSCC 中的 HPV 亚型进行检测,进一步凸显了LAMP 在检测 OPSCC 中 HPV DNA 的潜力。3.2 数字液滴聚合酶链式反应数字液滴 PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是一种基于聚合酶链式反应(PCR)的新型技术。在进行传统的 PCR 操作前,将反应体系分成数个微小的液滴,每个液滴都包含 PCR 反应所需要的 DNA模板以及试剂,从而使得每个液滴都可以进行独立扩增27。与传统的 PCR 技术相比,ddPCR 可以在不使用校准曲线的情况下进行核酸定量,同时在模板浓度较低的情况下拥有比传统 PCR 技术更高的497ISSN 2095-1116 Medical Science Journal of Central South China,Vol 51,No 5,2023精确度、灵敏度以及检出率28。目前,使用 ddPCR 检测 HPV 的方案已经在多种组织样本中得到了证实。Schiavetto 等29通过ddPCR 检测使用福尔马林固定石蜡包埋处理的样本(FFPE)中 HPV DNA 的含量与 p16 IHC 进行对比,发现结果具有一致性。同时指出,p16 IHC 与ddPCR 联合使用时可以显著提高诊断 HPV(+)OP-SCC 的特异度,更好的进行预防、筛查和指导治疗29。Biron 等30使用市面上售卖的商用试剂盒从 OPSCC 组织、细针穿刺抽吸样本以及口咽拭子样本中提取足量的 HPV-16 RNA,通过与 p16 IHC 对比发现,ddPCR 检测 HPV E6/E7 的灵敏度和特异度分别为 91.3%和 100%。Isaac 等31在 OPSCC 患者的口咽拭子中检测到 HPV-16,并通过与 p16 IHC检测手术标本的结果对比发现,ddPCR 检测结果有92%的灵敏度和 98%的特异度,进一步表明了ddPCR 检测 HPV DNA 具有良好的灵敏度和特异度,且无需进行有创的组织活检。ddPCR 的缺点在于需要使用材料进行各亚型的独立检测。ddPCR 的一种替代方法是第二代测序技术,可以在一次测试中捕获多种亚型,并产生更高的灵敏度。3.3 第二代测序技术第二代测序技术(next-generation sequencing,NGS),又称为下一代测序技术。该技术是以第一代测序技术为基础,以低成本、99%以上的准确度,1次可对几百、几千个样本的几十万至几百万条 DNA分子同时进行快速测序分析32。基于第二代测序技术的病毒宏观基因组学弥补了传统检测方法的不足,有望成为研究病毒的有效技术33。Lee 等34在一项前瞻性研究中使用 NGS 评估HPV ct DNA 在监测局部晚期 HNSCC 患者在接受初次放化疗(CCRT)后疾病的反应。这项研究中共纳入 75 例 OPSCC 患者,其中实验组 47 例,对照组28 例。结果显示,NGS 检测 HPV ct DNA 在确定肿瘤组织中 HPV16 状态具有 100%的灵敏度和特异度。Lee 等35随后在 2020 年的一项前瞻性研究中使用 NGS 检测接受放化疗的肛门鳞状细胞癌患者血液中的 HPV DNA,结果显示 NGS 对血液中 HPVct DNA 的检测具有 100%的灵敏度和特异度。Sastre-Garau 等36指出,使用 NGS 检测不同肿瘤部位患者血液中不同 HPV ct DNA 的灵敏度和特异度分别为 95.0%和 98.1%;并指出临床分期与检测灵敏度呈正相关,T1 期肿瘤检出率为 72.7%,T2 为95.9%,T3/T4 为 100%;所有淋巴结阳性或转移阳性的肿瘤均为 HPV ct DNA 阳性(灵敏度为 100%,特异度为 97.4%)。4 小 结越来越多的研究表明 HPV 的状态可能会对OPSCC 的分期、治疗以及预后产生影响,特别是支持 HPV(+)OPSCC 患者降级化治疗的专家越来越多,选择合适的 HPV 检测方法愈发重要。目前HPV 的检测可以通过 PCR、p16 IHC 以及 ISH 单独或者联合使用来进行。PCR 是目前检测 HPV DNA的金标准,p16 IHC 是临床诊断中的替代标记物。但不论是 PCR 还是 p16 IHC 或者其他检测方法,每一种方法都有各自的优缺点。选择最佳的检测方法,需要考虑成本、耗时以及操作难度。目前尚未对 OPSCC 中 HPV DNA 的检测达成共识,但基于传统检测方法的新技术被不断开发出来,并有着较高的灵敏度和特异度。本文并未对传统的检测方法进行总结,而是将目光放在了目前具有前景的 HPVDNA 检测方法,但这些方法仍存在结果假阳性或者假阴性的可能。目前最有前景的检测方法是第二代测序技术,该项技术已经在 EB 病毒(epstein-Barrvirus,EBV)相关的鼻咽癌中显示出了巨大的前景,随着测序技术的不断发展,检测 HPV ct DNA 很有可能成为新的、有价值的 HPV 生物标记物。参考文献1 贾鑫华,苏征,李煜霏,等.人乳头瘤病毒相关头颈癌流行病学研究进展J.中国公共卫生,2022,38(11):1489-1493.2 袁硕卿,张奥博,董研博,等.人乳头状瘤病毒相关口咽鳞状细胞癌的特点及临床分析J.中国耳鼻咽喉颅底外科杂志,2021,27(6):691-697.3 CARLANDER A F,JAKOBSEN K K,BENDTSEN S K,et al.Acontemporary systematic review on repartition of HPV-positivity inoropharyngeal cancer worldwideJ.Viruses,2021,13(7):1326.4 LECHNER M,JONES O S,BREEZE C E,et al.Gender-neutralHPV vaccination in the UK,rising male oropharyngeal cancer rates,and lack of HPV awarenessJ.Lancet Infect Dis,2019,19(2):131-132.5 FARAJI F,RETTIG E M,TSAI H L,et al.The prevalence of hu-man papillomavirus in oropharyngeal cancer is increasing regardlessof sex or race,and the influence of sex and race on survival is modi-fied by human papillomavirus tumor statusJ.Cancer,2019,125(5):761-769.6 BAJOS 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