多年生黑麦草VQ家族基因的鉴定及分析.pdf

DOI：10.11913/PSJ.2095-0837.23072王阳，孙振婷，胡涛，李吉涛.多年生黑麦草 VQ 家族基因的鉴定及分析J.植物科学学报，2024，42（1）：4855Wang Y，Sun ZT，Hu T，Li JT.Identification and expression analysis of VQ family genes in Lolium perenne L.J.Plant Science Jour-nal，2024，42（1）：4855多年生黑麦草 VQ 家族基因的鉴定及分析王 阳1,2，孙振婷2,3，胡 涛4，李吉涛1*（1.生物资源保护与利用湖北省重点实验室（湖北民族大学），湖北恩施 445000；2.中国科学院武汉植物园，武汉 430074；3.中国科学院大学，北京 100049；4.兰州大学草地农业科技学院，兰州 730000）摘要：VQ（Valine-glutamine）是植物特有的一类蛋白，在植物生长发育及抵御生物与非生物胁迫中发挥着重要作用，但在多年生黑麦草（Lolium perenne L.）中鲜有 VQ 基因的相关研究报道。本研究利用生物信息学方法在多年生黑麦草基因组中鉴定了 52 个 LpVQ 基因，其不均匀地分布于 7 条染色体上。亚细胞定位结果显示，LpVQ 蛋白主要定位于细胞核，仅 LpVQ45 定位于细胞膜。系统进化分析表明，LpVQ 基因被分为 7 个亚家族，与拟南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.）只存在 4 对直系同源基因。基因结构分析结果表明，46 个 LpVQ基因无内含子。荧光定量 PCR 分析结果显示，从各亚家族中随机选取的 21 个 LpVQ 基因不同程度地响应黑暗、高温及盐胁迫，且在胁迫早期快速响应。关键词：多年生黑麦草；VQ 基因家族；非生物胁迫；表达分析中图分类号：Q943.2文献标识码：A文章编号：2095-0837（2024）01-0048-08Identification and expression analysis of VQ family genes inLolium perenne L.Wang Yang1,2，Sun Zhenting2,3，Hu Tao4，Li Jitao1*（1.Hubei Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization(Hubei Minzu University),Enshi,Hubei 445000,China；2.Wuhan Botanical Garden,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430074,China；3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China；4.College of Pastoral Agriculture Science and Technology,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China）Abstract：Valine-glutamine(VQ)is a plant-specific protein,which plays an important role in plant growth,de-velopment,and resistance to biotic and abiotic stresses.To date,however,little research has been conduc-ted on the VQ gene family in perennial ryegrass(Lolium perenne L.).In this study,52 LpVQ genes were iden-tified in the perennial ryegrass genome,which were unevenly distributed on seven chromosomes.Subcellularlocalization prediction indicated that LpVQ proteins were mainly located in the nucleus,with only LpVQ45 lo-cated in the cell membrane.Phylogenetic analysis showed that LpVQ genes were divided into seven subfami-lies and there were only four pairs of lineal homologous genes with Arabidopsis.Based on gene structureanalysis of the LpVQ gene family,88.46%of LpVQ genes had no intron.Finally,three LpVQ genes were ran-domly from each subfamily to observe the responses to dark,high temperature,and salt stress.The qRT-PCRanalysis LpVQ genes responded quickly in early stages of stress.This study provides a theoretical foundationfor further study on VQ family genes of perennial ryegrass under abiotic stress.Key words：Lolium perenne；VQ family；Abiotic stress；Expression analysis 收稿日期：2023-06-14，接受日期：2023-08-13。基金项目：湖北省自然科学基金项目（2021CFB555）；湖北民族大学博士启动基金项目（MD2019B016）；山东省重点研发计划项目（农业良种工程）（2022LZGC018）。作者简介：王阳（1998），女，硕士研究生，研究方向为园艺植物生理学（E-mail：）。*通信作者（Author for correspondence.E-mail：）。植物科学学报2024，42（1）：4855Plant Science Journalhttp:/ VQ（Valine-glutamine）是植物特有的一类蛋白，因其包含一个特有的保守基序 FxxxVQxLTG而得名（F：苯丙氨酸，V：缬氨酸，Q：谷氨酰胺，L：亮氨酸，T：苏氨酸，G：甘氨酸，x 代表任意氨基酸）1-3。首个 VQ 蛋白 SIB1（SIGMAFACTOR-BINDING PROTEIN1）在拟南芥（Ara-bidopsis thaliana(L.)Heynh.）中被发现4，随后，从拟南芥中又陆续鉴定出 33 个 VQ 蛋白。目前，科研人员已在茶（Camellia sinensis(L.)O.Ktze.）2、大豆（Glycine max(L.)Merr.）5、小麦（Triticumaestivum L.）6及烟草（Nicotiana tabacum L.）3中分别鉴定出 25、75、113 和 59 个 VQ 基因。VQ 蛋白在植物应答生物与非生物胁迫中发挥着重要作用7,8，其作用机制主要有两种。一是通过与 WRKY 转录因子相互作用发挥功能，如AtVQ23 和 AtVQ16 通过与 WRKY33 的 WRKY 结构域结合，增强后者与靶基因的结合能力，从而影响植物的抗病能力9。而 AtVQ9 与 WRKY8 互作抑制了 WRKY8 与 W-box 的结合活性，从而负调控植物的抗盐性10。在番茄（Solanum lycoper-sicum L.）叶片中，SlVQ7 与 SlWRKY37 互作可提高后者的稳定性，并转录激活其下游靶基因，从而正调控茉莉酸及黑暗诱导的叶片衰老11。二是作为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的磷酸化底物发挥作用12-14。如拟南芥 MKS1（AtVQ21）作为 AtMPK4 的底物，与 WRKY25 和 WRKY33相互作用，有助于激活 MPK4 调节的病原体防御反应3。多年生黑麦草（Lolium perenne L.）为禾本科早熟禾亚科黑麦草属植物，是世界上广泛种植的冷季型草坪草及牧草15，具有分蘖多、成坪速度快、粗蛋白含量高、耐牧性好等优点。多年生黑麦草在生长发育过程中常面临高温、盐碱、荫蔽等非生物胁迫，严重影响草坪质量和牧草品质。因此，鉴定多年生黑麦草 VQ 基因，探究其在应答非生物胁迫中的作用十分必要。然而，目前尚未见相关报道。本研究系统鉴定了多年生黑麦草 VQ 蛋白家族成员，并对其保守结构域、进化关系、共线性、亚细胞定位及其在高温、盐碱、黑暗等非生物胁迫下的表达模式进行了分析，研究结果旨在为进一步探讨 VQ 蛋白在多年生黑麦草生长发育及应答非生物逆境胁迫中的作用奠定基础。1材料与方法 1.1实验材料本研究以多年生黑麦草品种百灵鸟为实验材料。黑麦草种子于营养土（基质蛭石=11）中萌发，萌发后转移至光照培养箱，光周期为16 h/8 h（光/黑暗），温度为 25 /22（光/黑暗）。待植株生长 1 个月后进行黑暗、高温和NaCl 处理。黑暗处理的条件为：25 /22，24 h 黑暗，分别于处理 0、2、8 d 后取样。高温处理的条件为：42，光周期 16 h/8 h，分别于处理 0、1、24 h 后取样。NaCl 处理的条件为：25 /22，光周期 16 h/8 h，使用 200 mL200 mmol/L 的 NaCl 溶液进行浇灌，分别于盐处理 0、3、38 h 后取样。1.2多年生黑麦草 VQ 基因家族成员的鉴定以 Pfam 数据库中 VQ 结构域（PF05678）的隐马尔可夫模型（HMM）图谱作为查询，通过HMMER 搜索多年生黑麦草基因组，鉴定了可能的 VQ 蛋白序列。使用 Pfam 数据库（http:/pfam.xfam.org/）进一步确认了这些序列。在拟南芥基因组数据库（TAIR）中下载拟南芥全基因组序列及其注释信息。1.3多年生黑麦草 VQ 家族成员的理化性质及亚细胞定位使用在线网站（https:/web.expasy.org/com-pute_pi/）分析多年生黑麦草 VQ 蛋白的理化性质。使用 BIOINF（http:/ VQ 家族成员进行亚细胞定位预测。1.4多年生黑麦草 VQ 家族基因系统发育树构建使用MEGAX（http:/）软件的 ML 法构建系统发育树，进行系统发育分析，并用 iTOL（https:/itol.embl.de/）网站进行美化。1.5多年生黑麦草 VQ 保守基序及基因结构分析利用 MEME（https:/meme-suite.org/meme/tools/meme）网站对 VQ 蛋白的氨基酸序列进行保守基序分析。结合植物基因组序列和注释文件，用 TBtools 提取 VQ 基因的基因组序列及 CDS 序列，用 TBtools 软件工具中的 Gene Structure View进行可视化。第 1 期王 阳等：多年生黑麦草 VQ 家族基因的鉴定及分析49 1.6VQ 基因染色体分布及种内共线性分析结 合 植 物 基 因 组 序 列 和 注 释 文 件，使 用TBtools 软 件 工 具 中 的 Amazing Gene LocationFrom GFF3/GTF File 进行可视化，使用 TBtools软件工具中的 one step MCScanX 进行种内基因组比对，并用 Multiple Synreny Plot 进行可视化。1.7胁迫条件下多年生黑麦草 VQ 基因的表达模式分析利用 Trizol 试剂（Takara，大连）提取多年生黑麦草在不同非生物胁迫处理后的总 RNA。使用反转录试剂盒 Hifair 1st Strand cDNA Synthe-sis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）（Yeasen，上海）合成 cDNA。利用 Hieff qPCRSYBR Green Master Mix（High Rox Plus）试剂盒（Yeasen，上 海）在 Step One Plus Real-TimePCR Systems 系统上进行 qRT-PCR 反应。反应体系总体积为 20 L，包括 2 L cDNA，上、下游引物各 0.8 L，10 L SYBR，用 ddH2O 补足体积。反应程序为：95 预变性 5 min；95 变性 10 s，60 退火 20 s，72 延伸 20 s，40 个循环，系统自带熔解曲线。引物序列见附表 11），由擎科公司（擎科，武汉）合成，多年生黑麦草 eEF1A(s)为内参基因。采用 2Ct方法计算候选基因的相对表达量，实验设 3 次重复。利用 TBtools 绘制热图，进行表达模式分析。2结果与分析 2.1LpVQ 家族成员鉴定为了系统分析多年生黑麦草的 VQ 基因，以VQ 结构域（PF05678）为参考，从全基因组水平挖掘其 VQ 家族基因。结果显示，多年生黑麦草中共存在 52 个 VQ 基因。对这些基因的编码产物LpVQ 家族成员进行理化性质分析，发现 LpVQs的氨基酸长度介于 118427 aa，蛋白分子量范围为 11.6743.84 kD，等电点在 5.0111.6。通过BIOINF 在线网站对 LpVQ 家族成员进行亚细胞定位预测，发现 48 个蛋白定位在细胞核中，LpVQ22为叶绿体与细胞核共定位，LpVQ33 为细胞壁与细胞核共定位，LpVQ37 为细胞膜与细胞核共定位，而 LpVQ45 预测定位在细胞膜中（附表 22）。2.2LpVQ 家族系统进化树分析为了分析 LpVQs 的进化关系，利用多年生黑麦草的 52 个 LpVQ 蛋白和拟南芥的 34 个 AtVQ 蛋白共同构建系统进化树。结果显示，拟南芥与多年生黑麦草的 VQ 家族成员可划分为 7 个亚家族（），分别包含 5、8、6、11、12、6 和 4个 LpVQ 蛋白。亚家族中只包含 LpVQs，亚家族、和中含有较多的 LpVQ 家族成员，而AtVQ 家族成员则更多地归类于亚家族、和（图 1）。进一步分析发现，多年生黑麦草与拟南芥的 VQ 家族间存在 4 对直系同源基因，分别是 LpVQ6/AtVQ7、LpVQ11/AtVQ9、LpVQ50/AtVQ32 和 LpVQ5/AtVQ31。2.3LpVQ 家族成员保守基序和基因结构分析为了研究蛋白的结构多样性，利用 MEME 在线软件对 52 个 LpVQ 蛋白的保守基序进行分析，结果发现 17%的 LpVQs 含有 1 个 Motif，48%的LpVQs 含有两个 Motif，19%的 LpVQs 含有 3 个Motif，6%的LpVQs 含有4 个Motif，10%的LpVQs含有 5 个 Motif。所有家族成员均具有 Motif1，表明它是 LpVQ 家族的核心保守结构域（图 2）。此外，本研究用 TBtools 工具对 LpVQs 进行了基因结构分析。结果发现，46 个 LpVQ 基因没有 内 含 子，5 个 LpVQ 基 因 含 有 1 个 内 含 子（LpVQ24、LpVQ29、LpVQ31、LpVQ32、LpVQ52），仅有 1 个基因（LpVQ161）含有两个内含子（附图 13）。2.4LpVQ 家族成员染色体定位以及共线性分析染色体定位分析结果表明，LpVQ 基因分布在多年生黑麦草的 7 条染色体上，其中分布在 chr1上的有 7 个，占 13%，分布在 chr2 上的最多，为11 个，占 21%，分布在 chr3 上的为 5 个，占10%，分布在 chr4、chr6 和 chr7 上的基因均各有9 个，各占 17%，而分布在 chr5 上的最少，仅有2 个，占 4%（图 3）。为了了解 LpVQ 基因之间的进化关系，本研究对 VQ 家族成员进行了种内共线性分析。结果表明，3 对 VQ 基因之间存在共同进化关系，分别是LpVQ16 与 LpVQ36、LpVQ34 与 LpVQ38 以 及LpVQ14 与 LpVQ19（图 4）。13）如需查阅附件内容请登录植物科学学报网站（http:/）查看本期文章。50植 物 科 学 学 报第 42 卷 2.5LpVQ 基因响应非生物胁迫的表达模式分析从 7 个亚家族中分别随机选取 3 个 LpVQ 基因，检测其在黑暗、高温以及盐胁迫下多年生黑麦草中的表达量变化。结果显示，黑暗处理后，只有 4 个 LpVQ 基因的表达持续上调。大部分LpVQ 基因的表达量在黑暗处理 2 d 后下降，其中，LpVQ2、LpVQ8、LpVQ14、LpVQ22 及 LpVQ38的表达量在黑暗处理 8 d 后又显著上升（图 5：A）。42 高温处理后，LpVQ 的表达模式被分为3 类。LpVQ18、LpVQ8、LpVQ28、LpVQ2、LpVQ7、LpVQ4 及 LpVQ12 受 1 h 高温处理的显著诱导，而高温处理 24 h 后，其表达又显著下调。LpVQ9、LpVQ22、LpVQ15、LpVQ3、LpVQ42、LpVQ6、LpVQ10、LpVQ1、LpVQ38 的表达量在1 h 和 24 h 高温处理后均显著下降。LpVQ5、LpVQ27、LpVQ34、LpVQ14 和 LpVQ44 的表达量只在 24 h 高温处理后下降（图 5：B）。NaCl 处理 3 h 后，13 个 LpVQ 基因显著上调表达，其中 LpVQ4 的表达上升了 13 倍。而 Na-Cl 处理 38 h 后，大部分基因的表达明显下调。仅有 3 个基因的表达受盐诱导持续上调，分别是LpVQ8、LpVQ10 和 LpVQ38（图 5：C）。3讨论近年来，VQ 基因已经在多种植物中被发掘鉴定，包括拟南芥、水稻（Oryza sativa L.）、大豆和葡萄（Vitis vinifera L.）等16-19，而关于多年生黑麦草 VQ 家族基因的鉴定和分析还鲜见报道。本研究通过全基因组鉴定，得到 52 个多年生黑麦草LpVQ 基因，并系统分析了其理化特性、蛋白结构、图 1拟南芥和多年生黑麦草 VQ 家族成员系统进化树分析Fig.1Phylogenetic analysis of VQ family members in Arabidopsis thaliana and Lolium perenne第 1 期王 阳等：多年生黑麦草 VQ 家族基因的鉴定及分析51 LpVQ1Motif 3Motif 1Motif 8Motif 4Motif 7Motif 6Motif 9Motif 10Motif 5Motif 3LpVQ2LpVQ3LpVQ4LpVQ5LpVQ6LpVQ7LpVQ8LpVQ9LpVQ10LpVQ11LpVQ12LpVQ13LpVQ14LpVQ15LpVQ16LpVQ17LpVQ18LpVQ19LpVQ20LpVQ21LpVQ22LpVQ23LpVQ24LpVQ25LpVQ26LpVQ27LpVQ28LpVQ29LpVQ30LpVQ31LpVQ32LpVQ33LpVQ34LpVQ35LpVQ36LpVQ37LpVQ38LpVQ39LpVQ40LpVQ41LpVQ42LpVQ43LpVQ44LpVQ45LpVQ46LpVQ47LpVQ48LpVQ49LpVQ50LpVQ51LpVQ52050100150200250300350400450 aa35图 2LpVQ 家族成员的保守基序Fig.2Conserved motifs of LpVQ family members LpVQ49LpVQ20LpVQ50LpVQ36LpVQ34LpVQ4LpVQ52LpVQ23LpVQ40LpVQ39LpVQ38LpVQ16LpVQ48LpVQ11LpVQ31LpVQ45LpVQ35LpVQ33LpVQ37LpVQ13LpVQ29LpVQ18LpVQ24LpVQ8LpVQ7LpVQ43LpVQ21LpVQ15LpVQ25LpVQ26LpVQ2LpVQ22LpVQ51LpVQ9LpVQ44LpVQ42LpVQ12LpVQ30LpVQ28LpVQ27LpVQ17LpVQ10chr6chr7chr5chr4chr3chr2chr10 Mb50 Mb100 Mb150 Mb200 Mb250 Mb300 Mb350 MbLpVQ6LpVQ32LpVQ46LpVQ41LpVQ47LpVQ19LpVQ14LpVQ3LpVQ1LpVQ5图 3LpVQ家族成员的染色体定位Fig.3Chromosomal locations of LpVQ genes52植 物 科 学 学 报第 42 卷 图 4LpVQ家族成员之间的共线性分析Fig.4Collinearity analysis of LpVQ gene family members LpVQ44LpVQ3LpVQ7LpVQ27LpVQ4LpVQ15LpVQ28LpVQ34LpVQ10LpVQ42LpVQ22LpVQ2LpVQ38LpVQ8LpVQ14LpVQ12LpVQ5LpVQ1LpVQ60 d0 h1 h24 h0 h3 h38 h2 d8 dLpVQ18LpVQ8LpVQ28LpVQ2LpVQ7LpVQ4LpVQ12LpVQ9LpVQ22LpVQ15LpVQ3LpVQ42LpVQ6LpVQ10LpVQ1LpVQ38LpVQ5LpVQ27LpVQ34LpVQ14LpVQ44LpVQ281.200.900.600.3000.300.600.901.201.200.900.600.3000.300.600.901.201.20ABC0.900.600.3000.300.600.901.20LpVQ10LpVQ8LpVQ38LpVQ14LpVQ34LpVQ9LpVQ1LpVQ18LpVQ6LpVQ27LpVQ42LpVQ5LpVQ22LpVQ7LpVQ3LpVQ44LpVQ4LpVQ2LpVQ12LpVQ15A：黑暗处理；B：高温处理；C：NaCl 处理。红色、蓝色和黄色分别代表上调、下调和没有表达差异的基因。A:Dark treatment;B:Heat treatment;C:NaCl treatment.Red,blue,and yellow represent up-regulated,down-regulated,and no differentialgenes,respectively.图 5LpVQ基因响应黑暗、高温及 NaCl 胁迫的表达模式分析Fig.5Expression analyses of LpVQs under dark,high temperature and NaCl treatments第 1 期王 阳等：多年生黑麦草 VQ 家族基因的鉴定及分析53基因结构、共线性、进化关系以及响应逆境胁迫的表达模式。基因结构分析发现，88.46%的 LpVQ 基因无内含子，与之类似，在拟南芥16、水稻17、玉米（Zea mays L.）20和 马 铃 薯（Solanum tubero-sum L.）21中，无内含子的 VQ 基因分别占 88.2%、92.5%、88.5%和91.89%。而苔藓（Bryophyta）22中无内含子的 VQ 基因比例则远低于以上物种，仅为 28.0%，说明 VQ 基因可能在长期进化过程中丢失了内含子。系统进化分析结果显示，多年生黑麦草和拟南芥的 VQ 家族成员可被分为 7 个亚家族，且LpVQs 与 AtVQs 亲缘关系较远，只存在 4 对直系同源基因，分别是 LpVQ6/AtVQ7、LpVQ11/AtVQ9、LpVQ50/AtVQ32 和 LpVQ5/AtVQ31。根据拟南芥 VQ 基因的功能，可以推测多年生黑麦草中其直系同源 VQ 基因的功能。有研究指出，AtVQ9 作为 AtWRKY8 的抑制子，能提高拟南芥的耐盐性9，由此推测，其直系同源基因 LpVQ11可能也在多年生黑麦草抵御盐胁迫中发挥重要作用。VQ 基因在植物响应非生物胁迫中发挥着重要作用。如，过表达 PtVQ1 基因显著增强了转基因拟南芥的耐盐性23；而过表达 MdVQ37 则提高了转基因苹果（Malus pumila Mill.）对高温胁迫的敏感性24。本研究对黑暗、高温及盐胁迫处理下多年生黑麦草的 VQ 表达量进行了分析。结果显示，LpVQ 基因广泛响应黑暗、高温及盐胁迫，且大部分 LpVQ 基因均在胁迫初期即做出快速响应，这与西葫芦（Cucurbita pepo L.）8、黄瓜（Cucumissativus L.）25等物种中的研究结果相类似。然而，LpVQ 基因的表达模式在不同胁迫处理下也存在差异。如，LpVQ1 在黑暗胁迫处理后持续下调表达，而在高温和盐胁迫下持续上调表达，推测该基因可能在不同胁迫中发挥着不同的作用。尽管 LpVQ可能参与多年生黑麦草对黑暗、高温及盐等胁迫响应的调控，但其具体功能还需要进一步验证。综上所述，本研究对多年生黑麦草 VQ 基因家族成员进行了系统鉴定与分析，为后续验证 VQ 家族成员在多年生黑麦草应答生物或非生物胁迫中的功能提供了基础。参考文献：Wang YJ，Liu HL，Zhu DY，Gao YM，Yan HW，Xiang Y.Genome-wide analysis of VQ motif-containing proteins inMoso bamboo（Phyllostachys edulis）J.Planta，2017，246（1）：165181.1 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coding genes are ancient and non-plant-spe-cific with comprehensive expression regulation by variousbiotic and abiotic stressesJ.BMC Genomics，2018，19（1）：342.7 Xu K，Wang P.Genome-wide identification and expressionanalysis of the VQ gene family in Cucurbita pepo L.J.PeerJ，2022，10：e12827.8 Lai ZB，Li Y，Wang F，Cheng Y，Fan BF，et al.Arabidopsissigma factor binding proteins are activators of the WRKY33transcription factor in plant defenseJ.Plant Cell，2011，23（10）：38243841.9 Hu YR，Chen LG，Wang HP，Zhang LP，Wang F，Yu DQ.Arabidopsis transcription factor WRKY8 functions antago-nistically with its interacting partner VQ9 to modulate sali-nity stress toleranceJ.Plant J，2013，74（5）：730745.10 Wang ZR，Gao M，Li YF，Zhang JL，Su H，et al.The tran-scription factor SlWRKY37 positively regulates jasmonicacid-and dark-induced leaf senescence in tomatoJ.JExp Bot，2022，73（18）：62076225.11 Yuan GB，Qian Y，Ren Y，Guan YL，Wu XX，et al.The roleof plant-specific VQ motif-containing proteins：an ever-thickening plotJ.Plant 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