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基于网络药理学和分子对接技术探究虎杖治疗肺炎性咳嗽的作用机制201基于网络药理学和分子对接技术探究虎杖治疗肺炎性咳嗽的作用机制苏芳林1，罗鑫1，蒋学青1，陈彦洁1，向少伟1*，傅鹏1，2*（1.广西中医药大学，南宁 530200；2.广西壮瑶药重点实验室，南宁 530200）基金项目：广西自然科学基金面上项目（2020JJA140235）、广西壮瑶药重点实验室（桂科基字201432号）、广西自然科学基金面上项目（2021JJA140111）、壮瑶药协同创新中心（桂教科研201320号）、广西壮族自治区民族药资源与应用工程研究中心（桂发改高技函20202605号）、广西中医药重点学科壮药学（GZXK-Z-20-64）、广西一流学科中药学（民族药学）（桂教科研201812号）第一作者：苏芳林，在读硕士研究生，研究方向为内科疾病中西医结合防治研究*通讯作者：向少伟，教授，主任医师，医学博士，硕士研究生导师。研究方向为内科疾病中西医结合防治研究；傅鹏，教授，博士，主要从事中药及民族药的品种鉴定、质量控制与资源开发【摘 要】目的：运用网络药理学联合分子对接技术，研究中药材虎杖治疗肺炎性咳嗽的作用机制。方法：通过TCMSP、ETCM数据库筛选、预测、收集虎杖主要活性成分及作用靶点，通过DisGeNET、GeneCards、OMIM数据库筛选肺炎、咳嗽相关靶点。交集得到虎杖治疗肺炎性咳嗽疾病的关键交汇作用靶点；Cytoscape3.7.2软件构建“虎杖-肺炎-咳嗽”网络；交集靶点导入STRING数据库，构建得到“虎杖-肺炎-咳嗽”交集靶点的PPI网络。使用Cytoscape3.7.2软件CytoNCA组件对PPI网络进行网络拓扑分析，得到虎杖关键核心成分。交集靶点导入DAVID数据库，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，得到虎杖治疗肺炎性咳嗽的关键作用机制及功能路径。最后，进行分子对接以验证网络药理学预测结果。结果：筛选获得虎杖关键活性成分37个，对应靶点547个，得到疾病靶点3310个，PPI网络结果得到关键靶点3个。GO功能富集和KEGG通路富集分析结果显示，虎杖治疗肺炎性咳嗽的关键作用靶点主要集中在炎症反应、转运蛋白、酪氨酸激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶、PI3K-Akt信号通路、内分泌紊乱、EGFR酪氨酸激酶抑制剂等。分子对接验证结果显示AKT1与黄葵内酯的结合性能最高，表明其在治疗咳嗽的过程中发挥着重要作用。结论：通过网络药理学联合分子对接技术，分析证实了中药材虎杖可通过黄葵内酯、决明柯酮、毒扁豆次碱、喹诺啉、槲皮素、木犀草等化合物作用于GAPDH、ALB、AKT1等靶点发挥对肺炎性咳嗽的治疗作用。【关键词】虎杖；肺炎性咳嗽；网络药理学；分子对接Study on the mechanism of Polygonum cuspidatum in the treatment of pulmonary inflammatory cough based on network pharmacology and molecular docking techniqueSu Fanglin1，Luo Xin1，Jiang Xueqing1，Chen Yanjie1，Xiang Shaowei1*，Fu Peng1，2*（1.Guangxi University of traditional Chinese Medicine，Nanning，530200；2.Guangxi Key Laboratory of Zhuang and Yao Ethnic Medicine，Guangxi Nanning，530200）【Abstract】Objective：to study the mechanism of Polygonum cuspidatum in the treatment of pulmonary inflammatory cough by using network pharmacology combined with molecular docking technique.Methods：the main active components and targets of Polygonum cuspidatum were screened，predicted and collected by TCMSP and ETCM database，and the pneumonia and cough related targets were screened by DisGeNET，GeneCards and OMIM database.The key intersection targets of Polygonum cuspidatum in the treatment of pulmonary inflammatory cough diseases were obtained，the“Polygonum cuspidatum-pneumonia-cough”network was constructed by Cytoscape 3.7.2 software，and the intersection targets were imported into STRING database to construct the PPI network of“Polygonum cuspidatum-pneumonia-cough”intersection targets.The network topology of PPI network is analyzed by 筛选评价Identification&SourceGendingSwhyenz 202using Cyto NCA component of Cytoscape 3.7.2 software，and the key core components of Polygonum cuspidatum are obtained.The intersection target was introduced into DAVID database，and the key mechanism and functional pathway of Polygonum cuspidatum in the treatment of pulmonary inflammatory cough were obtained by GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis.Finally，molecular docking was carried out to verify the prediction results of network pharmacology.Results：37 key active components of Polygonum cuspidatum，547 corresponding targets，3310 disease targets and 3 key targets were obtained by PPI network.The results of GO function enrichment and KEGG pathway enrichment analysis showed that the key targets of Polygonum cuspidatum in the treatment of pulmonary inflammatory cough were inflammatory reaction，transporter，tyrosine kinase activity，protein serine/threonine kinase，PI3K-Akt signal pathway，endocrine disorder，EGFR tyrosine kinase inhibitor and so on.The results of molecular docking verification showed that AKT1 had the highest binding performance with anemone，indicating that it plays an important role in the treatment of cough.Conclusion：through the combination of network pharmacology and molecular docking technique，it is confirmed that Polygonum cuspidatum can exert its therapeutic effect on pulmonary inflammatory cough by acting on GAPDH，ALB，AKT1 and other compounds such as solanolide，cassia ketone，physostigmine，quinoline，quercetin and mignonette.【Keywords】Polygonum cuspidatum；pulmonary inflammatory cough；network pharmacology；molecular docking咳嗽作为临床常见的疾病症状，其多发于各种疾病中，主要是由于气管、咽喉、支气管黏膜、胸膜受炎症、异物、物理或化学性刺激所引起。中医治疗咳嗽多以传统中医基础理论为思想，结合五脏、五行、情志状态辩证论症进行诊治。中药材虎杖具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效。现代研究亦证实虎杖具有治疗咳嗽哮喘的作用。近年来网络药理学用于药物作用机制的初步预测，利用在线数据库，进行体外虚拟筛选，从而得到潜在的药效物质、作用靶点及通路，明确各层次间相互作用的联系程度1。本文利用网络药理学分析方法，探索中药材虎杖治疗咳嗽的关键活性成分及其作用靶点，并进一步阐明其相互作用机制，以期为临床应用虎杖治疗咳嗽及其相关疾病研究提供思路。1 材料与方法1.1虎杖活性成分的筛选及相关靶点的预测通过在中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP）、中医百科全书（ETCM）数据库检索“虎杖”活性成分。依照TCMSP数据库推荐标准，筛选出口服生物利用度（OB）20、类药性（DL）0.1的潜在活性成分，对ETC数据库化合物采用类药五原则，筛选得到潜在活性成分。将得到的所有潜在活性成分在PubChem中检索，以SMILE结构式为关键词，在Swiss Target Prediction数据库中进行潜在活性成分靶点的预测，得到虎杖化合物对应的潜在作用靶点。1.2 疾病候选靶点与交集作用靶点的筛选以“Cough”“pneumonia”为关键词，分别在DisGeNET数据库、GeneCards数据库、OMIM人类基因和遗传疾病的在线目录数据库中进行检索，合并靶点，删除重复值，使用生物信息学和进化基因组学在线作图软件映射，交集部分为虎杖-肺炎-咳嗽的交汇作用靶点。1.3“疾病靶点-化合物-靶点网络图”构建使用Cytoscape 3.7.2软件绘制出“虎杖-化合物-靶点”网络图，并进行可视化处理，分析得潜在关键化合物。1.4“虎杖-肺炎-咳嗽”交集靶点PPI网络构建将得到的“虎杖-肺炎-咳嗽”的交汇作用靶点导入STRING数据库选择“Homo sapiens”为种属，设置置信度值为0.4，然后导入Cytoscape 3.7.2软件中利用Cyto NCA组件进行网络拓扑分析并进行可视化，筛选Degree（DC）、Betweenness（BC）、Closeness（CC）大于均值的交汇靶点作为关键靶点。1.5 交集靶点的GO功能富集和KEGG通路富集分析将交汇作用靶点导入DAVID数据库，分别进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析以“P0.05”作为标准进行筛选，取前10个导入微生信数据可视化平台绘制条形图，对GO富集分析的生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）三个部分进行可视化分析。KEGG通路富集分析以“P0.05”作为标准进行筛选，取前10条通路进行可视化分析。1.6 虎杖核心成分-关键靶蛋白的分子对接在Pub Chem数据库中下载“1.3”项下关键化合物分子配体2D结构式；在PDB蛋白质数据库下载“1.4”项下前三关键靶点蛋白对应的蛋白晶体结构，分别用Py MOL软件（2.4.0版）、AutoDock Tools软件进行去水、基于网络药理学和分子对接技术探究虎杖治疗肺炎性咳嗽的作用机制203氢化处理，最后用AutoDock Vina软件完成关键化合物配体与关键靶蛋白晶体结构的对接。2 结果2.1虎杖活性成分的筛选及相关靶点的预测以OB20、DL0.1筛选，得到TCMSP数据库26个，ETCM数据库以类药五原则得到化合物19个，合并所有化合物，共得到虎杖活性成分37个。将得到的37个活性成分，导入Swiss Target Prediction数据库预测后去重，得到相关靶点共547个。2.2虎杖治疗咳嗽的潜在交集靶点。通过DisGeNET数据库、GeneCards数据库、OMIM人类基因和遗传疾病的在线目录数据库，共获取到3 510个与肺炎性咳嗽有关的靶点基因，其中281个虎杖与肺炎性咳嗽共同作用的交集靶点基因，见图1。图1 虎杖活性成分与咳嗽疾病交集靶点韦恩图2.2“虎杖-化合物-靶点复合网络图”构建及分析依照“1.1”与“1.2”项建立的网络关系文件，使用Cytoscape 3.7.2软件绘制得到“虎杖-化合物-靶点复合网络图”，见图2。利用软件中插件Network Analyzer功能，分析得到相关网络拓扑参数，并依照度值（Degree）排序筛选出排名前六的潜在活性成分作为核心化合物，见表1。图2 虎杖-化合物-靶点复合网络图注：中央红色三角形节点代表虎杖，左侧绿色菱形呈同心圆分布节点代表活性化合物，右侧蓝色椭圆形同心圆节点代表活性化合物靶点。表1 虎杖治疗肺炎性咳嗽的关键化合物信息表化合物中文名关键成分英文名PubChem CID度值黄葵内酯Ambrettolid5 365 703109决明柯酮Torachrysone5 321 977109毒扁豆次碱Physovenine442 113107喹诺啉Questinol147 621106槲皮素quercetin5 280 343105木犀草素luteolin5 280 4451042.3 虎杖-肺炎性咳嗽交集靶点PPI网络将281个交集作用靶点导入STRING数据库，得到初始PPI网络图，见图3A。利用Cytoscape 3.7.2软件中Cyto NCA组件进行网络拓扑分析，筛选出满足DC65.74、BC304.46、CC0.48的前六个靶基因，构建网络图及可视化，最后得到了由281个节点和4 618条边组成的PPI网络图，图3B。确定GAPDH、ALB、AKT1、EGFR、SRC、CASP3等6个为关键靶点，其中GAPDH、ALB、AKT1三者具有最高的度值，说明其发挥了重要关联性作用。图3 PPI网络图注：图A为初始PPI网络图，图B为经Cytoscape分析后网络图，中央三角形紫色节点为筛分后的关键靶蛋白。2.4 交集靶点的GO功能富集和KEGG通路富集分析将交集作用靶点导入DAVID数据库后GO功能富集分析，共获得条目数55个，其中生物过程（BP）层面12个，细胞组分（CC）层面125个，分子功能（MF）层面226个，取各层面前10条目绘制条形图结果，如图4。生物过程（BP）层面主要涉及肽基-酪氨酸磷酸化、蛋白质磷酸化、内毒素反应、刺激性反应、细胞凋亡负调控、炎症反应等。细胞组分（CC）层面涉及转运蛋白、胞质核周、质膜、胞胶、细胞质、受体复合体等。分子功能（MF）层面涉及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活筛选评价Identification&SourceGendingSwhyenz 204性、非膜跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、三磷酸腺苷结合、内肽酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、RNA聚合酶II转录因子活性、配体激活的序列特异性DNA结合等。KEGG通路富集分析获得富集信号通路166条，取前10条通路绘制气泡图，如图5。KEGG通路富集过程主要涉及通路有癌症细胞通路、癌症细胞中枢碳代谢、胰腺癌、PI3K-Akt信号通路、内分泌紊乱、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性等。图4 虎杖治疗肺炎性咳嗽交集靶点GO功能富集分析图5 虎杖治疗肺炎性咳嗽交集靶点KEGG通路富集分析2.5 分子对接验证为验证网络药理筛选所得关键化合物和关键靶点的作用效果，取虎杖-化合物-靶点复合网络图数据中度值排序前6的化合物与各靶蛋白晶体结构进行关联性分子对接，结果见表2。48次对接后结合能数值均小于-5.5 kJ/mol-1，结合分值越小表明化合物与靶蛋白结合程度越高。对接结果中黄葵内酯与3MVH结合度最高，推测黄葵内酯在虎杖治疗肺炎性咳嗽中发挥了重要作用，结合对接结果见图6。表2 分子对接结合分值表关键化合物关键靶点PDB ID配体结合能（kJ/mol-1）黄葵内酯GAPDH4WNINAD-9.56IQ6AW9-8.7ALB1E7APFL-11.51HK4T44-9.02BXKIMN-11.6AKT12UZS4IP-6.83MVHWFE-11.73QKKSMH-9.8木犀草素GAPDH4WNINAD-8.86IQ6AW9-8.7ALB1E7APFL-9.61HK4T44-8.42BXKIMN-10.2AKT12UZS4IP-6.13MVHWFE-10.63QKKSMH-9.4毒扁豆次碱GAPDH4WNINAD-8.86IQ6AW9-8.6ALB1E7APFL-9.01HK4T44-7.62BXKIMN-9.7AKT12UZS4IP-5.73MVHWFE-9.93QKKSMH-8.5槲皮素GAPDH4WNINAD-8.86IQ6AW9-8.2ALB1E7APFL-9.81HK4T44-8.42BXKIMN-9.9AKT12UZS4IP-5.93MVHWFE-103QKKSMH-9.4喹诺啉GAPDH4WNINAD-8.96IQ6AW9-8.2ALB1E7APFL-9.71HK4T44-8.22BXKIMN-10.0AKT12UZS4IP-6.23MVHWFE-11.13QKKSMH-9.4决明柯酮GAPDH4WNINAD-7.56IQ6AW9-7.2ALB1E7APFL-8.51HK4T44-7.22BXKIMN-8.7AKT12UZS4IP-5.53MVHWFE-9.43QKKSMH-8.1基于网络药理学和分子对接技术探究虎杖治疗肺炎性咳嗽的作用机制205图6 虎杖关键活性化合物与关键靶蛋白分子对接3 结论与讨论咳嗽的发生发展是综合辩证考虑五脏六腑，情志精气所处状态的不同而依照病程诸症来辩论诊治的。中草药虎杖，具有活血化瘀、排风祛湿、化痰止咳等作用2中医常用来辅助治疗咳嗽、肝炎、黄疸等疾病。研究显示从虎杖中分离得到的白藜芦醇对SARS-CoV2，3CLpro和PLpro病毒具有特异性和选择性抑制作用3。近年来，关于中药网络药理学多成分网络式作用疾病的治疗效果研究和验证已成为热点，被愈加重视。为探究中药材虎杖在治疗咳嗽疾病的活性化合物和潜在作用机制关系，本研究使用网络药理学方法来进行研究，并通过分子对接技术进行初步的结果验证。本研究中，发现黄葵内酯、决明柯酮、毒扁豆次碱、喹诺啉、槲皮素、木犀草素为中草药虎杖中治疗咳嗽主要发挥药效的核心活性成分。黄葵内酯，主要是作为工业芳香调味剂，未见明确具体药用价值。决明柯酮为-萘酚类衍生物，在医药行业主要作为消炎药、驱虫药、抗生素等药品的中间体原料。毒扁豆次碱作为毒扁豆碱的次级衍生物，具有治疗胆碱失调以及老年痴呆的作用4-7。喹诺啉又名-羟基大黄素-8-甲醚，可在肺炎等多种炎性疾病中发挥治疗作用8。孟海峰利用槲皮素联合瑞德昔韦和法匹拉韦治疗60例新型冠状肺炎重症住院（非ICU）患者，发现患者血清中ALP、q-CRP、LDH水平显著降低且连用槲皮素患者的血红蛋白水平和呼吸频率显著升高，说明其在治疗肺炎性疾病方面可发挥显著疗效9。木犀草素可增强精氨酸酶（Arg1）以及甘露糖受体（Mrc1）的表达，促进巨噬细胞M2极化，抑制巨噬细胞中促炎细胞因子产生发挥抗炎作用缓解慢性咽炎症状10。通过对虎杖-咳嗽交汇靶点PPI网络进行拓扑分析可知，排分最高的前三位核心靶点分别是GAPDH、ALB、AKT1。GAPDH蛋白又名肺炎链球菌磷酸甘油醛脱氢酶，存在于细菌的胞内并且可作为潜在的肺炎链球菌疫苗靶点发挥抗肺炎作用11。ALB白蛋白作为肺炎性患者诊断、预后评价指标联合用药检测具有重要意义12-14。AKT1可通过抑制NF-KB和C/EBP激活、ROS生成和AP-1/HO-1的产生来发挥抗炎作用15。为初步探究中草药虎杖治疗肺炎性咳嗽疾病的作用效果，对筛选得到的虎杖核心活性成分和发挥治疗肺炎性咳嗽作用的关键靶蛋白基因进行分子对接，表明黄葵内酯、决明柯酮、毒扁豆次碱、喹诺啉、槲皮素、木犀草素与关键靶蛋白基因GAPDH、ALB、AKT1有着较高结合性能，其中AKT1与黄葵内酯的结合性能最高，这表明其亦可能在治疗咳嗽疾病的过程中发挥着重要作用。以上结果也说明了中药材虎杖在防治肺炎性咳嗽的过程中，是通过各种关键核心成分的多作用、多靶点互作式网络联结方式来发挥作用的，本研究无疑也为探索虎杖在治疗各种急慢性肺炎和相关性咳嗽疾病的物质基础和分子机制层次上提供了一定的研究思路。此外中药材虎杖中一些关键核心化合物成分如虎杖苷、白藜芦醇等，网络和关联性分析后却未见突出，说明通过传统网络药理的筛选预测方式仍然存在不足，需要结合实验进一步完善验证说明。筛选评价Identification&SourceGendingSwhyenz 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