核桃铵态氮转运蛋白基因JrAMT2的功能分析.pdf

核桃铵态氮转运蛋白基因JrAMT2 的功能分析凡婷婷1,2，张佳琦2，刘会君2，王凤敏1,2，马宇航1,2，吴宇伟2，胡恒康2，黄有军1,2，李岩2，王克涛2，黄坚钦2，张启香1,2（1.浙江农林大学浙江省森林芳香植物康养功能研究重点实验室，浙江杭州311300；2.浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江杭州311300）摘要：【目的目的】研究高效利用氮素基因铵态氮转运蛋白基因 JrAMT2，对核桃 Juglans regia 的品种改良、快速生长及产量形成有重要意义。【方法方法】以核桃 JrAMT2 过表达幼苗为实验材料，对 JrAMT2 基因进行生物信息学分析。通过基因表达量和表型测定对核桃 JrAMT2 过表达植株生长发育、氮素吸收、叶绿素质量分数、叶绿素荧光进行理化分析。【结果结果】JrAMT2 基因在核桃 JrAMT2 过表达植株中稳定表达。与野生型相比，核桃 JrAMT2 过表达株系的株高、节间长、生物量等生长参数显著提高(P0.05)，核桃幼苗的株高、节间长增加，最高可增加 68.2%和 50.3%，植株地上部分、地下部分生物量显著增加，地上部分最高可增加 56.26%(鲜质量)和 56.26%(干质量)，地下部分最高可增加 344.38%(鲜质量)和 354.33%(干质量)；核桃 JrAMT2 过表达株系地下部分对铵态氮及硝态氮的吸收显著提高(P0.05)，最高可提高114.1%和 70.3%，其中 JrAMT2 基因介导了铵态氮从地下部分到地上部分的运输，地上部分铵态氮质量分数显著增加(P0.05)，最高可增加 59.1%；核桃 JrAMT2 过表达植株叶绿体表面积与单层细胞表面积比率、叶绿素质量分数显著增加(P0.05)，最高可增加 22.94%和 74.3%；对叶绿素荧光参数分析，核桃 JrAMT2 过表达植株叶片放氧复活体活性、量子产额、电子传递效率均显著提高(P0.05)。【结论结论】核桃 JrAMT2 基因在核桃幼苗生长发育、氮素吸收和光合作用中均有积极显著调控的作用，为进一步研究核桃快速繁育提供一定的理论依据，且为筛选优良品种奠定一定基础。图 9 表2 参 41关键词：核桃；JrAMT2；铵态氮转运蛋白；过表达；光合作用中图分类号：S722.3；Q781文献标志码：A文章编号：2095-0756(2024)01-0079-13FunctionalanalysisofammoniumnitrogentransportergeneJrAMT2inJuglans regiaFANTingting1,2，ZHANGJiaqi2，LIUHuijun2，WANGFengmin1,2，MAYuhang1,2，WUYuwei2，HUHengkang2，HUANGYoujun1,2，LIYan2，WANGKetao2，HUANGJianqin2，ZHANGQixiang1,2（1.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Forest Aromatic Plants-based Healthcare Functions,Zhejiang A&FUniversity,Hangzhou311300,Zhejiang,China;2.StateKeyLaboratoryofSubtropicalSilviculture,ZhejiangA&FUniversity,Hangzhou311300,Zhejiang,China）Abstract:ObjectiveTheobjectiveistostudytheefficientutilizationofnitrogengenesandtheammoniumnitrogentransporterproteinJrAMT2gene,whichisofgreatsignificanceforvarietyimprovement,rapidgrowth,andyieldofJuglans regia.MethodUsingJ.regia JrAMT2overexpression(OE)seedlingsasexperimental收稿日期：2023-05-10；修回日期：2023-09-19基金项目：浙江省重点研发计划项目(2021C02037)；浙江省农业新品种选育重大科技专项(2021C02066-12)；国家自 然 科 学 基 金 资 助 项 目(31971672，32171815，32101557)；浙 江 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目(LY18C150002)；浙江农林大学校级学生科研训练项目(S202210341173)作者简介：凡婷婷(ORCID:0009-0009-3643-6029)，从事果树分子生物学研究。E-mail:。通信作者：张启香(ORCID:0000-0002-6657-5101)，教授，博士生导师，从事植物发育分子生物学研究。E-mail:浙江农林大学学报，2024，41（1）：7991Journal of Zhejiang A&F Universitydoi:10.11833/j.issn.2095-0756.20230296materials,bioinformatics analysis was conducted on JrAMT2 gene.The growth and development,nitrogenabsorption,chlorophyllcontent,andchlorophyllfluorescenceofJ.regia JrAMT2-OEplantswereanalyzedthroughgeneexpressionlevelandphenotypedetermination.ResultFluorescencedetection,polymerasechainreaction,andfluorescencequantitativePCRwereperformedonJ.regiaJrAMT2-OEplantstoverifythattheJrAMT2geneisstablyexpressedinJ.regiaJrAMT2-OEplants.Comparedwiththewildtype,theplantheight,internodelength,biomassandothergrowthparametersofJrAMT2-OElinessignificantlyincreased,andtheplantheightandinternodelengthofJ.regiaseedlingsincreasedby68.2%and50.3%.TheabovegroundandundergroundbiomassofJrAMT2-OElinesincreasedsignificantly,withamaximumincreaseof56.26%(freshweight)and56.26%(dryweight)intheabovegroundparts,andamaximumincreaseof344.38%(freshweight)and354.33%(dryweight)intheundergroundparts.TheuptakeofammoniumnitrogenandnitratenitrogenintheundergroundpartofJ.regia JrAMT2-OEsignificantlyincreasedby114.1%and70.3%respectively.TheJrAMT2genemediatedthetransportofammoniumnitrogenfromtheundergroundparttotheabovegroundpart,andthecontentofammoniumnitrogenintheabovegroundpartincreasedsignificantly,upto59.1%.TheratioofchloroplastsurfaceareatomonolayercellsurfaceareaandchlorophyllcontentofJrAMT2-OEincreasedsignificantly,with the highest increase of 22.94%and 74.3%.The analysis of chlorophyll fluorescenceparametersshowedthattheactivity,quantumyieldandelectrontransferefficiencyoftheoxygen-reactivebodyintheleavesofJ.regia JrAMT2-OEplantssignificantlyimproved.ConclusionTheJrAMT2geneofJ.regiaplaysasignificantroleinthegrowthanddevelopment,nitrogenabsorptionandphotosynthesisofJ.regiaseedlings.Ch,9fig.2tab.41ref.Key words:Juglans regia;JrAMT2;ammoniumnitrogentransporterprotein;overexpression;photosynthesis核桃 Juglans regia为胡桃科 Juglandaceae 胡桃属 Juglans 植物1，其种仁含油量高，有“木本油料之王”的称号2。同时，核桃木材坚实，是良好的硬木材料。作为重要的经济林树种，核桃大多种植于土壤贫瘠的山坡沟坎，不与粮争地3。然而，核桃树体高大，与其他果树相比对矿质营养元素需求量较高，大量元素与核桃产量和品质形成紧密相关4，因此，提高核桃树体对矿质元素的吸收能力对于提高核桃产量和品质至关重要5。研究表明：在核桃树各器官中种仁的氮素质量分数最高，核桃树吸收累积的矿质营养元素中氮素被商品核桃(种仁、硬壳)携走的比例也最高，叶片次之6。可见，氮素可能是提高核桃产量和品质的关键营养元素。然而，过量施用氮肥会导致严重的环境问题，因此，提高氮素利用效率是提高核桃产量与品质的重中之重7。NH+4NO3NH+4NO3土壤中氮素主要分为无机氮和有机氮两大类，植物根系能够吸收利用的主要是无机氮，主要以硝态氮和铵态氮形式存在89。植物根系对无机氮转运调节途径可分为 2 种，即高亲和力(HATs)和低亲和力(LATs)的氮转运系统10，HATs在外部铵态氮()、硝态氮()浓度低于0.5mmolL1时介导吸收大部分的无机氮，而LATs则是在、浓度高于0.5 或1.0mmolL1时介导吸收无机氮10。植物对铵态氮和硝态氮的吸收主要由铵转运蛋白和硝酸转运蛋白介导。土壤中同时含有植物可吸收利用的硝态氮和铵态氮时，由于植物吸收硝态氮需要先将其还原成铵态氮后才能进行同化利用，消耗的能量更多，所以植物对铵态氮表现出明显的偏好性，而且当植物受盐胁迫及活性氧的伤害时，铵态氮具有缓解作用，因此，介导植物对铵态氮吸收的铵转运蛋白在植物氮同化中起着重要作用11。铵转运蛋白基因主要有两大类族，分为 AMT1 和 AMT2。在已知的铵转运蛋白中大部分AMT1家族的转运蛋白属于高亲和转运体12，如拟南芥 Arabidopsis thaliana 中有 6 个编码铵转运蛋白被鉴定，包括 5 个 AMT1 家族基因，1 个 AMT2 家族基因。AMT1 家族基因中，AtAMT1.1 和 AtAMT1.3 对拟南芥根系铵态氮吸收的贡献率最高，为 30%，AtAMT1.2、AtAMT1.5 对拟南芥根系高亲和铵态氮吸收的贡献率略低于 AtAMT1.1 和AtAMT1.313，AtAMT1.4 在花粉中特异性表达14，在水稻 Oryza sativa 铵转运蛋白基因家族中 AMT1 家族80浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日有基因 3 个，其中 OsAMT1.1 和 OsAMT1.2 为高亲和力转运体15；而AMT2家族以低亲和为主，在拟南芥 AMT2 家族基因中 AtAMT2.1在低亲和范围内适度促进拟南芥根系对铵态氮吸收，主要在铵从根部到地上部运输中发挥作用16。AMT2型蛋白通常在植物的不同组织中包括根、芽和叶中都有表达，如AtAMT2.1 基因在拟南芥各器官中均有表达，主要表达在拟南芥的维管束及上皮层17，在拟南芥中AtAMT2.1 与 AtAMT1s 之间还存在协同作用。此外，毛果杨 Populus trichocarpaPtAMT2.1 主要在叶片中，PtAMT2.2 在叶柄中高表达。除此之外，玉米 Zea mays18、番茄 Lycopersicon esculentum19、欧洲油菜 Brassica napus20等高等作物均鉴别出了 AMT 基因，但到目前为止，研究大多集中于高亲和的铵转运蛋白 AMT1 基因家族，对低亲和的铵转运蛋白 AMT2 基因家族的研究较少。因此，阐明 AMT2 的生物学功能和调控机制，对于提高核桃自身的氮效率和提高肥料利用效率都具有重要意义。本研究以核桃 JrAMT2 过表达株系为供试材料，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及生理检测的方法鉴定 JrAMT2 基因在核桃植株体内的表达模式，进一步对核桃 JrAMT2 基因进行生物学功能分析，为核桃优良品种选育提供理论依据。1材料和方法1.1植物材料实验材料来自浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室保存的核桃野生型(WT)以及课题组 2019 年获得的核桃 JrAMT2 过表达阳性植株21，其中 JrAMT2 基因构建于 PCMBIA1300 植物表达载体，载体抗性为卡那霉素(kanmycin，Kan)，利用根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciensGV3103 菌株介导将构建好的 35S:JrAMT2:GFP 过表达载体转化到核桃野生型体细胞胚中，植物筛选标记为潮霉素(hygromycin，Hyg)。本研究所用核桃组培苗为野生型体胚和 JrAMT2 过表达阳性体胚经脱水萌发获得，温室苗则由上述组培苗经生根、炼苗、驯化获得。1.2实验方法1.2.1生物信息分析运用SOPMA(https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)网站在线分析 JrAMT2 蛋白质二级结构，运用 TMHMM(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线软件对 JrAMT2蛋白进行跨膜结构域的预测，通过GSDS(http:/gsds.gao-lab.org/)软件在线分析 JrAMT2 基因结构。1.2.2植株的培养同一 JrAMT2 过表达阳性体胚萌出的植株为 1 个株系，选取 3 个核桃 JrAMT2 阳性株系，命名为 JrAMT2-1、JrAMT2-2、JrAMT2-3，每个株系继代培养至 50 株以上，培养条件：温度为25，湿度为75%80%，光照强度为 215klx，光照周期为 16h 光照 8h 黑暗，培养基为 Driver&Kunivuki&McGranahan(DKW)培养基。采用 2 步生根法获得核桃驯化植株，选取阳性体胚萌发后经 4 次继代培养的核桃组培苗作为实验材料。第 1 步进行根诱导，58cm 长的光生芽，转移到补充有 10mgL1吲哚丁酸钾(K-IBA)的 DKW 固体培养基，在黑暗中培养 7d，诱导根原基的发生；第 2 步，不定根诱导结束后将其转移到粗蛭石DKW 培养基比例(体积比)为 32 的固体培养基中，温度为 25，湿度为 75%80%，光照强度为 215klx，光照周期为 16h 光照 8h 黑暗，培养时间为 2128d，形成不定根，获得核桃不同株系生根植株22。核桃苗不定根形成后取出用清水冲洗，多菌灵浸泡，移栽到泥炭蛭石珍珠岩比例(体积比)为211 的混合土中，将移栽驯化成活后获得的核桃再生植株在温度为25，湿度为75%80%，光照强度为 215klx，光照周期为 16h 光照 8h 黑暗的条件下培养23，获得核桃不同株系温室植株。1.2.3核桃 JrAMT2 基因阳性鉴定选用阳性体胚萌发后经 4 次继代培养的核桃组培苗进行绿色荧光蛋白(GFP)检测、PCR 及 RT-qPCR 验证，引物见表 1。从再生植株顶芽开始向下截取1.5cm，培养 14d后观察植株表型，每个株系均 5 个生物学重复。选取植株顶芽、叶片、茎段混样提取 DNA 及 RNA。PCR反应程序为：94 预变性2min；98 变性 10s，55 退火温度30s，68 延伸2min，共32个循环；68 延伸7min，PCR反应产物进行质量分数为 1.2%琼脂糖凝胶电泳。使用TheiQ5Real-TimePCRDetectionSystem仪器进行 RT-qPCR，测定转基因植株中 JrAMT2 的相对表达量。反应程序为：95第 41 卷第 1 期凡婷婷等：核桃铵态氮转运蛋白基因 JrAMT2 的功能分析8110min；9510s，6031s，40个循环；9515s；601min；9530s；6015s。通过2Ct方法计算定量结果24。取核桃野生型及核桃 JrAMT2 过表达株系组培苗的根、茎、小叶，根纵切、茎横切临时切片分别放置于体视荧光显微镜(CarlZeissStereoD13coveryV12，AxioCamMRcsystem)在明场和蓝光(488nm)激发条件下利用ZENlite成像软件连续拍照2526。1.2.4生长参数、铵态氮和硝态氮测定分别选取生长状态一致的核桃野生型与 3 个核桃 JrAMT2 过表达株系组培苗，从顶尖向下剪取 1.5cm 茎段，含24 片复叶，培养 14d，每个株系均 5 个生物学重复，测量株高及节间数。选取长势相同的核桃野生型及 JrAMT2 过表达植株采用 2 步生根法驯化，移栽后用直尺测量统计不同株系生长 0、20、40d 的株高、节间长、叶片长度及叶片宽度。分别选取生长状态一致的核桃野生型与 3 个核桃 JrAMT2 过表达株系组培苗，培养 14d，采用 2 步生根法获得核桃生根植株，植株分为地上部分及地下部分 2 个部分，清洗植株，分别测定地上部分及地下部分鲜质量，于 105 下杀青，80 烘干至恒量，称取干质量。使用苏州科铭生物技术有限公司的植物铵态氮(ZATD-1-G)和植物硝态氮(ZXTD-1-G)试剂盒测定地上部分及地下部分铵态氮和硝态氮质量分数，每个株系均 5 个生物学重复。1.2.5植株叶绿体观察、叶绿素质量分数及叶绿素荧光测定分别选取生长状态一致的核桃野生型与3 个核桃 JrAMT2 过表达株系组培苗，取顶尖向下第 2 节间处复叶。将该叶片置于 0.35molL1氯化钠中研磨破碎至絮状，取悬液于高倍光学显微镜下观察，找到视野中单个完整的叶肉细胞，观察细胞中的叶绿体,使用 imageJ 软件计算叶绿体表面积与单层细胞表面积比率。每个株系均 5 个生物学重复。采用丙酮浸取法测定叶绿素质量分数。分别取 0.1g 核桃野生型与 3 个核桃 JrAMT2 过表达株系组培苗长势一致的叶片，剪碎，置于 15mL 离心管中，加入 10mL 体积分数80%丙酮溶液，于室温黑暗处浸提，直至管内材料褪色变白，以 80%丙酮溶液为对照，测定 663 和 646nm 处吸光值，每个株系均5 个生物学重复。wt=(wa+8wb)Vt(mFW1000)1，叶绿素a质量分数(wa)=20.3D(646)，叶绿素b质量分数(Cb)=8.04D(663)。其中：wt为叶绿素质量分数(mgg1)，Vt为提取液总体积(mL)，mFW为叶片鲜质量(g)，D(646)和 D(663)分别为 646 和 663nm 处的吸光度。叶绿素荧光测定使用 M-PEA(multi-functionplantefficiencyanalyser)多功能植物效率分析仪(英国Hansatech 公司)测定。选取生长状态一致的核桃野生型与 3 个核桃 JrAMT2 过表达株系温室苗由上向下第 3 片叶片暗处理 30min，在饱和脉冲光(5000molm2s1)下进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP 曲线)的测定和绘制。参照 SCHANSKE 等27的方法分析叶绿素荧光诱导动力学参数(JIP-test)。1.2.6数据分析利用 SPSS26 软件进行单因素方差分析(one-wayANOVA)和多重比较(邓肯法)，显著性水平为 0.05。使用 GraphPadPrism7.0 软件绘图。2结果与分析2.1核桃JrAMT2 基因生物信息学分析核桃JrAMT2 基因的全长为1464bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。经过美国国家生物技术信息中心(NCBI)在线序列比对显示：该基因的序列编码的氨基酸序列属于AmmoniumTransporterFamily，编码 487 个氨基酸(图 1)，蛋白分子量为 52.458kD，预测分子式为 C2433H3715N601O646S23，含有7418 个原子，理论等电点为 7.11，不稳定指数为 35.61，脂溶指数为 101.56，亲水性平均值为 0.472。该段蛋白质中包含 20 种常见氨基酸：亮氨酸质量分数最高，达到 11.7%，其次分别为甘氨酸 11.1%，丙氨酸 10.9%，缬氨酸 8.6%，半胱氨酸质量分数最低，仅为 1.0%。JrAMT2 蛋白中分别含有 29 个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和 29 个碱性氨基酸残基(Arg+Lys)(表 2)。表1引物Table1Primers引物序列(53)用途Actin-FGCCGAACGGGAAATTGTC内参Actin-RAGAGATGGCTGGAAGAGG内参QJrAMT2-FAGCAAATGGGGTTCCAGGTT定量QJrAMT2-RTGTCTCCCGCAGATAGAAGGTA定量GFP-FATGGTGAGCAAGGGCGAGGA鉴定GFP-RTTACTTGTACAGCTCGTCCA鉴定JrAMT2-FCATGAATACCACACCGGCCTA鉴定82浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日Jr04 01370_p1 1 ATGAACACTA CGGTGGCCTA TGGAGCTGTA AGCCCAGCCG TCCCACCATG GCTGAACAAG 61 MNTTVAYGAV SPAVPPWLNK GDNAWQMTAS TLVGIQSMPG LVILYASIVK KKWAVNSAFM121 ALYAFAAVLI CWVLVCYRMA FGDQLLPFWG KGAPALGQKF LVNRAKIPES NHTRDGTYET181 IEPFYPMATL VYFQFTFAAI TMILLAGSVL GRMNIKAWMA FVPLWLVFSY TVGAFSLWGG241 GFLYHWGVID YSGGYVIHLS SGIAGFTAAY WVGPRLKSDK ERFPPNNVLL MLAGAGLLWM301 GWSGFNGGAP YAANIDASIA VLNTNICAAT SLLVWTSLDV VFFGKPSVIG AVQGMMTGLV361 CITPGAGLVQ SWAAIVMGML SGSIPWVSMM VLHKKSTLLQ KVDDTLGVFH THAVAGLLGG421 LLTGLFAEPE LCALILPLSN TRGAFYGGSG GKQFFKQLVA AMFVAGWNLY STTLILLGIR481 LFIPLRMPDE DLAIGDDAVH GEEAYALWGD GEKYDPTKHG WNTSMYAQDI TVPSPYVADA541 RGVTINL*图1JrAMT2 基因氨基酸序列Figure1AminoacidsequenceofJrAMT2gene表2JrAMT2 基因氨基酸组成Table2CompositionofJrAMT2aminoacids氨基酸数量/个占比/%氨基酸数量/个占比/%氨基酸数量/个占比/%丙氨酸5310.90组氨酸91.80苏氨酸275.50精氨酸112.30异亮氨酸255.10色氨酸183.70天冬酰胺163.30亮氨酸5711.70酪氨酸173.50天冬氨酸153.10赖氨酸183.70缬氨酸428.60半胱氨酸51.00甲硫氨酸183.70吡咯赖氨酸00.00谷氨酰胺112.30苯丙氨酸244.90晒半胱氨酸00.00谷氨酸142.90脯氨酸244.90甘氨酸5411.10丝氨酸296.00对核桃 JrAMT2 蛋白跨膜区的预测结果表明：该蛋白 N 端在膜外，C 端存在膜内，共含有 11 个跨膜螺旋，跨膜螺旋区段分别位于 2446、5981、129151、158180、195214、227244、254276、288310、314333、346368 和 398420，推测 JrAMT2 属于跨膜蛋白，并在 N 端存在信号肽(图 2A)。对 JrAMT2蛋白二级结构的预测结果显示：JrAMT2 的氨基酸组成中有 4 种构象，其中-螺旋有201个氨基酸，占比43.12%；延伸链有93 个氨基酸，占比 19.10%；-转角有30 个氨基酸，占比6.16%；无规则卷曲有 154 个氨基酸，占比31.62%。JrAMT2铵转运蛋白主要由-螺旋和无规则卷曲组成(图 2B)。对 JrAMT2 基因结构的分析显示：JrAMT2 基因由 4 个外显子，3 个内含子组成。与拟南芥AtAMT2 基因相比，拟南芥基因结构多了 1 个外显子和 1 个内含子，与山核桃 Carya cathayensisCcAMT2 基因28、栓皮栎 Quercus suber QsAMT2 基因29相比，外显子和内含子数量相同，同源性较高(图 2C)。2.2核桃JrAMT2 过表达植株阳性验证在成功构建 35S:JrAMT2:GFP 的过表达载体并通过农杆菌介导转化核桃体胚后，对同一无性系JrAMT2 体胚经脱水萌发获得的再生植株进行阳性鉴定。利用 PCR 技术，以核桃 JrAMT2 过表达植株3 个株系(JrAMT2-1、JrAMT2-2 和 JrAMT2-3)DNA 为模板，进行外源 GFP 基因(729bp)的 PCR 验证，检测到大小约为750bp 的电泳条带，与 GFP 基因大小符合(图 3A)；进行目的基因 JrAMT2 加外源GFP 基因全长(2193bp)的 PCR 验证，检测到大小为 2000bp 的电泳条带，与目的基因大小符合(图 3B)；以核桃 JrAMT2 过表达植株 3 个株系的 cDNA 为模板，利用实时定量 PCR 技术对 JrAMT2 基因表达量进行检测，结果显示：核桃 JrAMT2 过表达植株 3 个株系 JrAMT2 基因相对表达量分别为野生型的 10.58、12.80 和 14.94 倍，显著上调(图 3C)，表明核桃 JrAMT2 过表达植株中 JrAMT2 基因稳定表达。对获得的过表达株系进行 GFP 荧光阳性鉴定，分别将核桃过表达及野生型幼苗(图 4A)的小叶、茎、根置于荧光体视显微镜下在波长为 488nm 蓝光激发下拍摄。结果显示：过表达植株的小叶、茎、根表面呈现均匀的绿色荧光，其中腋芽处荧光更明亮(图 4B16)，野生型核桃幼苗的小叶、茎、根在荧光下拍摄无绿色荧光激发(图 4B712)，说明 JrAMT2 蛋白在腋芽处积累。为进一步研究 JrAMT2 基因在第 41 卷第 1 期凡婷婷等：核桃铵态氮转运蛋白基因 JrAMT2 的功能分析83核桃幼苗中的表达，对过表达株系及野生型组培苗的茎段进行横切，根进行纵切后，进行 GFP 荧光检测，结果显示：核桃 JrAMT2 过表达植株茎段横切中呈现均匀的绿色荧光，其中在维管组织中荧光更明亮，野生型植株茎段横切面无绿色荧面光(图 4B112)；核桃 JrAMT2 过表达植株根段纵切面中呈现均匀的绿色荧光，且在维管组织中荧光更明亮，野生型植株根段纵切面无绿色荧光(图 4C18)。表明JrAMT2 基因在核桃幼苗的根和茎中均可稳定表达，其中 JrAMT2 蛋白在根和茎的维管束组织中积累。2.3核桃JrAMT2 基因的生物学功能分析2.3.1核桃 JrAMT2 过表达植株生长表型分析为了进一步研究核桃 JrAMT2 基因的生物学功能，将3 个 JrAMT2 过表达植株与野生型核桃植株培养 14d。结果表明：与野生型相比，核桃 JrAMT2 过表达植株均生长旺盛，株高显著增加，节间显著增长(P0.05，图 5A)。3 个 JrAMT2 过表达株系株高分别为3.87、4.23 和4.12cm，节间长分别为0.33、0.35 和0.34cm，野生型植株株高为3.30cm，节间长为0.28cm，与野生型相比，3 个 JrAMT2 过表达株系株高分别增加了 17.0%、28.0%和 29.0%(图 5B)，节间长分别增加了 19.0%、25.0%和 24.0%(图 5C)。综上所述，JrAMT2 过表达对核桃幼苗的生长有显著提高作用。1.21.00.80.6概率跨膜膜内膜外0.40.205000编码区非翻译区内含子氨基酸/个碱基数/kb外显子拟南芥 Arabidopsis thaliana AthAMT2山核桃 Carya cathayensis CcAMT2核桃 Juglans regia JrAMT2水稻 Oryza sativa OsAMT253ABC123456750100150200250300350400500450100150200位点250300350400450A.JrAMT2 蛋白的跨膜区；B.蛋白二级结构。蓝色.-螺旋；红色.延伸链；绿色.-折叠；黄色.无规则卷曲。C.JrAMT2 基因结构。图2核桃 JrAMT2 基因生物信息学分析Figure2BioinformaticsanalysisofJrAMT2geneinJ.regia野生型株系JrAMT2-1JrAMT2-2JrAMT2-305750 bpABCA.阳性植株外源 GFP 基因的 PCR 检验。B.目的基因 JrAMT2 加外源 GFP 基因全长的 PCR 检验。C.JrAMT2 基因的相对表达量。M.标记物(marker)；1.野生型对照；24.3 个核桃 JrAMT2 株系。不同小写字母表示不同株系间差异显著(P0.05)。M1234M12342 000 bp101520相对表达量dcba图3PCR和 RT-qPCR对核桃组培苗的 JrAMT2 基因的检测Figure3DetectionofJrAMT2geneinJ.regia tissuecultureseedlingsbyPCRandqRT-PCR84浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日1 cm野生型JrAMT2-1JrAMT2-2JrAMT2-3野生型JrAMT2-1JrAMT2-2JrAMT2-312314 d0 dWTJrAMT2-1 JrAMT2-2 JrAMT2-34A.对照植株与阳性植株在 0 和 14 d 的表型。B.对照植株与阳性植株在 14 d 的株高。C.对照植株与阳性植株在 14 d 的节间长。不同小写字母表示不同株系间差异显著(P0.05)。5ABC株高/cmcbaa00.10.20.30.4节间长/cm株系株系cbaa图5核桃 JrAMT2 过表达离体培养植株表型分析Figure5PhenotypicanalysisofJ.regia JrAMT2overexpressionplantinvitroculture对核桃 JrAMT2 过表达植株进一步驯化培养，成功获得核桃 JrAMT2 过表达温室苗。对其生长表型进行分析(图 6A)，定植后培养 40d，核桃 JrAMT2 过表达温室苗的株高、节间长、叶片长度、叶片宽度增加显著高于野生型(P0.05)。培养至第 20 天时，与野生型相比，核桃 JrAMT2 过表达温室苗 3 个株系株高分别增加 21.9%、26.0%和 24.6%(图 6B)，节间长分别增加 41.2%、27.7%和 26.3%(图 6C)，叶片长度分别增加 18.7%、16%和 30.7%(图 6D)，叶片宽度分别增加 41.3%、48.2%和 55.1%(图 6E)；培养至第 40 天时，与野生型相比，JrAMT2 过表达温室苗 3 个株系株高分别增加 53.6%、68.2%和 62.1%，节间长分别增加 37.2%、50.3%和 44.8%，叶片长度分别增加了 27.8%、34.1%和 49.3%，叶片宽度分别增加 24.3%、19.5%和 29.2%。综上所述，核桃 JrAMT2 过表达温室苗与野生型相比，株高、节间长、叶片大小均显著增加，进一步证明 JrAMT2 基因过表达加快了核桃的生长速度。2.3.2核桃 JrAMT2 过表达植株对氮素吸收分析为探究 JrAMT2 基因在核桃中是否存在差异表达，将35S-JrAMT2-GFP野生型蓝色荧光白光蓝色荧光白光A121 cm1 cm12125678343456789101112BCA.组培苗。1.核桃 JrAMT2 过表达植株;2.核桃野生型植株。B.组培苗外部荧光表达(标尺:2 mm)。13.分别为 JrAMT2 过表达植株白光下小叶、茎、根外形;46.分别为 JrAMT2 过表达阳性组培苗蓝色荧光下小叶、茎、根外形;79.分别为野生型白光下小叶、茎、根外形;1012.分别为野生型蓝色荧光下小叶、茎、根外形。C.组培苗显微结构荧光表达(标尺:500 m)。12.分别为核桃 JrAMT2 过表达植株白光下茎横切面、根纵切面;34.分别为 JrAMT2 过表达阳性植株蓝色荧光下茎横切面、根纵切面;56.对照组培苗白光下茎横切面、根纵切面;78.对照组培苗蓝色荧光下茎横切面、根纵切面。图4铵态氮转蛋白基因 JrAMT2 在核桃苗中稳定表达Figure4StableexpressionofammoniumnitrogentransferproteingeneJrAMT2inJ.regia第 41 卷第 1 期凡婷婷等：核桃铵态氮转运蛋白基因 JrAMT2 的功能分析85核桃野生型及核桃 JrAMT2 过表达植株进行 2 步生根，获得核桃 JrAMT2 过表达生根植株，将其分为地上部分与地下部分。与野生型相比，核桃 JrAMT2 过表达生根植株地下部分不定根生长旺盛(图 7A)。对核桃 JrAMT2 过表达植株地上部分及地下部分差异分析，分别提取 3 个核桃 JrAMT2 过表达株系生根植株地上部分及地下部分 RNA，利用实时定量 PCR 技术，分析地上部分及地下部分 JrAMT2 基因表达的差异。结果表明：3 个 JrAMT2 过表达株系地上部分 JrAMT2 基因表达量分别是野生型的 11.94、12.70 和 15.06 倍，地下部分 JrAMT2 基因表达量分别是野生型的 19.07、23.34 和 24.00 倍(图 7B)。对核桃野生型及 3 个 JrAMT2 过表达株系地上部分及地下部分进行干质量和鲜质量测定。结果表明：3 个JrAMT2 过表达株系地上部分鲜质量和干质量显著高于野生型(P0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加 23.45%、33.67%和 56.26%，干质量分别增加 23.45%、43.89%和 56.26%；3 个 JrAMT2 过表达株系地下部分干质量和鲜质量显著高于野生型(P0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加 222.65%、199.24%和 344.38%，干质量分别增加 222.65%、199.24%和 354.33%(图 7C)。基于核桃 JrAMT2 过表达植株表型变化，本研究进一步测定核桃 JrAMT2 过表达植株对硝态氮及铵态氮吸收。结果表明：与野生型相比，