单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第9期2023年9月Vol.45，No.9Sep.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202302005单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究曾成容1，刘馨1，张晨旭1，毕文文1，梅世慧1，何广霞1，张峻杰1，文明1,2*，周碧君1,2*，陈江凤1,2，姜海波1,2(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025)摘要：嗜水气单胞菌作为水产养殖业中的主要病原菌，严重危害该产业的发展。为探究单宁酸对嗜水气单胞菌的抑菌作用及其转录组的影响，本实验将单宁酸2倍倍比稀释(8滋g/mL8 192滋g/mL)后，测定单宁酸对嗜水气单胞菌ATCC 7966株的最小抑菌浓度(MIC)；将嗜水气单胞菌分别与不同浓度的单宁酸共培养，根据所测细菌OD600nm值(共测24 h)，绘制细菌的生长曲线。结果显示，单宁酸对嗜水气单胞菌的MIC为2 048滋g/mL；浓度低于64滋g/mL(临界值)单宁酸处理后不影响嗜水气单胞菌的生长。因此本实验采用64滋g/mL的单宁酸与嗜水气单胞菌ATCC 7966株共培养，每组重复4次，12 h后提取各组嗜水气单胞菌总RNA，反转录为cDNA后构建cDNA文库，再利用随机引物，经PCR扩增、定量后，采用Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序(RNA-Seq)。通过计算每个样品中rRNA的占比(rRNA%)及碱基的错误率对测序数据质控；采用Bowtie2将获得的各组嗜水气单胞菌测序数据与GenBank中嗜水气单胞菌ATCC 7966株参考基因组比对，分析它们之间的相似性。结果显示，各组测序样品的rRNA%和碱基错误率均分别低于0.8%和0.024%，且与参考基因组的相似性均大于99%，表明测序数据可靠，可以用于后续分析。采用edgeR、DESeq2和DESeq软件筛选并分析各组嗜水气单胞菌转录水平差异及显著差异的基因，采用Goatools和KOBAS软件对转录水平显著差异基因进行GO功能注释与KEGG信号通路的富集分析，利用RT-qPCR对转录水平显著上调和显著下调的各4个基因验证。结果显示：与对照组相比，单宁酸处理组嗜水气单胞菌中转录水平显著上调的基因144个，显著下调的基因104个，转录水平显著变化的基因主要集中在嗜水气单胞菌的VI型分泌系统(T6SS)、铁调控和TonB系统、ABC转运蛋白系统相关蛋白的编码基因。GO功能注释结果显示，单宁酸处理嗜水气单胞菌后共显著富集到88个GO term，38个生物学过程(BP)、10个细胞组分(CC)、40个分子功能(MF)，主要涉及蛋白质折叠、亮氨酸生物合成和代谢、铁载体生物合成和代谢、铁硫簇结合、金属簇结合、铁载体跨膜转运活性等。KEGG富集分析结果显示，单宁酸处理嗜水气单胞菌后的转录显著差异基因富集到5条信号通路，包括铁载体蛋白生物合成、硫胺素代谢、C5-支链二元酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成及脂质与动脉粥样硬化等。RT-qPCR验证结果显示，RNA-Seq与RT-qPCR结果基本一致。本研究首次分析了单宁酸处理嗜水气单胞菌后的转录组数据的变化，证实单宁酸主要影响嗜水气单胞菌支链氨基酸、铁载体及硫胺素的生物合成和代谢等信号通路，从而影响该菌的生理生化功能甚至毒力。本研究为全面探究单宁酸在防治嗜水气单胞菌感染中的作用及作用机制奠定了实验基础，同时也为探寻嗜水气单胞菌抗生素的替代品提供新思路。关键词：嗜水气单胞菌；单宁酸；转录组中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)09-0895-10Effect of tannic acid on the transcriptome of收稿日期：2023-02-11基金项目：贵州省科技计划项目(黔科合支撑20201Y104号、黔科合支撑2022YB142号)作者简介：曾成容(1998-)，女，贵州桐梓县人，硕士研究生，主要从事动物疫病诊断与兽医微生物学方向研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding author嗜水气单胞菌()作为可运动的革兰氏阴性菌，广泛分布于各种水生环境中，感染鱼类、两栖动物、爬行动物和哺乳动物后引起败血症、肠炎等，是一种典型的人兽共患病原菌1。ZENG Cheng-rong1,LIU Xin1,ZHANG Chen-xu1,BI Wen-wen1,MEI Shi-hui1,HE Guang-xia1,ZHANG Jun-jie1,WEN Ming1,2*,ZHOU Bi-jun1,2*,CHEN Jiang-feng1,2,JIANG Hai-bo1,2(1.College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Guizhou Animal Biological Products Engineering Technology Research Center,Guiyang 550025,China)Abstract:,as a major pathogen in aquaculture,seriously jeopardizes the development of the industry.Toinvestigate the antibacterial effect of tannic acid onand its transcriptome,the minimum inhibitoryconcentration(MIC)of tannic acid onATCC 7966 strain was determined after 2-fold serial dilution(8滋g/mL-8192滋g/mL)of tannic acid;was co-cultivated with different concentrations of tannic acid,and thegrowth curves were plotted according to the measured OD600nmvalues of the bacteria(measured for 24 hours).The results showedthat the MIC of tannic acid forwas 2048滋g/mL,tannic acid treatment at concentrations below 64滋g/mL didnot affect the growth of.Therefore,strain ATCC 7966 was co-culture with 64滋g/mLtannic acid,and each group was replicated four times.After 12 hours,the total RNA ofin each group wasextracted and reverse transcribed to construct a cDNA library,and then the transcriptomes were sequenced using the IlluminaHiSeq sequencing platform after PCR amplification and quantification using random primers.The quality control of sequencingdata was performed by calculating the percentage of rRNA(rRNA%)and the error rate of bases in each sample.The sequencingdata ofin each group were compared with the reference genome ofATCC 7966strain in GenBank by Bowtie2 to analyze the similarity between them.The results showed that the rRNA%and base error rates ofeach group of sequenced samples were lower than 0.8%and 0.024%,and the similarity with the reference genome was more than99%,indicating that the sequencing data were reliable and could be used for subsequent analysis.The edgeR,DESeq2 and DESeqsoftware were used to screen and analyze the genes with different and significantly different transcript levels in each group of,the Goatools and KOBAS software were used to perform GO functional annotation and KEGG signalingpathway enrichment analysis on genes with significant differences in transcript levels,and RT-qPCR was used to verify the fourgenes with significantly up-regulated and significantly down-regulated transcription levels.The results showed that compared withthe control group,144 genes were significantly up-regulated and 104 genes were significantly down-regulated in the tannicacid-treated group,and the genes with significant changes in transcription levels were mainly concentrated in the coding genes ofT6SS secretion system,the iron-regulated and TonB systems,and the ABC transporter system.GO functional annotation resultsshowed that a total of 88 GO terms,38 biological processes(BP),10 cellular components(CC),and 40 molecular functions(MF)were significantly enriched after tannic acid treatment of,mainly including protein folding,leucinebiosynthesis and metabolism,siderophore biosynthesis and metabolism,iron-sulfur cluster binding,metal-cluster binding,andsiderophore transmembrane transporter activity.KEGG enrichment analysis results showed that the differentially transcribed genesafter tannic acid treatment ofwere significantly enriched into five signaling pathways,including siderophoreprotein biosynthesis,thiamine metabolism,C5-branched chain dicarboxylic acid metabolism,and biosynthesis of valine,leucine,and isoleucine lipids and atherosclerosis.The results of the RT-qPCR verification showed the basic consistency between the tworesults.In this study,the changes of transcriptomic data after tannic acid treatment ofwere analyzed for thefirst time,confirming that tannic acid mainly affected the signaling pathways such as the biosynthesis and metabolism ofbranched-chain amino acids,siderophore,and thiamine in,which in turn affected the physiological andbiochemical functions and even the virulence of the bacteria.This study laid an experimental foundation for comprehensivelyexploring the role and mechanism of tannic acid in the prevention and treatment ofinfection,and alsoprovided new ideas for exploring alternatives to antibiotics against.Key words:;tannic acid;transcriptome中 国 预 防 兽 医 学 报2023年896曾成容，等.单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究第9期897其是一种条件致病菌，携带多种毒力因子，如II型、III型和VI型分泌系统(分别为T2SS、T3SS和T6SS)、外毒素和内毒素等2。其中由该菌引起的运动性气单胞菌败血症对水产养殖业危害极大，近年来给我国的水产养殖行业造成了严重的经济损失3。目前由嗜水气单胞菌感染造成的疾病主要依靠抗生素治疗，但由于抗菌药物的不合理使用甚至滥用、耐药菌株的传播及耐药基因的水平转移，导致嗜水气单胞菌的耐药性问题日益凸出4-5。因此迫切需要绿色、安全、高效的抗生素替代物来防治嗜水气单胞菌的感染。单宁酸(Tannic acid)是一种复杂的多酚有机物，它在酸、碱和酶的作用下释放没食子酸和葡萄糖，在水中具有高溶解度，是安全的食品添加剂6。单宁酸存在于许多植物和人类饮食中，如水果、葡萄酒、啤酒、茶、咖啡、谷物、坚果等中，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等作用7。已发现单宁酸作为一种有效的群体感应抑制剂(QSI)，通过抑制细菌生物被膜的形成和群体感应系统减弱细菌的毒力8。但关于单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究较少。RNA转录组学测序(RNA-seq)具有测序速度快、分辨率高等优点，现已被广泛应用9。因此，本实验在证明单宁酸能够抑制嗜水气单胞菌生长的前提下，将单宁酸与嗜水气单胞菌共培养，并以不加入单宁酸的嗜水气单胞菌作为对照，24 h后利用RNA-seq对各组嗜水气单胞菌测序，筛选两组细菌中转录水平显著差异的基因，并对转录显著差异基因进行GO功能注释和KEGG信号通路的富集分析，为单宁酸对嗜水气单胞菌抑菌机制及防治嗜水气单胞菌感染的抗生素替代药物的研究提供参考和新思路。1材料与方法1.1菌株及试剂嗜水气单胞菌ATCC 7966株购自宁波明舟生物科技有限公司。单宁酸(97.5%)购自上海麦克林生化科技股份有限公司；NB培养基购自杭州微生物试剂有限公司；TruSeq RNA文库构建试剂盒购自Illumina公司；核糖体RNA去除试剂盒购自Epicenter公司；SuperScriptTM双链cDNA合 成 试 剂盒、末端修复混合液购自Invitrogen公司；PhusionDNA聚合酶购自New England Biolabs公司；脱氧核糖核酸酶I、总RNA提取试剂、去基因组RT-PCR反转录试剂和RT-PCR反应试剂均购自TaKaRa公司。1.2单宁酸对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)和生长曲线的测定取嗜水气单胞菌ATCC 7966株于NB培养基中过夜培养12 h(28、170 r/min)。将单宁酸分别以8 192滋g/mL、4 096滋g/mL、2 048滋g/mL、1 024滋g/mL、512滋g/mL、256滋g/mL、128滋g/mL、64滋g/mL、32滋g/mL、16滋g/mL、8滋g/mL的终浓度加入96孔板中，再将嗜水气单胞菌菌液按1伊106cfu/mL的量加入各浓度的单宁酸中，同时设置阳性对照组(仅加细菌和培养基)和溶剂对照组(加DMSO、细菌和培养基)以及空白对照组(不加菌液)，所有组均设置3个重复，28培养24 h通过肉眼观察结果。以没有明显细菌生长的浓度为该菌的MIC。将嗜水气单胞菌过夜培养，将新鲜菌液OD600nm值调为0.3，按1伊106cfu/mL分别加入含不同浓度单宁酸(终浓度分别为128滋g/mL、64滋g/mL、32滋g/mL、16滋g/mL、8滋g/mL)的培养基中。设置上述溶剂对照组和阳性对照组，所有组均设置3个重复，28培养，每隔2 h测定OD600nm值，共测24 h，根据所测OD600nm值，绘制细菌的生长曲线。1.3各组细菌总RNA的提取与质控根据生长曲线测定的结果，选择单宁酸浓度为64滋g/mL进行转录组测序。向含嗜水气单胞菌ATCC 7966株的营养肉汤培养基中添加终浓度为64滋g/mL单宁酸，同时设置不添加单宁酸的嗜水气单胞菌为对照组，两个组各设置4个重复(CK1CK4；Con1Con4)，28培养12 h后，提取各组总RNA后利用DnaseI去除基因组DNA。使用Agilent2100生物分析仪测定提取的RNA质量，使用ND-2000定量后选择RNA样品质量符合OD260nm/OD280nm=1.82.0，OD260nm/OD230nm逸2.0，RNA完整值(RIN)逸6.5，23S rRNA颐16S rRNA逸1.0，浓度逸100 ng/滋L，总质量逸2滋g的样品用于后续cDNA文库的构建。1.4cDNA文库的构建、测序及测序数据的质控与分析采用Illumina公司的TruSeq RNA文库构建试剂盒构建RNA文库。采用rRNA去除试剂盒去除rRNA，并将mRNA随机断裂成200 bp左右的小片段，以mR-NA为模板，采用SuperScriptTM双链cDNA合成试剂盒将其反转录为cDNA，构建cDNA文库。再加入末端修复混合液将其补成平末端，并在3端添加一个碱基A连接测序接头。然后用尿嘧啶DNA糖基酶(UNG酶)消除含有脱氧尿苷三磷酸的cDNA第二链，从而使文库中只包含cDNA的第一链。再采用随机引物，利用Phusion DNA聚合酶经PCR扩增，共15个循环。使用TBS-380微型荧光计定量后，使用Illumina HiSeq测序平台(2伊150 bp)经RNA-seq双向测序，并质控数据。采用Blast法将质控后的各组测序reads(数据)与Rfam数据库比对，并依据Rfam数据库注释信息统计测序reads中rRNA的占比(rRNA%)。采用统计学方法计算所有测序reads的碱基错误率。采用Bowtie2将获得的各组嗜水气单胞菌测序数据与GenBank中嗜水气单胞菌ATCC 7966株基因组比对，分析它们之间的相似性。1.5各组嗜水气单胞菌转录差异基因的分析通过RSEM、FPKM和TPM软件分析各组样品转录水平的变化；利用edgeR、DESeq2和DESeq软件筛选与分析转录显著差异基因，并绘制相应的图。利用Goatools和KOBAS软件对各组嗜水气单胞菌转录差异基因进行GO功能注释和KEGG信号通路的富集分析。1.6各组嗜水气单胞菌转录差异基因的RT-qPCR验证根据GenBank中的、基 因 序 列，采 用Primer5.0软件设计各基因的RT-qPCR引物(表1)。为验证测序结果，随机选择转录水平显著上调和显著下调的各4个基因进行RT-qPCR验证。提取各组菌液总RNA，利用去基因组RT-PCR反转录试剂反转录为cDNA后作为模板，以表1中 的 相 应 引 物，采 用RT-qPCR检测。以基因为内参，实验设置3个重复。采用Excel软件分析各组实验数据，并采用 检验分析各组数据之间的差异性。*：0.05；*：0.01；*：0.001。2结果2.1单宁酸对嗜水气单胞菌MIC和生长曲线的测定将单宁酸分别以不同的终浓度加入96孔板中，再将新鲜嗜水气单胞菌菌液按1伊106cfu/mL加入各浓度的单宁酸中共培养24 h观察各组菌的生长。结果显示，溶剂对照组和阳性对照组细菌的生长速度基本一致，表明DMSO溶剂不影响嗜水气单胞菌的生长。当单宁酸浓度为2 048滋g/mL相应孔中无任何肉眼可见的细菌生长，与不加细菌的阴性对照基本一致；当浓度低于2 048滋g/mL时，相应孔中有明显的细菌生长，表明单宁酸对嗜水气单胞菌的MIC为2048滋g/mL。通过测定OD600nm值共测24 h绘制细菌的生长曲线，结果显示，阳性对照组和溶剂对照组的细菌的生长基本一致，表明溶剂DMSO对嗜水气单胞菌无抑制作用。浓度为128滋g/mL的单宁酸虽然在嗜水气单胞菌的生长稳定期完全不抑制其的生长，但在对数生长期时明显抑制嗜水气单胞菌的生长，但当单宁酸浓度为64滋g/mL时正好在该菌的各个生长时期均不抑制其的生长，该浓度及32滋g/mL、16滋g/mL、8滋g/mL的单宁酸组均与阳性对照组和溶剂对照组嗜水气单胞菌的生长速度基本一致(图1)，完全不抑制细菌的生长。表明浓度低于64滋g/mL时的单宁酸完全不抑制嗜水气单胞菌的生长。因此选用该浓度的单宁酸用于后续研究。2.2各组测序数据的质控及与参考基因组的比对结果将嗜水气单胞菌ATCC7966株与终浓度为64滋g/mL的单宁酸共培养，同时设置不添加单宁酸的对照组，经一系列操作后，采用RNA-seq双向测序并利用Illumina平台质控测序数据。采用Blast法将质控后的各组测序reads与Rfam数据库比对，并依据其注释信息统计测序reads中rRNA的占比。结果显示，8个样品中rRNA%均低于0.8%(该值15%为合格)。质控后各组测序reads的碱基错误率均低于0.024%(该值要0.1%)，各组嗜水气单胞菌基因组测序reads与GenBank中嗜水气单胞菌参考基因组序列的相似性均大于99%(表2)。表明测序数据可靠，可用于后续分析。表1RT-qPCR所用引物引物名称Primer namerpoB-FrpoB-RhybO-FhybO-RarcC-FarcC-RargF-FargF-RhutX-FhutX-Rmap-Fmap-RgroL-FgroL-RamoA-FamoA-RtssB-FtssB-R引物序列(5-3)Primer sequence(5-3)CCATCGAAACGCCTGAAGGTCGGTACGGGGTCTCAAGGAACCATTTCGCTGGAGTATCACGCCAGCACATACTTGCCCTTGTGATCGCTCAGGAGTACAACGTGCCTTGGTGTAGGCGCTGTTTATGGGTGAAGCGAAAGAAGCTGGTGGTCTCATCGTTGTGGGCATTGCACAACGCATTCATGGCGTACCACCTCCCATTCACAAGAAACTGCGGGAAGGGTGGTCTCACCCACGATGAACACAACAATGCCATCGCTCAGAGCTCGTCGTCCAAACCCTTGGATGCGTTTGCACAAGGGCCAAGCGGTAGGGAGAAGTAAGTTGAGCTTCCGTTGACCATTCCAGTGCGGATTCTTTCATTm 值Tm value58.259.656.158.158.058.455.857.654.659.656.958.656.059.456.660.256.754产物长度Product length/bp9710589145103104142149137中 国 预 防 兽 医 学 报2023年8982.3各组嗜水气单胞菌转录水平差异及显著差异基因的分析通过RSEM、FPKM和TPM软件分析各组样品基因的转录水平变化；利用edgeR、DESeq2和DESeq软件筛选与分析各组样品转录显著差异的基因。结果显示，单宁酸处理嗜水气单胞菌后共有4 330个转录差异基因，其中有4个特异转录差异基因，分别是、；对照组共有4 335个转录差异基因和9个特异转录差异基因，分别是、。两组均存在的转录差异基因有4 326个(图2)。与对照组相比，单宁酸处理组细菌中转录水平显著上调的基因144个，转录水平显著下调的基因104个(图3)。主要集中在嗜水气单胞菌的T6SS、铁调控、摄铁蛋白(TonB)系统、ABC转运蛋白编码基因等。T6SS分泌系统相关基因转录水平显著下调的有、。铁调控和TonB系统相关基因转录水平显著上调的有、。ABC转 运蛋白编码基因转录显著上调的有、。氢化酶生物合成相关基因转录水平显著上调的有、，显 著 下 调 的 有、。ATP合成相关基因显 著 上 调 的 有、显著下调生 物 有、。此外还有I型分泌系统基因显著下调，脂酰合酶基因显著上调等。综上表明，嗜水气单胞菌经单宁酸处理后存在转录水平显著差异的基因，主要是VI分泌系统T6SS、铁调控和TonB系统与ABC转运相关蛋白的编码基因，且各组组内重复性较好，可以进行后续的GO功能注释和KEGG富集分析。2.4各组嗜水气单胞菌转录差异基因的GO功能注释分析通过Goatool软件注释各组嗜水气单胞菌的GO功能，结果显示，主要分为分子功能(Molecularfunction，MF)、生物过程(Biological process，BP)和细胞组分(Cellular components，CC)。富集分析结果显示，共显著富集到38个BP、10个CC、40个MF(图4)。选择富集程度在前20的GO功能制成气泡图，结果显示，有13个BP主要涉及蛋白质折叠(Proteinfolding)、亮氨酸生物合成过程(Leucine biosyntheticprocess)、亮 氨 酸 代 谢 过 程(Leucine metabolic pro-表2各组测序reads的质控及与参考基因组序列的比对结果样品名称SamplenameCK1CK2CK3CK4Con1Con2Con3Con4各组测序 reads 的rRNA 占比(%)Percentage of rRNAin each set ofsequencing reads(%)0.480.370.280.410.750.370.380.420.02360.02350.02350.02340.02340.02340.02340.0234与参考细菌基因组的相似性(%)Similarity toreferencegenomes(%）99.0199.4099.4599.3099.2799.3799.3699.35曾成容，等.单宁酸对嗜水气单胞菌转录组影响的研究第9期899图1不同浓度单宁酸作用后嗜水气单胞菌的生长曲线DMSO control groupBlank control group128滋g/mL64滋g/mL32滋g/mL16滋g/mL8滋g/mLCulture time/hour2.01.51.00.50242220181614121086420图2各组嗜水气单胞菌转录差异基因的维恩图ConCK432694质控后碱基错误率(%)Base error rateafter QC(%)Notes：biological process：生物过程；regulation of transcription,DNA-templated：转录调节，DNA模板；translation：翻译；transmembranetransport：跨膜运输；phosphorelay signal transduction system：磷酰基信号转导系统；signal transduction：信号转导；carbohydrate metabolicprocess：碳水化合物代谢过程；Chemotaxis：趋化性；methylation：甲基化作用；peptidoglycan biosynthetic process：肽聚糖生物合成过程；cell wall organization：细胞壁组织；cellular_component：细胞组分；integral component of membrane：膜的组成成份；plasma membrane：细胞质膜；cytoplasm：细胞质；ribosome：核糖体；integral component of plasma membrane：细胞质膜组成成分；cell outer membrane：细胞外膜；membrane：膜；periplasmic space：壁膜空间；ATP-binding cassette(ABC)transporter complex：ATP结合区(ABC)转运蛋白复合体；extracellular region：细胞外区域；ATP binding：ATP结合；metal ion binding：金属离子结合；DNA binding：DNA结合；hydrolaseactivity：水解酶活性；molecular_function：分子功能；DNA-binding transcription factor activity：DNA结合转录因子活性；transmembranetransporter activity：跨膜转运活性；magnesium ion binding：镁离子结合；oxidoreductase activity：氧化还原酶活性；zinc ion binding：锌离子结合；4 iron,4 sulfur cluster binding：4铁，4硫簇结合图4各组嗜水气单胞菌转录显著差异基因的 GO功能注释结果cess)、铁 载 体 代 谢 过 程(Siderophore metabolic pro-cess)、铁载体生物合成(Siderophore biosynthetic pro-cess)、支链氨基酸生物合成(Branched-chain aminoacid biosynthetic process)、硫胺素化合物的代谢过程(Thiamine-containing compound metabolic process)、硫胺 素 化 合 物 的 生 物 合 成(Thiamine-containing com-pound biosynthetic process)等；5个MF主要涉及铁硫簇结合(Iron-sulfur cluster binding)、金属簇结合(Met-al cluster binding)、铁载体跨膜转运活性(Siderophoretransmembrane transporter activity)、未折叠蛋白结合(Unfolded protein binding)、ATP水 解 活 性(ATP hy-drolysis activity)等(图4)。(富集程度在前20位的GO项目中未富集到CC功能)(图5)。结果表明经单宁酸处理后可能影响嗜水气单胞菌的亮氨酸、铁载体及硫胺素的生物合成和代谢等功能。图3各组嗜水气单胞菌转录显著差异基因的火山图log2(fold change)UpUnchangedDownSignificant2.5各组嗜水气单胞菌转录差异基因的KEGG富集分析KEGG富集分析显示，有5条主要的信号通路被显著富集，分别是铁载体蛋白生物合成(Biosyn-thesis of siderophore group nonribosomal peptides)、硫胺素代谢(Thiamine metabolism)、C5-支链二元酸代谢(C5-branched dibasic acid metabolism)、缬氨酸、亮1301201101009080706050403020100121086420-2-4-6中 国 预 防 兽 医 学 报2023年900Biological processCellular componentmolecular functionNotes：Biosynthesis of siderophore group nonribosomal peptides：铁载体非核糖体肽生物合成；Thiamine metabolism：硫胺素代谢；C5-Branched dibasic acid metabolism：C5-支链二元酸代谢；Valine,leucine and isoleucine biosynthesis：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；Lipid and atherosclerosis：脂质与动脉粥样硬化；Arginine biosynthesis：精氨酸生物合成；Tuberculosis：肺结核；Butanoate metabolism：丁酸代谢；Longevity regulating pathway-multiple species：长寿调节途径-多物种；Bacterial chemotaxis：细菌趋化性；Two-component system：双组分系统；Selenocompound metabolism：硒化合物代谢；Pyruvate metabolism：丙酮酸代谢；Necroptosis：坏死性凋亡；Nitrotoluene degradation：硝基甲苯降解；Longevity regulating pathway-worm：长寿调节途径-蠕虫；Biofilm formation-：生物膜形成-铜绿假单胞菌；Pantothenate and CoA biosynthesis：泛酸和辅酶A生物合成；Sulfur relay system：硫磺中继系统；Nitrogen metabolism：氮素代谢图6各组嗜水气单胞菌转录显著差异基因的KEGG富集分析气泡图iron-sulfur cluster binding：铁硫簇结合；metal cluster binding：金属簇结合；protein folding：蛋白质折叠；siderophore transmembranetransporter activity：铁载体跨膜转运活性；unfolded protein binding：未折叠蛋白结合；leucine biosynthetic process：亮氨酸生物合成过程；leucine metabolic process：亮氨酸代谢过程；siderophore metabolic process：铁载体代谢过程；siderophore biosynthetic process：铁