miR-145抑制CaMKⅡ_NF-κB_NLRP3信号通路激活改善心肌肥厚的研究.pdf

论 著 d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 1-8 3 4 8.2 0 2 3.1 2.0 0 1m i R-1 4 5抑制C a MK/N F-B/N L R P 3信号通路激活改善心肌肥厚的研究*吴浩亮1,2,3,陶 波1,2,3,崔胜宇1,2,3,易 欣1,2,3,冯高科1,2,3,吴青青1,2,3,孟祥平4,徐 林5(1.武汉大学人民医院心内科 4 3 0 0 6 0;2.武汉大学心血管病研究所 4 3 0 0 6 0;3.心血管病湖北省重点实验室,武汉 4 3 0 0 6 0;4.湖北省武汉市第四医院老年病科 4 3 0 0 6 0;5.武汉大学人民医院老年病科 4 3 0 0 6 0)摘要 目的 研究微小R NA-1 4 5(m i R-1 4 5)是否可以通过减少炎症小体激活来改善心肌 肥厚。方法 将2 4只8周龄健康S D大鼠分为4组:假手术组(s h a m组)、主动脉缩窄(T A C)手术组(T A C组)、注射装载有m i R-1 4 5腺病毒的T A C手术组(T A C+m i R-1 4 5组)、注射阴性对照病毒的T A C手术组(T A C+N C组)。m i R-1 4 5和阴性对照病毒经颈静脉注射进入大鼠体内。病毒注射1周后通过T A C构建大鼠病理性心肌肥厚模型,采用超声心动图和心脏苏木素-伊红(HE)染色评估心肌肥厚程度。从新生乳鼠心脏中分离提取原代心肌细胞,将腺病毒转入原代心肌细胞中,并使用血管紧张素(A n g)诱导原代心肌细胞肥厚。通过核因子-B(N F-B)和细胞内活性氧(R O S)荧光染色检测心肌细胞中炎症和氧化应激水平。细胞TUN E L染色检测心肌细胞焦亡水平。实时荧光P C R和蛋白免疫印迹技术检测m i R-1 4 5和相关蛋白的表达水平。结果 与s h a m组比较,T A C组术后2周大鼠心肌肥厚程度明显增加(P0.0 5),而T A C+m i R-1 4 5组大鼠心肌肥厚程度则较T A C+N C组有明显减轻(P0.0 5)。细胞实验发现血管紧张素刺激的心肌细胞肥厚程度明显(P0.0 5),m i R-1 4 5过表达时心肌细胞肥厚程度明显改善(P0.0 5);m i R-1 4 5下游分子C a MK磷酸化水平明显下降(P0.0 5);N F-B的磷酸化水平及细胞内活性氧水平也较T A C+N C组明显降低(P0.0 5)。在原代心肌细胞中过表达m i R-1 4 5可以降低炎症小体N L R P 3及下游分子C a s p a s e-1,I L-1和I L-1 8的表达水平。结论 过表达m i R-1 4 5减轻了压力超负荷诱导的心肌肥大,其机制可能与抑制C a MK/N F-B/N L R P 3信号通路的激活有关。关键词 微小R NA-1 4 5;心肌肥厚;焦亡;炎症;钙调蛋白依赖性蛋白激酶;NO D样受体蛋白3 中图法分类号 R 5 4 2.2 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 1-8 3 4 8(2 0 2 3)1 2-1 7 6 1-0 8U p r e g u l a t i o n o f M i R-1 4 5 c a n r e d u c e m y o c a r d i a l h y p e r t r o p h y b y r e d u c i n g c a r d i a c i n f l a mm a t i o n i n d u c e d b y C a MK/N F-B/N L R P 3 s i g n a l i n g a x i s a c t i v a t i o n*WU H a o l i a n g1,2,3,T A O B o1,2,3,C U I S h e n g y u1,2,3,Y I X i n1,2,3,F ENG G a o k e1,2,3,WU Q i n g q i n g1,2,3,MENG X i a n g p i n g4,XU L i n5(1.D e p a r t m e n t o f C a r d i o l o g y,R e n m i n H o s p i t a l o f W u h a n U n i v e r s i t y,W u h a n,H u b e i 4 3 0 0 6 0,C h i n a;2.C a r d i o v a s c u l a r R e s e a r c h I n s t i t u t e o f W u h a n U n i v e r s i t y,W u h a n,H u b e i 4 3 0 0 6 0,C h i n a;3.H u b e i K e y L a b o r a t o r y o f C a r d i o l o g y,W u h a n,H u b e i 4 3 0 0 6 0,C h i n a;4.D e p a r t m e n t o f G e r i a t r i c s,W u h a n F o u r t h H o s p i t a l,W u h a n,H u b e i 4 3 0 0 6 0,C h i n a;5.D e p a r t m e n t o f G e r i a t r i c s,R e n m i n H o s p i t a l o f W u h a n U n i v e r s i t y,W u h a n,H u b e i 4 3 0 0 6 0,C h i n a)A b s t r a c t O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e w h e t h e r m i c r o R NA-1 4 5(m i R-1 4 5)c a n i m p r o v e m y o c a r d i a l h y-p e r t r o p h y b y r e d u c i n g t h e a c t i v a t i o n o f i n f l a mm a s o m e.M e t h o d s A t o t a l o f 2 4 e i g h t-w e e k-o l d h e a l t h y S D r a t s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o f o u r g r o u p s:t h e s h a m o p e r a t i o n g r o u p(s h a m),t h e t r a n s v e r s e a o r t i c c o n s t r i c t i o n(T A C)o p e r a t i o n g r o u p(T A C),t h e T A C g r o u p i n j e c t e d w i t h m i R-1 4 5 a d e n o v i r u s(T A C+m i R-1 4 5),a n d t h e T A C g r o u p i n j e c t e d w i t h n e g a t i v e c o n t r o l v i r u s(T A C+N C).m i R-1 4 5 a n d n e g a t i v e c o n t r o l v i r u s w e r e i n j e c t e d i n t o r a t s v i a j u g u l a r v e i n.O n e w e e k a f t e r v i r u s i n j e c t i o n,t h e r a t m o d e l o f p a t h o l o g i c a l m y o c a r d i a l h y p e r t r o p h y w a s e s t a b l i s h e d b y T A C.E c h o c a r d i o g r a p h y a n d c a r d i a c h e m a t o x y l i n-e o s i n(HE)s t a i n i n g w e r e u s e d t o a s s e s s t h e d e g r e e o f m y o c a r d i a l h y p e r t r o p h y.P r i m a r y c a r d i o m y o c y t e s w e r e i s o l a t e d f r o m n e o n a t a l r a t h e a r t s,a n d a d-e n o v i r u s w a s i n t r o d u c e d i n t o p r i m a r y c a r d i o m y o c y t e s.A n g i o t e n s i n (A n g)w a s u s e d t o i n d u c e h y p e r t r o p h y o f-p r i m a r y c a r d i o m y o c y t e s.T h e l e v e l s o f i n f l a mm a t i o n a n d o x i d a t i v e s t r e s s i n c a r d i o m y o c y t e s w e r e d e t e c t e d b y N F-B a n d R O S f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g.TUN E L s t a i n i n g w a s u s e d t o d e t e c t m y o c a r d i a l p y r o s i s.R e a l-t i m e P C R a n d W e s t e r n B l o t t i n g w e r e u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f m i R-1 4 5 a n d r e l a t e d p r o t e i n s.R e s u l t s C o m p a r e d1671重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期*基金项目:国家自然科学基金项目(8 1 3 7 0 2 8 3;8 1 1 0 0 1 3 0)。作者简介:吴浩亮(1 9 9 7-),硕士,主要从事心肌重塑方面的研究。通信作者,E-m a i l:l i n x u 2 0 1 8w h u.e d u.c n。w i t h r a t s i n t h e s h a m g r o u p,t h e d e g r e e o f m y o c a r d i a l h y p e r t r o p h y o f r a t s i n t h e T A C g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P0.0 5),w h i l e t h e d e g r e e o f m y o c a r d i a l h y p e r t r o p h y i n r a t s w i t h o v e r e x p r e s s i o n o f m i R-1 4 5 w a s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d(P0.0 5).I n t h e c e l l e x p e r i m e n t,t h e d e g r e e o f m y o c a r d i a l c e l l h y p e r t r o p h y s t i m u l a t e d b y a n g i o t e n s i n w a s s i g n i f i c a n t l y o b v i o u s(P0.0 5).Wh i l e i n t h e c e l l s w i t h m i R-1 4 5 o v e r e x p r e s s i o n,t h e d e g r e e o f m y o c a r d i a l c e l l h y p e r t r o p h y w a s s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d(P0.0 5),t h e p h o s p h o r y l a t i o n l e v e l o f t h e d o w n s t r e a m m o l e c u l e C a MK o f m i R-1 4 5 d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y(P0.0 5),t h e p h o s p h o r y l a t i o n l e v e l o f i n f l a mm a t i o n r e l a t e d i n d e x N F a n d t h e l e v e l o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s(R O S)w e r e a l s o s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h o s e i n t h e c o n t r o l g r o u p(P0.0 5).T h e o v e r e x p r e s s i o n o f m i R-1 4 5 i n p r i m a r y m y o c a r d i a l c e l l s c o u l d r e d u c e t h e i n f l a mm a s o m e N L R P 3 a n d d o w n s t r e a m m o l e c u l e s C a s p a s e-1,I L-1 a n d I L-1 8 e x p r e s s i o n l e v e l.C o n c l u s i o n O v e r e x p r e s s i o n o f m i R-1 4 5 a l l e v i a t e s m y o c a r d i a l h y p e r t r o p h y i n d u c e d b y p r e s s u r e o v e r l o a d,a n d t h i s i m p r o v e m e n t a p p e a r s t o b e r e l a t e d t o i n h i b i t i o n o f a c t i v a t i o n o f t h e C a MK/N F-B/N L R P 3 s i g n a l i n g p a t h w a y,w h i c h m a y b e a p o t e n t i a l t r e a t m e n t f o r p a t h o l o g i c a l h y p e r t r o p h y.K e y w o r d s m i c r o R NA-1 4 5;m y o c a r d i a l h y p e r t r o p h y;p y r o p t o s i s;i n f l a mm a t i o n;C a MK;N L R P 3 病理性心肌肥厚是指在各种病理因素作用下导致的心脏体积增大,其特点是细胞内蛋白质合成增加、细胞体积增大、间质细胞增殖、钙超载增强和炎性反应1。病理性心肌肥厚可由不同的病理因素引起,如前后机械负荷过大、神经体液调节失衡或者一些遗传性因素等2。众多研究表明,炎症在病理性心肌肥厚中起着关键驱动作用,减少心肌炎症对于治疗病理性心肌肥厚尤为重要3。其中,炎 症小体NO D样 受 体 蛋 白3(N L R P 3)介导的无菌性炎性反应在心肌肥厚中也发挥着重要的调控作用4。经典的细胞焦亡过程通过N L R P 3炎性小体复合体发挥作用。N L R P 3是一种多蛋白复合物,是N O D样受体(N L R)家族最著名的炎症小体5。N L R在细胞稳态、自噬6、凋亡7、焦亡8等多种病理生理过程中发挥重要作用。在病理性心肌肥厚早期,N L R P 3介导的无菌性炎性反应刺激诱发心肌肥厚;在心肌肥厚逐渐向心力衰竭发展过程中,无菌性炎性反应持续刺激诱导心肌细胞发生焦亡9。钙调蛋白依赖性蛋白激酶(C a MK)是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶,在心脏中含量丰富1 0。C a MK是血管紧张素(A n g)的下游受体,也受细胞内C a2+浓度调节。激活后的C a MK可以促进C a2+内流增加,从而增强心肌细胞收缩力1 1。C a MK可被细胞内活性氧(R O S)激活1 2,此外,C a MK还是-肾上腺素能受体的效应器1 3。C a MK过度激活会导致心肌细胞内C a2+超载,会导致心肌细胞发生代偿性肥大1 4。持续抑制C a MK活性可以延缓压力超负荷诱导的心肌肥厚的进展。此外,心脏中C a MK激活可以与I B 相互作用并加速I B 的磷酸化,从而诱导N F-B激活和炎性反应加剧1 5。抑制N F-B的激活可以有效降低N L R P 3及下游信号分子的表达水平1 6。微小R NA(m i R)作为一类小分子非编码R NA,通过形成与靶基因mR NA完全或互补配对的碱基序列并与之结合,诱导靶基因mR NA的剪切或抑制其翻译,从而达到调控基因表达的作用。m i R在心肌肥厚的发生和进展中也发挥一定的调控作用,部分研究已经进入临床或临床前研究阶段,表现出较为显著的疗效1 7-1 8。本课题组前期研究证明,C a MK是m i R-1 4 5的靶基因,m i R-1 4 5可以直接结 合启动子抑 制C a MK表达。通过上调m i R-1 4 5抑制C a MK激活可逆转心脏纤维化和心力衰竭缺血再灌注损伤1 9。鉴于C a MK/N F-B信号通路在N L R P 3激活中的作用,以及N L R P 3介导的无菌性炎性反应在心肌肥厚中的重要作用,推测m i R-1 4 5通过抑制与C a MK、N F-B相关的炎症来减轻心肌肥厚。在本实验中,研究了m i R-1 4 5是否可以改善压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚,这种改善作用与N L R P 3及C a MK/N F-B信号通路之间的关系,现报道如下。1 材料与方法1.1 T A C动物模型将2 4只8周龄大鼠分为4组:假手术组(s h a m组)、主动脉缩窄(T A C)手术组(T A C组)、注射装载有m i R-1 4 5腺 病 毒(11 01 1 P F U,G e n e C h e m C o.L t d.)的T A C手术组(T A C+m i R-1 4 5组)、注射阴性对照 病 毒(11 01 1 P F U,G e n e C h e m C o.L t d.)的T A C手术组(T A C+N C组)。在T A C术前1周,通过颈静脉向大鼠体内注射腺病毒。T A C手术操作方法参照文献1 4。所有动物伦理项目均已获得武汉大学动物伦理委员会的批准。1.2 方法1.2.1 超声心动图T A C术后2周,将大鼠麻醉后进行超声心动图检查。使用V i n n o第6代超声多普勒成像系统(V i n-n o 6,V i n n o公司)检查左心室结构。在左心室流出道水平,用M模式测量左心室后壁直径(L V PW d)和室间隔直径(I V S d)。1.2.2 苏木精-伊红(HE)染色将固定好的心脏标本依次经过浓度梯度升高的乙醇进行脱水处理,再用石蜡包埋脱水后的标本。利用病理切片机将石蜡标本切成5 m左右厚度的薄片进行HE染色。先将切片浸入二甲苯溶液和浓度梯2671重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期度递减的乙醇溶液中进行脱蜡至水,最后将切片浸于蒸馏水中;再将切片转入苏木素染液中染色35 m i n,染色结束后用苏木素分化液分化,通过苏木素反蓝、脱水,伊红染液中染色5 m i n;最后利用树胶将切片封片,于显微镜下观察并拍照记录,通过软件计算心脏的表面积和心肌细胞的表面积,评估心肌肥厚和心肌细胞肥大程度。细胞爬片无需石蜡包埋和脱蜡处理,其余处理步骤同上。1.2.3 新生大鼠原代心肌细胞的分离培养从新生13 d乳鼠心脏中分离出原代心肌细胞。首先,新生大鼠(13 d龄)被颈椎脱位处死。然后迅速将心脏从胸腔中取出,并立即放入磷酸盐缓冲液(P B S)中清洗4次;使用眼科剪将左心室组织进一步切割成较小 的碎片,并在 含有0.2 5%胰 蛋 白 酶 和0.0 8%胶原酶的混合物中反复消化;消化完成后以8 0 0 r/m i n离心5 m i n并收集细胞。然后将细胞重悬于培养基中并在培养箱中贴壁1 h后,将上层培养基转移到含有1 0%胎牛血清的DMEM培养基中,并添加5-乙炔基-2-脱氧尿苷(B r d U)抑制成纤维细胞的生长。将提取好的原代心肌细胞随机分为4组:对照组(C T L组)、血管紧张素治疗组(A n g组)、m i R-1 4 5腺病毒+A n g组(A n g+m i R-1 4 5组)、m i R-1 4 5阴性对照腺病毒+A n g组(A n g+N C组)。向A n g+m i R-1 4 5组和A n g+N C组转入相关病毒,处理2 4 h后,除对照组外,其他组的细胞使用2 0 0 m o l/L A n g(1 m o l/L,S i g m a-A l d r i c h,HY-1 3 9 4 8)刺激,诱导心肌肥厚。1.2.4 定量实时聚合酶链反应组织和细胞总R NA由T R I z o l R NA提取试剂(L i f e T e c h n o l o g i e s)提取,互补D NA(c D NA)由S w e-S c r i p t R T F i r s t S t r a n d c D NA合成试剂盒(S e r v i-c e b i o)合 成。使 用2S Y B R G r e e n q P C R M a s t e r M i x(S e r v i c e b i o)和S t e p O n eTM r e a l-t i m e P C R系 统(L i f e T e c h n o l o g i e s)进 行 定 量 实 时 聚 合 酶 链 反 应(q R T-P C R)。每组测试3次,最终结果以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GA P DH)或U 6剪接体R NA为内参,以获得相对表达。1.2.5 蛋白质印迹分析样品中的总蛋白在R I P A(强)裂解液中完全裂解,然后用1 0%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S-P AG E)分离,并转移到P V D F膜上。在W e s t e r n b l o t分析之前,用B C A蛋白检测试剂盒定量每个蛋白质样品的装载量。将处理过的P V D F膜与一抗放在摇床上,4 过夜。第2天,所有P V D F膜在室温下与二抗孵育1 h。最后通过化学发光仪检测蛋白质表达,并用I m a g e J(R R I D:S C R_0 0 3 0 7 0)软件进行定量。1.2.6 活性氧检测心肌细胞的活性氧水平通过活性氧检测试剂盒检测。向培养基清洗处理后的心肌细胞中添加1 m L浓度为1 0 m o l/L的DHE,用无血清培养基稀释,并在3 7 下避光孵育2 0 m i n,然后用P B S冲洗3遍。结束上述步骤后,将细胞置于激光共聚焦显微镜下进行观察和记录。1.2.7 免疫荧光检测处理结束后的细胞用4%多聚甲醛固定1 5 m i n。在裂解液中孵育1 0 m i n使其透明后,将含有5%牛血清清蛋白(B S A)的N F-B一抗(12 0 0)的载玻片在4 下孵育过夜。次日,用相应的二抗孵育。然后将细胞在D A P I工作溶液中复染1 0 m i n。上述各步骤之间用P B S清洗载玻片,最后在荧光显微镜下观察并记录。1.3 统计学处理使用G r a p h P a d P r i s m(R R I D:S C R_0 0 2 7 9 8)进行统计分析。计量资料以xs表示,采用t检验对两组数据进行比较。两组以上数据的比较采用单因素方差分析(ANOVA),然后进行T u k e y事后检验。以P0.0 5为差异有统计学意义。2 结 果2.1 在大鼠体内过表达m i R-1 4 5减轻了T A C诱导的大鼠心肌肥厚T A C组大鼠心脏重量与体重的比值(HW/BW)和心脏重量与胫骨长度的比值(HW/T L)显著高于s h a m组大鼠,而过表达m i R-1 4 5明显降低了T A C手术诱发的HW/BW、HW/T L升高(图1 A、B)。T A C组的大鼠心脏横截面积、心肌细胞表面积也增加明显,给予m i R-1 4 5颈静脉注射后,以上直接反映心肌肥厚的指标明显改善,而T A C+N C组却未出现明显变化,见图1。T A C组反映心肌肥厚的指标室间隔厚度(I V S D)和左室后壁厚 度(L V PW d)的数 值 明 显 升 高(P0.0 5)。以上数值均较T A C+N C组有明显降低。与s h a m组相比较,T A C组m i R-1 4 5水平明显降低,过表达m i R-1 4 5后,心肌组织中m i R-1 4 5的水平对应增加;与s h a m组相比较,T A C组心肌中B N P表达水平升高,过表达m i R-1 4 5后,B N P的R NA和蛋白表达水平均一致性降低,而N C组与T A C组结果无明显差异,见图2。2.2 过表达m i R-1 4 5可逆转A n g 诱导的心肌细胞肥大A n g 刺激后心肌细胞的表面积明显增加(P0.0 5),在心肌细胞中过表达m i R-1 4 5后逆转了血管紧张素诱导的心肌细胞肥大(图3 A、B)。与C T L组相比较,A n g 刺激后显著增加C a MK和N F-B的磷酸化水平;作为心肌肥厚指标的B N P的表达同步增加。转染m i R-1 4 5腺病毒的心肌细胞中C a MK和N F-B的磷酸化水平较N C组显著降低,细胞中B N P的表达水平也有显著的降低,见图3 CF。3671重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期 A:HW/BW;B:HW/T L;C:心脏病理切片;D:心脏横截面积;E:心肌细胞(HE染色);F:心肌细胞表面积;*:P0.0 5。图1 过表达m i R-1 4 5对心脏重量及形态的影响 A:超声心动图;B:I V S D;C:L V PW d;D:腺病毒转染m i R-1 4 5在心肌细胞中的表达;E:B N P RNA表达水平;F、G:B N P蛋白表达水平;*:P0.0 5。图2 过表达m i R-1 4 5对心脏厚度及标志物的影响2.3 过表达m i R-1 4 5减少N F-B核转位和心肌细胞的氧化应激给予A n g刺激后,C T L组细胞中N F-B的荧光强度显著增加,且由心肌细胞质转移至细胞核中。过表达m i R-1 4 5后,细胞中N F-B的荧光强度相较病毒阴性对照组显著降低,细胞核中N F-B的含量也显著减少(图4 A、B)。在对各个处理组细胞中R O S的检测发现,C T L组中的R O S荧光强度微弱,经过4671重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期A n g 刺激后,心肌细胞中的R O S水平显著升高;过表达m i R-1 4 5组的心肌细胞R O S荧光强度较阴性对照组显著下降(图4 C、D)。A:心肌细胞(HE染色);B:心肌细胞表面积;CF:心肌细胞中C a MK、N F-B、B N P的表达情况;*:P0.0 5。图3 过表达m i R-1 4 5改善A n g 诱导的心肌细胞肥大 A、B:心肌细胞中N F-B表达及统计;C、D:RO S阴性细胞及统计;*:P0.0 5。图4 过表达m i R-1 4 5减轻A n g 诱导的心肌细胞中炎症和氧化应激水平5671重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期2.4 过表达m i R-1 4 5抑制N L R P 3和炎症细胞因子的激活C T L组心肌细胞中N L R P 3及其下游效应蛋白(C a s p a s e-1、I L-1和I L-1 8)的表达水平较低,A n g刺激增加了以上蛋白的表达水平,但过表达m i R-1 4 5则抑制了这些蛋白的表达升高,见图5。A:W e s t e r n b l o t检测N L R P 3、C a s p a s e-1、I L-1、I L-1 8、GA P DH的表达;B:N L R P 3蛋白表达;C:C a s p a s e-1蛋白表达;D:I L-1蛋白表达;E:I L-1 8蛋白表达;*:P0.0 5。图5 过表达m i R-1 4 5抑制A n g 诱导的N L R P 3及下游效应分子的表达3 讨 论心肌肥厚是一个高度复杂的生理过程,炎症的作用近年来受到越来越多的关注2 0。几乎所有导致肥厚的因素都被证明有炎症因素参与,例如压力过载、交感神经超兴奋性、肾素-血管紧 张素-醛固酮 系统(R AA S)激活。细胞焦亡是一种新型的程序性细胞死亡2 1。当受到某些刺激时,病原体相关分子模式或危险相关分子模式信号被激活,导致下游N L R P 3炎性体激活,从而触发C a s p a s e-1及其下游分子的表达,如G a s d e r-m i n D(G S DMD)。G S DMD从部分核酸中分离出来后,变 成 了3 11 03的N末 端 产 物(G S DMD-N)。G S DMD-N聚集在细胞膜内,导致细胞膜孔的形成,从而引发细胞内容物流出,并触发炎症因子(如I L-1、I L-1 8)的识别和招募。细胞焦亡也称为细胞炎性坏死,越来越多的研究强调其在心血管疾病中的作用,包括动脉粥样硬化、冠心病、心肌肥厚和心力衰竭8,2 2。C a MK是心脏重塑的重要促进剂,特别是对于心肌肥厚;C a MK过度激活一方面促进心肌细胞内钙离子超载,另一方面促进细胞内炎性反应。抑制C a MK可 以 有 效 改 善 病 理 性 心 肌 肥 厚 的 治 疗。WANG等2 3发现使用C a MK抑制剂KN 9 3可以显著改善肿瘤坏死因子(T N F-)诱导的大鼠原代心肌细胞肥大。KA S H I WA S E等2 4用装载有C a MK 3的腺病毒感染原代大鼠心肌细胞,成功诱导了细胞肥大,用C a MK抑制剂KN 9 3干预显著逆转了细胞肥大的程度。然而,在心肌肥厚动物模型的研究中发6671重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期现,C a MK抑制剂KN 9 3会抑制血管内皮细胞增殖,促进内皮细胞凋亡,显著降低心脏血管丰度,导致心肌重塑恶化2 5。尽管一些C a MK抑制剂可以在细胞水平发挥改善心肌肥厚作用,但它们通过非靶向效应表现出一些副作用,需要重新审视心肌肥厚治疗的靶点。微小R NA是细胞中一种广泛且有效的基因调控分子,参与基因转录后的调节。许多基于微小R NA调控的临床试验在传染病、血液病和心力衰竭等不同领域显示出巨大的临床优势。本课题组之前的研究表明,C a MK是m i R-1 4 5的靶标,m i R-1 4 5 s在许多组织和器官中广泛表达。除了抗肿瘤和抗动脉粥样硬化外,m i R-1 4 5通过抑制C a MK的表达,在心力衰竭和缺血再灌注损伤中显示出重要的抗心脏重塑和心律失常作用1 9。本研究中,在T A C诱导的压力超负荷心肌肥厚模型中,m i R-1 4 5表达水平显著降低。过表达m i R-1 4 5后显著改善了心肌肥厚,细胞学实验发现C a MK和N F-B的表达水平也显著降低,此外,本研究还发现过表达m i R-1 4 5后,炎症 因子N L R P 3及其下游分子的表达水平显著降低,血管紧张素诱导的心肌细胞焦亡也显著改善。作为一种转录因子,N F-B参与调节多个基因的表达。在心肌细胞中,激活的C a MK可以促进N F-B核移位,然后调节编码L型钙通道的主要基因C a v 1.2的 表 达2 6。十 多 年 前,研 究 人 员 意 识 到C a MK可能是心脏炎症和心肌肥大之间的重要联系。最近的研究表明,C a MK对压力过载的反应激活并触发了心肌细胞中炎症基因的表达和N L R P 3的激活。在T A C开始时抑制C a MK可以预防心脏重塑。另一项研究进一步证实,N F-B可以通过直接结合其启动子区域来激活N L R P 3基因表达2 7。因此抑制C a MK 可能通过N F-B/N L R P 3信号通路降低炎症水平来逆转心肌肥厚。在本研究中,与m i R-1 4 5基因整合的腺病毒在与主动脉缩窄前1周被注射进入大鼠体内,并在手术后的2周内持续表达。笔者发现,通过A n g刺激培养的心 肌 细 胞 和T A C后 的 心 脏 组 织 中N L R P 3、C a s p a s e-1和下游炎症细胞因子I L-1、I L-1 8水平显著升高。过表达m i R-1 4 5逆转了这些变化并减少了心肌肥厚。作为一种重要的调节因子,C a MK不仅可以被细胞内钙激活,还可以被活性氧激活。本研究还发现在A n g的作用下,N F-B发生明显核转位,但m i R-1 4 5至少部分阻止了这一过程。炎症已被视为多种心血管疾病的重要干预目标。最近研究发现,卡纳金单抗(一种针对I L-1的特异性单克隆 抗 体)对 心 肌 梗 死 具 有 强 大 的 临 床 治 疗 效果2 8。m i R-1 4 5在不同的心脏病模型中显示出强大的抗重塑作用,但在心肌肥厚中的作用存在争议。L I等2 9-3 0发现,m i R-1 4 5通过不同的信号通路减弱A n g或异丙肾上腺素(I S O)诱导的病理性心肌肥厚。但是L O P E S等3 1发现,左心室肥厚患者的m i R-1 4 5上调,并且在使用去甲肾上腺素治疗后,过表达m i R-1 4 5的增加了HL-1细胞中AN P和B N P的表达。本研究结果与L I等的研究结果相似。尽管体外研究结果存在分歧,但本研究证明m i R-1 4 5可能通过抑制炎症而成为病理性心肌肥厚的关键调节因 子。尽 管m i R-1 4 5对许多不同的疾病具有强大的临床治疗潜力3 2,但它可以导致肺纤维化3 3。本研究只是观察了m i R-1 4 5在环扎2周后对心肌肥大的影响。由于时间不足以产生肺动脉高压,需要更多、更长时间的数据来判断过表达m i R-1 4 5在未来用于心肌肥厚的抗重塑作用。综上 所 述,过 表 达m i R-1 4 5可 能 通 过 减 轻 由C a MK/N F-B/N L R P-3信号通路激活引起的心肌细胞焦亡来逆转心肌肥厚,进一步证实了m i R-1 4 5在心血管疾病的治疗中的潜在价值。参考文献1NAKAMUR A M,S A D O S H I MA J.M e c h a n i-s m s o f p h y s i o l o g i c a l a n d p a t h o l o g