基于自建数据库的超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法测定谷物中7种真菌毒素.pdf

年 月 研究论文：收稿日期：通讯联系人：基金项目：浙江省基础公益研究计划（）；浙江省药品监管系统科技计划项目（）：（）；（）基于自建数据库的超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法测定谷物中 种真菌毒素章璐幸，周 征，曹 琳，钱 江（浙江药科职业大学，浙江 宁波；宁波市药品检验所，浙江 宁波）摘要：建立了基于自建数据库的超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（）测定水稻、小麦中 种真菌毒素的方法。样品经 甲酸水乙腈（，）提取，用 盐包脱水盐析，用 色谱柱（，）分离。采用 在全信息串联质谱（）模式下对样品进行筛查，针对筛查结果为阳性的样品，采用 源，在正、负离子飞行时间多反应监测（）模式下进一步检测，用基质匹配标准曲线进行校准定量。结果表明，种真菌毒素在各自范围内具有良好的线性关系，相关系数（）为 。种真菌毒素的检出限为 ，定量限为 。水稻和小麦基质在低、中、高 个加标水平下的平均回收率分别为 和 ；分别为 和 。结果表明，在 批水稻中筛查出了黄曲霉素（）和黄曲霉素（），筛出率各为 ，其中有 批样品 超过限量；在 批小麦中筛查出了脱氧雪腐镰刀菌烯醇（）和玉米赤霉烯酮（），筛出率分别为 和 ，均未超过限量。本方法采用 进行定性筛查，避免干扰物因质量数和保留时间都与目标物接近形成的假阳性现象，对筛查阳性的真菌毒素采用 模式进行定量。该法具有快捷、准确、灵敏度高的特点，适用于水稻、小麦样品中真菌毒素残留的分离和定量检测，可为水稻、小麦中真菌毒素污染监测和风险预警提供有力的技术支持。关键词：超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱；真菌毒素；稻谷；小麦中图分类号：文献标识码：，（，；，）：（）（，），（，），（，），（）（），（），（），（），第 期章璐幸，等：基于自建数据库的超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法测定谷物中 种真菌毒素 （），（），（）（），（），（），；，（）（，），（，），引用本文：章璐幸，周征，曹琳，钱江 基于自建数据库的超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法测定谷物中 种真菌毒素 色谱，（）：，（）：（）；真菌毒素造成的污染是食品安全较为重要的问题之一，植物在种植、生长、收获、加工、运输等各个环节均有被污染的可能，根据联合国粮食及农业组织的统计，全球 的食品受到不同程度的真菌毒素污染，这已经成为一个全球性的问题。目前发现的数百种真菌毒素中，约有 种真菌毒素被认为具有严重健康危害，其中黄曲霉素（）被列为类致癌物。前期，本课题组应用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（）建立了水稻、小麦中 种真菌毒素的高分辨质谱数据库，可以在无对照品的状态下，准确筛查出水稻、小麦中痕量的真菌毒素，建立了良好的非靶向定性方法。参考 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量和 ，在稻谷、小麦基质中有明确监管限量要求的真菌毒素有 种，对这 种真菌毒素有必要进行定量分析，确定是否符合标准限度要求，保护公众食品安全。目前定量首选的方法是液相色谱三重四极杆质谱法（），其具有较高的灵敏度和选择性，但为了准确定性和定量真菌毒素，需要获得高浓度对照品和相应的同位素内标，有些对照品如 纯度高、毒性大，不可避免会对实验者及实验环境造成一定危害，而且靠预先设定的对照品来进行定性，无法获取对照品以外的真菌毒素残留信息。另外，分辨力有限，容易色谱第 卷产生假阳性现象。高分辨质谱（）可在全扫描模式下采集选定质量范围内的全部离子，提供大量的定性信息。随着技术的发展，选择性、动态范围、线性、灵敏度等有了很大的提升，从而扩大了在定量分析中的应用，。四极杆飞行时间质谱兼具四极杆的高选择性和飞行时间质谱的高分辨率，数据采集可以兼容定量分析的灵敏度和选择性。本文基于 ，建立了水稻、小麦基质中 种真菌毒素的测定方法。采用 在全信息串联质谱（）模式下对样品进行筛查，针对筛查结果为阳性的样品，采用 源，在正、负离子飞行时间多反应监测（）模式下进一步检测，用基质匹配标准曲线进行校准定量，为水稻、小麦中真菌毒素污染监测和风险预警提供有力的技术支持。表 种真菌毒素的质谱参数 （）（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；实验部分 仪器与试药 四极杆飞行时间高分辨质谱仪、超高效液相色谱仪、工作站、科学信息学系统（美国 公司）；超纯水纯化系统（美国 公司）；电子天平（瑞士 公司）；离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；振荡器（莱普特科学仪器（北京）有限公司）。黄曲霉素（）、黄曲霉素（，）、黄曲霉素（，）、黄曲霉素（，）、赭曲霉素（，）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（，）标准溶液，玉米赤霉烯酮（，）标准品均购自阿尔塔科技有限公司；萃取盐包购自美国安捷伦科技公司；甲醇、乙腈（质谱纯）购自德国 公司；乙酸、甲酸、乙酸铵（质谱纯）均购自阿拉丁试剂；实验用水为 超纯水。色谱质谱分析条件 条件色谱柱为 柱（，），柱 温 ，流 动 相 为 含 乙酸铵的 乙酸水溶液，流动相 为甲醇，流速为 ，样品进样量为 。梯度洗脱程序见表。表 梯度洗脱程序 （）（）：；：条件 正离子模式：毛细管电压 ，锥孔电压 ，离子源温度 ，脱溶剂气温度 ，锥孔气流速 ，脱溶剂气流速 。负离子模式：毛细管电压 ，锥孔电压 ，离子源温度 ，脱溶剂气温度 ，锥孔气流速 ，脱溶剂气流速 。溶液：亮氨酸脑啡肽（正离子 ，负离子 ）；采集模式：、模式。模式设置：质量扫描范围 ；扫描时间 ；低碰撞能量（）关闭，高碰撞能量（）为；模式设置：详见表 中的参数设置。数据采集由 工作站完成。第 期章璐幸，等：基于自建数据库的超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法测定谷物中 种真菌毒素 样品前处理 准确称取 样品，于 聚丙烯具塞离心管中，加入 甲酸水乙腈（，），涡旋混匀，振荡提取 ，加入 萃取盐包（含 硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸二钠盐），振荡 ，以 的转速离心 ，取上清液，用 聚四氟乙烯滤膜过滤，取续滤液，进样分析。标准溶液配制分 别 精 密 量 取、标准品原溶液 ，置于 容量瓶中，用乙腈定容至刻度；标准品用乙腈定量溶解至 容量瓶中，配制 种真菌毒素标准储备液，于 避光保存。取 种真菌毒素标准储备液适 量，用 乙 腈 稀 释 制 成、质量 浓 度 分 别 为 、的混合标准溶液，于 避光保存。按课题组前期确定的筛查方法，选用未检出真菌毒素的样品作为空白样品，按 节处理得到空白基质溶液，取 种真菌毒素混合标准溶液适量，用空白基质溶液稀释，配制成基质匹配混合校准溶液，其中、的质量浓度分别为 、，为、，为、，为 、。筛查条件 参照本课题组前期研究，筛查条件为：选取加合物（包括、和）作为目标质量，低能量通道质谱报告强度阈值，高能量通道质谱报告强度阈值；绝对保留时间漂移 ；离子测得质量数与数据库中的离子理论质量数匹配容差。结果与讨论 色谱条件的优化 色谱柱的选择 实验比较了 （，）和 （，）色谱柱，使用 色谱柱时，化合物出峰速度过快，其中 几乎无保留，使用后者，化合物峰形和保留时间较为合理。推测 柱具有较高的硅烷亲和性，能增强极性化合物的保留。因此选择 色谱柱（，）。流动相条件的优化 本实验比较了水甲醇体系、甲酸水溶液甲醇体系、乙酸水溶液甲醇体系与 粮油检验主要谷物中 种真菌毒素的测定 液相色谱串联质谱法标准中的含 乙酸铵的 乙酸水溶液甲醇体系。结果显示，采用含 乙酸铵的 乙酸水溶液甲醇体系时，得到的离子响应强度和峰形最优，提取离子色谱图如图 所示。图 种真菌毒素混合标准溶液的提取离子色谱图 色谱第 卷 质谱条件优化 种真菌毒素中、采用正离子模式，、采用负离子模式，若均以正离子或负离子模式电离，会导致信号响应值达不到最佳。本实验对 和 种数据采集模式进行比较，在色谱条件、离子源参数和积分方法一致的前提下，采用 模式获得的 种真菌毒素信号强度高、基线噪声小，有更好的灵敏度和选择性，适用于定量分析。模式能够获得质量数精准的完整碎片信息，适于定性筛查分析。以 为例，模式和 模式所获得的质谱图对比如图 所示，该结果清楚展示了两种采集模式的差异。图 在 与 模式下的质谱图 图 提取溶剂中甲酸的体积分数对（）水稻和（）小麦基质中真菌毒素回收率的影响 （）（）：前处理方法的优化 提取溶剂酸度的选择 向水稻、小麦空白基质中定量加入 种真菌毒素标准品，考察提取溶剂甲酸水溶液乙腈（，）中甲酸的体积分数（、）对回收率的影响。结果如图 所示，与不添加甲酸相比，加入甲酸后目标化合物的回收率整体有所提高，甲酸体积分数为 和 时，回收率较高且接近。随着甲酸体积分数的增加，正离子模式下黄曲霉素类、回收率逐渐降低，而负离子模式下 和 回收率基本不变，综合考虑，最终选择甲酸体积分数为 。第 期章璐幸，等：基于自建数据库的超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法测定谷物中 种真菌毒素 净化方式的选择 以水稻、小麦空白基质加标样品的回收率为考察对象，以 甲酸水溶液乙腈（，）为稀释液，比较了直接提取稀释法、净化柱法、萃取盐包结合 过 滤 柱、萃 取 盐 包 结 合 小柱和 萃取盐包直接净化法。结果表明，用直接提取稀释法提取液离心后取上清液，过 滤膜，种真菌毒素的绝对响应较低，而且随着进样次数的增加目标物信号响应逐图 净化方法对（）水稻和（）小麦基质中真菌毒素回收率的影响 （）（）渐降低直到淹没在基线噪声中，因此后续不再考察。对于其他净化法的考察结果如图 所示。萃取盐包直接净化法中、的回收率比采用 萃取盐包结合净化柱法（过滤柱、小柱）更高。可能的原因是填料 和 本身对脂质有较强的去除效果，对 中的大环类结构有较强的吸附作用，对、中的双呋喃环香豆素结构可能也有一定的吸附作用。通过几种前处理方法的比较，我们选用 萃取盐包直接净化法，操作简便，回收率高。表 种真菌毒素的最大限量 ：，基质效应 分别用提取溶剂和基质溶液配制纯溶剂标准溶液和基质匹配混合校准溶液，以目标组分色谱峰面积对质量浓度绘制标准曲线。（基质匹配校准曲线的斜率溶剂标准曲线的斜率）溶剂标准曲线的斜率，为弱基质效应，可以忽略；为中等基质效应；为强基质效应。结果表明，在水稻基质中、和 具有中等强度的基质效应；在小麦基质中仅有 和 为中等强度的基质效应。因此需采用基质匹配校准曲线进行校准定量。标准曲线、检出限和定量限 前期，课题组已在 上建立了谷物中的 种真菌毒素数据库，并在无标准品的情况下，准确筛查出谷物中的真菌毒素残留，建立了良好的非靶向定性方法。当筛查出的真菌毒素明显高于或低于限量时，容易得出准确的评判结论，但当其响应接近限量时，定量测定的准确性对结果的判定尤为重要，因此建立了包含限量浓度的标准曲线。如表 所示，本文根据 和 标准对谷物类及其制品的要求，合计对 种真菌毒色谱第 卷素规定了限量，选取两个标准中较低的最大残留限量（）作为本试验的限量标准。取 节的基质匹配混合校准溶液，按照 和 节方法进行测定，以目标组分色谱峰面积对质量浓度绘制标准曲线。结果如表、表 所示，在水稻和小麦基质中，各化合物在其线性范围内呈现良好的线性关系，相关系数（），以定量离子信噪比大于 计算检出限，为 ，以定量离子信噪比大于 计算定量限，为 。表 水稻基质中 种真菌毒素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限和基质效应 ，（），（），（）（）（）（）（）：；：，表 小麦基质中 种真菌毒素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限和基质效应 ，（）（）（）表 水稻和小麦中 种真菌毒素的加标回收率和精密度（）（）（）回收率和精密度 在空白水稻、小麦基质中添加低、中、高 个水平的混合标准溶液，按 节方法处理，每个水平平行 份，进行回收率试验，并计算相对标准偏差（）。结果表明，水稻和小麦基质中真菌毒素在低、中、高 个加标水平下的平均回收率分别为 和 ；分别为 和 （表）。说明方法具有良好的准确度和精密度，适用于水稻和小麦中 种真菌毒素的定量。实际样品检测 收集了浙江省 批水稻和 批小麦，按照本课题组前期建立的方法进行筛查，并按本文的方法进行定量测定，结果 批水稻中有 批筛查出了和，筛出率为 ，其中含量分别为 和 ，根据本文规定的限量标准（表），有 批超标，超标率为 。批小麦中有 批筛查出，筛出率为 ，批筛查出，筛出率为 。根据本文规定的限量标准（表），测定结果表明 和 均未超过限第 期章璐幸，等：基于自建数据库的超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法测定谷物中 种真菌毒素量，超标率为。需要进一步强调，由于 和 模式的侧重点不同，建议对于那些残留量低，毒性大的真菌毒素用 模式先行筛查，在筛查阳性确证后用 模式进行定量。以 为例，用 模式进行筛查，按照课题组制定的筛查规则，精确质量数的容差设为，在 工作站中运行方法，结果在 对应保留时间范围内无目标物的加合离子和碎片离子精确质量数（图 和），图 水稻样品在 模式下（）低能量、（）高能量质谱图和（）在 模式下的提取离子色谱图 （），（）（）判断得出 未筛出。同批样品，在 模式，对应保留时间处疑似有 的色谱峰（图）。推测产生的原因是用 模式进行定量时，仪器固有条件决定了定量离子的质量数容差约为 ，导致基质中的一些干扰物因质量数和保留时间都与目标物接近，形成假阳性现象。结论 本文以稻谷和小麦作为研究对象，建立了基于自建数据库的超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱对水稻和小麦中 种真菌毒素定量的方法。该方法前处理操作简便，筛查精准，定量准确，适用于大批量水稻、小麦中 种真菌毒素的定量，为谷物中的真菌毒素筛查检测提供新思路与新方法，也为监管提供技术支持。参考文献：，：，：，：，（）：孙娟，李为喜，张妍，等 作物学报，（）：，（）：章璐幸，黄朝辉，罗淑青，等 色谱，（）：，：，（）：方真，曲栗，古淑青，等 色谱，（）：，：，：，（）：王莎，孔维军，杨美华 药学学报，（）：，（）：胡巧茹，曹鹏，丛中笑，等 色谱，（）：，（）：，：