荷叶黑茶提取物对内生湿热证患者肠道菌群及临床症候的影响.pdf

内蒙古医学杂志InnerMongoliaMedJ2023年第55卷第8 期DOI:10.16096/J.cnki.nmgyxzz.2023.55.08.002903荷叶黑茶提取物对内生湿热证患者肠道菌群及临床症候的影响王俊,王灿,金黑鹰(江苏省第二中医院，南京2 10 0 17)摘要 目的研究荷叶黑茶提取物对内生湿热证患者肠道菌群、临床症状及糖脂代谢等相关指标的影响。方法采用自身前后对照的方法，选取2 0 2 2 年4一7 月江苏省第二中医院门诊内生湿热证患者2 3例，服用荷叶黑茶提取物(6 g/d),治疗1个月后评估其临床疗效和不良反应,并通过Illumina MiSeq平台对患者治疗前后的肠道菌群进行16 SrDNA基因V3V4可变区检测,运用QIIME、ST A M P及LEfSe进行Alpha、Beta多样性分析,鉴定差异性菌属。结果内生湿热症候经治疗显著改善（有效率 6 0%)；体质量指数(BMI)、体脂率、腰臀脂肪比、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗(IR)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)均较治疗前下降，差异有统计学意义(P0.05);2例(8.7 0%)患者在服药期间有失眠症状；与治疗前相比，治疗后蓝藻菌门（Cyanobacteria）的相对丰度上升，拟杆菌门（Bac-teroidetes)的相对丰度下降，差异有统计学意义（P0.05)；属分类水平上，罗斯氏菌属（Roseburia)、克雷伯氏菌属（Klebsiella）的相对丰度显著上升，吉米菌属（Gemmiger）、W A L一18 55D、叶啉单胞菌属（Porphy-romonas)的相对丰度显著下降，差异有统计学意义(P60%).Body mass index(BMI),body fat rate and the waist hip fat,fasting plasma glucose(FPG),fasting insulin*基金项目 江苏省自然科学基金（编号：BK20191502)；南京中医药大学第二附属医院（江苏省第二中医医院)院内课题（编号：SEZJZ2018001)；江苏省中医药科技发展计划项目（编号：YB201930）；江苏省社会发展项目（编号：BE2019763）通信作者】医学博士，主任医师。E-mail:904(FINS),insulin resistance(IR),total cholesterol(TC),triglyceride(TG)and low density lipoprotein(LDL-C)were decreased significantly(P0.05).TWO patients(8.70%)had insomnia symptoms during taking themedicine,and the symptoms were relieved after adjusting the time of taking the medicine.Compared with be-fore treatment,at the phylum level,the relative abundance of Cyanobacteria increased and that of Bacteroidetesdecreased significantly after treatment(P 0.05).At the genus level,the relative abundance of Roseburia andKlebsiella increased significantly,while that of Gemmiger,WAL-1855D and Porphyromonas decreased signifi-cantly(P 0.5g)，保存于20，低温（0）运送至美格基因公司进行粪便DNA 的提取及 16 Sr DNA检测11,12 。16 S rDNA扩增选择区域为V3V4区，扩增引物为（341F：CCTACGGGNGGCWGCAG;805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC)。所有样本均使用 Ilumina MiS-eq平台进行测序，测序得到的原始数据以双端(PE300)FASTQ格式保存。在0.97 相似度下利用QIIME2（2 0 19.0 4）软件进行OTUs（O p e r a t i o n a l内蒙古医学杂志InnerMongoliaMedJ2023年第55卷第8 期Taxonomic Units)聚类和物种注释，将获得的代表性序列与GreenGenel38数据库对比。在微生物多样性研究中，Alpha多样性以物种多样性指数(Shannon、Fa i t h)来度量;Beta多样性分析对样品的物种组成相似性进行比较，包括聚类分析和排序分析；物种丰度比例图分别根据物种分类单元的界、门、纲、目、科、属、种层对每个样本进行计数；微生物的差异性分析使用STAMP软件（2.1.3）、LEfSe(http:/huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)。1.5统计学方法采用SPSS23.0软件进行统计分析,计量资料采用中位数（四分位距)或（元s）表示，使用配对t检验；计数资料以n（%)表示，使用Kruskal Wallis检验。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1临床特征2 3例内生湿热证患者均有面垢油光、身重疲乏，诉口苦19例，眼干涩或多眼屎16 例，大便黏腻或排便困难14例，易生痤疮4例，舌苔黄腻2 1例。其中代谢综合征19例,功能性便秘7 例，寻常型痤疮4例，克罗恩病2 例，全部完成1个月治疗并进行复查随访。2.2内生湿热证症候疗效治疗1个月后,患者面垢油光（95.6 5%，2 2/2 3）、口苦有异味（7 3.6 8%，14/19）、身重疲乏（6 9.57%，16/2 3）、大便黏腻（7 1.43%，10/14）、舌苔黄腻和脉象滑数（7 6.19%，16/21）、眼干涩或多眼屎（56.2 5%，9/16）等湿热证的症侯明显改善；4例痤疮患者3例均缓解（7 5.0 0%，3/4），7 例便秘患者服用荷叶黑茶提取物前Wexner便秘评分为（13.0 2.5）分，治疗后为(8.73.8)分，差异有统计学意义(P=0.001);2例克罗恩病患者的黏液血便较治疗前减少,Best CDAI评分下降。见表1。2.3体脂改变与治疗前相比,治疗后BMI、体脂率、腰臀脂肪比明显下降，差异有统计学意义（P0.05)。见表2。2.4糖脂代谢指标对19例代谢综合征患者治疗前后糖脂代谢进行比较,与治疗前相比,糖代谢指标FPG、I R、T C、T G、LD L-C在治疗后均明显下降,差异有统计学意义(P 6 0%表2 治疗前后一般情况对比（元S，n=2 3)指标治疗前BMI24.64 3.21体脂率28.10 7.72腰臀脂肪比0.87 0.08水分比55.47 8.62注：与治疗前比较，*P0.05表3治疗前后实验室指标对比（s，n=19)指标治疗前FPG(mmol/L)5.91 1.44FINS(uIU/ml)10.70 4.74IR2.67 1.03TC(mmol/L)5.420.97TG(mmol/L)1.95 1.00HDL(mmol/L)1.42 0.33LDL(mmol/L)3.490.56注：与治疗前比较，*P0.052.5.2FMT对肠道菌群构成及差异性分析的影响(1)门分类水平的丰度值及构成比较。治疗后蓝藻菌门（Cyanobacteria)的相对丰度上升，拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度下降，差异有统计学意义(P0.05)。见图2,表4。（2)属分类水平的构成比较。如图3a、3b 所示，与治疗前相比,罗斯氏菌属治疗后人数121901111112003300221423.30 3.4926.91 7.290.810.1656.07 8.15治疗后5.400.899.664.762.26 1.155.01 0.871.580.591.470.303.330.61195.65*15769.57*7756.258471.43*11573.68*3175.00*4566.67*61627.276947.06210治疗后576.19*P值0.006*0.000*0.036*0.266P值0.032*0.0770.005*0.001*0.036*0.1390.004*906(Roseburia)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)的相对丰度明显上升，差异有统计学意义（P0.05);吉米菌属(Gemmiger)、W A L-18 55D、啉单胞菌属(Porphy-romonas)的相对丰度明显下降，差异有统计学意义(P0.05)。见表5。LEfSe分析提示治疗前后共有58 类菌群发生变化，见图3c、3d。与治疗前相比,治疗后蓝藻菌门（Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、变形菌纲(Alphaproteobacteria)、芽孢杆菌目（Bacillales）、假a内蒙古医学杂志InnerMongoliaMedJ2023年第55卷第8 期单胞菌目（Pseudomonadales）、拟杆菌目（Bacteria-unclassifiedl、2)、皮生球菌科（Dermacoccaceae)、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、T M 7 等相对丰度上升；拟杆菌门（Bacteroidetes）、链球菌科（Strepto-coccaceae)、韦荣氏球菌科（Veillonellaceae）、罗氏菌属（Rothia)、吉米菌属（Gemmiger)、埃希氏菌属（Es-cherichia）、丛毛单胞菌属（Curvibacter）等相对丰度下降。ShannonbFaith88Post图1Alpha多样性分析(a:Shannon指数对比,P=0.890;b:Faith指数对比，P=0.042)图版编号：10 0 4-0 951-(2 0 2 3)0 6-0 90 6-F1PrePostPreAcoacxorsaBactescidetes8CeesastnexcetesyisersisteteT100b806040-20PostPreCBacteroidetes32.32335图22a.治疗前与治疗后细菌门分类水平的肠道菌群组成图;b.前6 类优势菌门箱型图；c.基于STAMP算法的差异性菌门图版编号：10 0 4-0 9 51-（2 0 2 3)0 6-0 9 0 6-F2内蒙古医学杂志InnerMongoliaMedJ2023年第55卷第8 期表4治疗前后细菌门分类的相对丰度比较(元s,%)细菌门分类治疗前拟杆菌门47.93 15.45厚壁菌门44.4214.49变形菌门4.814.15放线菌门1.651.89梭杆菌门0.370.98疣微菌门0.06 0.16蓝藻菌门0.000.01注：与治疗前比较，*P0.05907表5治疗前后细菌属分类的相对丰度比较(元 s,%)治疗后P值37.82 15.730.035*40.2816.840.3896.485.230.2582.291.820.2471.16 2.370.1590.270.800.12512.23 21.340.001*细菌属分类罗斯氏菌属吉米菌属克雷伯氏菌属WAL-1855D叶啉单胞菌属注：与治疗前比较，*P0.05治疗前4.51 4.093.65 2.900.070.170.391.800.28 1.31治疗后7.31 8.541.32 1.900.521.690.000.010.000.00P值0.027*0.004*0.004*0.005*0.035*aPresekesiaOscispita25Parebacteroicdes8020.034bCeemiges7.3909.9Meangroportigo)2CC38.8,588图3a.治疗前与治疗后细菌属分类水平的肠道菌群组成图;b.基于STAMP算法的差异性菌属;c.菌群变化LEfSe组成图;d.物种进化图(界到属水平)图版编号：10 0 4-0 951-（2 0 2 3)0 6-0 90 7-F33讨论中医认为过食膏梁厚味导致内生湿热是糖尿病、高脂血症、结直肠癌等内生湿热相关疾病发生的重要原因1,12 。现代医学研究发现高脂高热量饮食导致的肠道菌群失调是糖尿病、高脂血症、结直肠癌等疾病发生的重要因素5,8 。本组前期使用荷叶908与黑茶组方，观察荷叶黑茶对内生湿热证湿邪的清除功效及相关代谢指标的影响，结果表明，荷叶黑茶可以明显改善湿热证相关临床表现，改善患者高血压状态,降低甘油三酯,提高HDL-C,改善胰岛素抵抗等13。在此基础上，我们将上述荷叶黑茶经过低温萃取，制成荷叶黑茶提取物，以便于饮用并能更准确地控制摄入量。此次与前期荷叶黑茶组方的疗效相比，荷叶黑茶提取物治疗面鼻部油光发亮（9 5.6 5%VS80.0%）口干口苦（7 3.6 8%VS60.4%）等湿热症状的有效性均较前上升12 ;身重疲乏、眼干涩多眼屎、口苦、大便黏腻、舌苔黄腻等内生湿热证的有效率达到7 0%以上。7 例便秘者服用荷叶黑茶提取物后Wexner便秘评分由（13.0 2.5）分降低至（8.7 3.8)分，差异有统计学意义（P0.05）2 例克罗恩病患者的黏液血便较治疗前减少,Best CDAI评分下降。提示荷叶黑茶提取物可以全面缓解内生湿热证的临床症状。本研究发现荷叶黑茶提取物能够明显降低BMI、体脂率、腰臀脂肪比,降低血胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、空腹胰岛素和胰岛素抵抗,与治疗前相比差异有统计学意义（P0.05），提示荷叶黑茶提取物具有改善糖脂代谢异常的作用。组方中的茯茶是黑茶的一种，其特点是经过“发花”的过程产生优势菌种一一冠突散囊菌,该菌种具有改善胰岛素抵抗、调节糖脂代谢的功效14;现代药理学研究发现茶多酚能通过靶向调控拟杆菌门来减轻体质量、改善胰岛素抵抗15。本草纲目记载：“荷叶服之，令人瘦劣，单服可消阳气浮肿之气。”现代药理学认为荷叶的降脂、解热、抑菌等作用主要与含有生物碱类和黄酮类物质有关,JONGetal研究发现荷叶中的芊基异喹啉生物碱能够抑制脂肪积累，减少脂肪吸收16,17 。刘双环等认为荷叶黄酮能促进乳酸杆菌和双歧杆菌的抗氧化活性，可能与其胞内超氧化物歧化酶(SOD)酶活及谷胱甘肽(GSH)活力得到显著提升有关18 。高脂饮食导致肠道菌群失调是肥胖、糖尿病等各类疾病发病的重要原因，荷叶黑茶提取物通过调节肠道菌群发挥改善内生湿热证相关疾病的作用5。本研究发现服用荷叶黑茶提取物后患者肠道菌群多样性上升，治疗后拟杆菌门的相对丰度显著下降,厚壁菌门的相对丰度呈下降趋势，拟杆菌门/厚壁菌门的比值(B/F)下降。FASSATOUI etal用定量PCR技术比较2 0 例糖尿病患者与11例健康人群肠道菌群特点，发现糖尿病患者以厚壁菌门下降、B/F上升为特征19。SCHWIERTZ et al 使用定量PCR技术比较6 8 例肥胖者与30 例瘦者的肠内蒙古医学杂志InnerMongoliaMedJ2023年第55卷第8 期道细菌特点，肥胖者拟杆菌门的相对丰度上升，B/F上升2 0 。WALTERS et al 对肥胖和炎症性肠病患者的肠道菌群序列特点进行了Meta分析，发现B/F与疾病无明显相关性，但肠道菌群的多样性和丰富度降低是共同特征2 1。上述研究提示，荷叶黑茶提取物能通过降低拟杆菌门/厚壁菌门的比值改善菌群多样性、调整糖脂代谢，但能否以拟杆菌门/厚壁菌门衡量治疗效果仍需进一步大样本研究。从属水平变化上，治疗后主要有罗斯氏菌属、Allobaculum、M u c i s p i r i l l u m 和 Dermacoccus 等相对丰度上升；吉米菌属、罗氏菌属、啉单胞菌属和埃希菌属等相对丰度下降。罗斯氏菌属是厚壁菌门毛螺菌科的革兰阳性菌,既往研究认为罗斯氏菌属通过降解食物中的碳水化合物产生短链脂肪酸（丁酸盐为主），不仅为肠黏膜细胞提供能量，促进结肠细胞的新陈代谢和生长，还能介导结肠CD4+细胞的分泌,提高机体抗炎、免疫能力2 2 。Alloboculum是厚壁菌门韦荣球菌科的革兰阴性菌,RAVUSSIN etal报道其能促进瘦素分泌，参与能量代谢，与体质量成负相关2 3。Mucispirillum 是脱铁杆菌门脱铁杆菌科的革兰阴性菌，常见的分类群MucispirillumSchaedleri能够分解单糖、寡肽、氨基酸和短链脂肪酸为机体供能，同时其效应蛋白能修饰黏膜组织中的基因表达,影响机体免疫应答2 4。Dermacoccus属于放线菌门皮生球菌科,CHNG etal用宏基因组学的方式比较40 例特异性皮炎患者和健康受试者的皮肤菌群特点，与健康人群对比,特异性皮炎患者的皮肤缺少Dermacoccus相关亚型，该菌能产生具有抗炎、抗菌作用的代谢产物或蛋白质保护皮肤2 5。吉米菌属是厚壁菌门瘤胃球菌科的革兰阳性菌，在一项纳入2 12 例肥胖者的关于肠道菌群和脂肪分布与性别关系的研究中发现，吉米菌属与女性腰腹部和腹臀部脂肪含量成正比，在男性中成反比,本研究中吉米菌属与BMI、腰臀脂肪含量成正比2 6 。罗氏菌属是放线菌门拟杆菌科的革兰阳性菌，包括龋齿罗氏菌、黏液罗氏菌等，既往报道其与口腔感染、肺部感染、菌血症等感染性疾病相关2 7-2 9。叶啉单胞菌属是拟杆菌门紫单胞菌科的革兰阴性菌，包括牙髓叶啉单胞菌，是口腔疾病的常见致病菌。叭啉单胞菌属细胞外膜的主要成分是脂多糖(LPS),能刺激宿主细胞分泌白介素、TNF等炎性因子,参与机体免疫炎症反应,与肥胖等代谢性疾病的慢性炎症状态呈正相关30 。埃希菌属是变形菌门肠杆菌科的革兰阴性菌，其主要包含常见致病菌大肠杆菌，能引起菌血症、泌尿系感染、消化系统感染等31。由上述研究可推测荷叶黑茶提取物通过促进有益菌和抑制致病菌的生长来改善机体内蒙古医学杂志InnerMongoliaMedJ2023年第55卷第8 期湿热症状，但具体是哪些菌群、通过何种代谢途径参与机体湿热证的变化仍需更深入地研究。综上所述，荷叶黑茶提取物可以明显改善内生湿热证患者的临床症状,调整糖脂代谢指标,提高胰岛素敏感性，其可能通过恢复肠道菌群的稳态发挥作用，其作用确切的机理仍需进一步探索。参考文献1 张梦芸.黄连温胆汤加减方治疗肥胖T2DM湿热困脾证的临床疗效观察D.南京：南京中医药大学，2 0 19.2邵正东.清中饮、针灸联用治疗高血压(湿热证)的临床效果分析J.中西医结合心血管病电子杂志，2 0 18,6(17)：151-154.3MA H,ZHANG B,HU Y,et al.Correlation Analysis of IntestinalRedox State with the Gut Microbiota Reveals the Positive Inter-vention of Tea Polyphenols on Hyperlipidemia in High Fat DietFed MiceJ.J Agric Food Chem,2019,67:7 3257 335.4WAN Y,WANG F,YUAN J,et al.Effects of Dietary fat on gutMicrobiota and Faecal Metabolites,and Their Relationship withCardiometabolic risk Factors:S 6-month Randomized Controlled-feeding TrialJ.Gut,2019,68(8):1 4171 429.5 TILG H,ZMORA N,ADOLPH T E.The Intestinal MicrobiotaFuelling Metabolic Inflammation J.Nature reviews Immunolo-gy,2020,20(1):4054.6OHKUSA T,KOIDO S,NISHIKAWA Y.Gut Microbiota andChronic Constipation:A Review and Update J.Front Med(Lausanne),2019,6:19.7GHALY S,HART P H.Inflammatory Bowel 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