骨髓间充质干细胞来源外泌体中lncRNA SNHG12对心肌细胞的影响及其机制.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 25 期骨髓间充质干细胞来源外泌体中lncRNA SNHG12对心肌细胞的影响及其机制王德霞1，赵勇2，李荣1，辛辉11 青岛大学附属医院心血管内科，山东青岛266000；2 枣庄市山亭区人民医院心内科摘要：目的探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源外泌体中长链非编码RNA（lncRNA）小核仁RNA宿主基因12（SNHG12）对心肌细胞的影响及其机制。方法贴壁法分离培养BMSCs并传代。取传3代BMSCs，转染SNHG12 48 h，分离外泌体并鉴定。取H9c2细胞，随机分为阴性对照（NC）外泌体组与SNHG12外泌体组，分别转染NC外泌体、SNHG12外泌体；SNHG12外泌体+miR138-5p抑制剂组与SNHG12外泌体+NC抑制剂组，分别转染SNHG12外泌体+miR138-5p抑制剂及SNHG12外泌体+NC抑制剂；SNHG12外泌体+SH-NC组与SNHG12外泌体+SH-SIRT1组，分别转染SNHG12外泌体+SH-NC及SNHG12外泌体+SH-SIRT1。制备缺氧溶液，将上述各组细胞与缺氧溶液共孵育6 h，建立体外缺氧细胞模型。收集各组细胞培养液，离心留取上清液。采用ELISA法检测上清液IL-1、IL-18含量。收集各组细胞，采用Western blotting法检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、剪切的半胱氨酸蛋白酶1（Cleaved-Caspase-1）、剪切的焦孔素D（Cleaved-GSDMD）蛋白表达，采用CCK-8法检测细胞活力，采用TUNEL法检测细胞凋亡率。结果经鉴定，成功获取BMSCs来源外泌体。在体外缺氧细胞中，SNHG12外泌体组细胞凋亡率以及NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达和上清液IL-1、IL-18水平均低于NC外泌体组（P均0.05），细胞活力高于NC外泌体组（P0.05）。下调miR-138-5p表达后，BMSCs来源外泌体中SNHG12可导致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达降低，细胞活力升高、细胞凋亡率降低（P均0.05）；下调SIRT1表达后，BMSCs来源外泌体中SNHG12可导致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达升高，细胞活力降低、细胞凋亡率升高（P均0.05）。结论BMSCs来源外泌体中lncRNA SNHG12可能通过调节miR-138-5p/SIRT1轴抑制心肌细胞炎症反应及心肌细胞焦亡和凋亡，从而发挥对心肌细胞的保护作用。关键词：心肌梗死；外泌体；骨髓间充质干细胞；长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因12doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.25.003 中图分类号：R542.2 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）25-0009-05Effect of lncRNA SNHG12 in exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells on cardiomyocytes and its mechanismWANG Dexia1，ZHAO Yong，LI Rong，XIN Hui1 Cardiovascular Department，The Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266000，ChinaAbstract：Objective To investigate the effect of long non-coding RNA（lncRNA）small nucleolar RNA host gene 12（SNHG12）in exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）on cardiomyocytes and its mechanism.Methods BMSCs were isolated and cultured by adhesion method.BMSCs of the third generation were transfected with SNHG12 for 48 h，and exosomes were isolated and identified.H9c2 cells were randomly divided into the negative control（NC）exosome group and SNHG12 exosome group，and were transfected with equal volume of NC exosome and SNHG12 exosome，respectively；the SNHG12 exosome+miR138-5p inhibitor group and SNHG12 exosome+NC inhibitor group were transfected with equal volume of SNHG12 exosome+miR138-5p inhibitor and SNHG12 exosome+NC inhibitor group，respectively；the SNHG12 exosome+SH-NC group and SNHG12 exosome+SH-SIRT1 group were transfected with equal volume of SNHG12 exosome+SH-NC and SNHG12 exosome+SH-SIRT1 group，respectively.Anoxic solution was prepared，and cells of each group were incubated with anoxic solution for 6 h to establish anoxic cell models in vitro.The 基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目（2019WS177）。第一作者简介：王德霞（1983-），女，硕士研究生，主治医师，主要研究方向为高血压、冠心病、慢性心力衰竭等诊治。E-mail：通信作者简介：辛辉（1967-），女，博士研究生，主任医师，主要研究方向为高血压、冠心病及复杂疑难心肌病诊治。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）9山东医药2023 年第 63 卷第 25 期cell culture medium of each group was collected，and the supernatant was retained by centrifugation.The content of IL-1 and IL-18 in the supernatant was detected by ELISA.We collected cells of each group.Western blotting was used to detect nucleotide-binding oligomerized domain-like receptor 3（NLRP3），apoptosis-associated speck-like protein（ASC），Cleaved cysteine proteinase-1（Cleaved-Caspase-1），and Cleaved focal porin D（Cleaved-GSDMD）protein expression.CCK-8 assay was used to detect cell viability and TUNEL assay was used to detect the apoptosis rate.Results Exosomes from BMSCs were identified and obtained successfully.In hypoxic cells in vitro，the apoptosis rate，protein expression levels of NLRP3，ASC，Cleaved-Caspase-1，Cleaved-GSDMD，and levels of IL-1 and IL-18 in supernate of the SNHG12 exosome group were significantly lower than those of the NC exosome group（all P0.05）；the cell viability was significantly higher than that of the NC exosome group（P0.05）.After down-regulating the expression of miR-138-5p，SNHG12 in the exosomes of BMSCs significantly decreased the relative expression levels of NLRP3，ASC，Cleaved-Caspase-1，Cleaved-GSDMD（all P0.05）；the cell viability significantly increased and apoptosis rate significantly decreased（all P0.05）.After down-regulated SIRT1 expression，SNHG12 in exosomes from BMSCs significantly increased the relative protein expression levels of NLRP3，ASC，Cleaved-Caspase-1，and Cleaved-GSDMD（all P0.05），significantly decreased the cell viability，and significantly increased the apoptosis rate（all P0.05）.Conclusions LncRNA SNHG12 in BMSCs-derived exosomes may inhibit the inflammatory response，pyroptosis and apoptosis of cardiomyocytes by regulating the miR-138-5p/SIRT1 axis，thus playing a protective role in cardiomyocytes.Key words：myocardial infarction；exosomes；bone marrow mesenchymal stem cells；long non-coding RNA small nucleolar RNA host genes12心肌梗死是临床常见的心血管疾病，近年来其发病率和死亡率居高不下，严重影响患者生活质量甚至危及生命1。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种来源于骨髓的多能干细胞，具有体外扩增能力强、免疫原性低和多向分化潜能等特点，是组织工程和细胞治疗的常用种子细胞。研究发现，心肌梗死后移植BMSCs能够显著促进梗死区域新生血管形成和受损心肌修复2。而 BMSCs 来源的外泌体被证实可提供与 BMSCs 相似的心脏保护作用3。长链非编码RNA（lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt 的 RNA 分子，可通过竞争内源性 RNA 机制参与多种心血管疾病的发生、发展4-5。小核仁RNA 宿主基因 12（SNHG12）是一种具有低编码概率的lncRNA，在多种恶性肿瘤中表达上调，并扮演致癌基因的角色6。研究发现，lncRNA SNHG12可通过 miR-218-5p/胰岛素样生长因子 2轴调节动脉粥样硬化中氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞损伤7，提示lncRNA SNHG12能够抑制心血管疾病的发生、发展。但lncRNA SNHG12对心肌细胞保护的作用机制尚未阐明。2022年2月2023年3月，本研究探讨了 BMSCs来源外泌体中 lncRNA SNHG12对心肌细胞的影响及其机制。现报告如下。1 材料与方法 1.1材料大鼠BMSCs及心肌细胞H9c2，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。SNHG12、SH-沉默信息调节因子1（SIRT1）、miR-138-5p抑制剂及其相应的阴性对照，由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。IX51倒置显微镜，购自日本Olympus公司；凝胶成像仪，购自美国 Bio-Rad 公司；Multiskan FC 酶标仪，购自美国Thermo公司。CD9、CD63一抗，购自英国Abcam公司；肿瘤易感基因101（TSG101）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、剪切的半胱氨酸蛋白酶 1（Cleaved-Caspase-1）、剪切的焦孔素D（Cleaved-GSDMD）一抗，购自美国Cell Signaling Technology公司。IgG二抗，购自武汉塞维尔生物科技有限公司。外泌体提取试剂盒，购自美国Thermo公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；IL-1、IL-18 ELISA试剂盒，购自美国R&D公司；CCK-8试剂盒，购自美国GLPBIO公司。1.2BMSCs转染与外泌体提取采用贴壁法分离培养 BMSCs 并传代。取传 3 代 BMSCs 细胞 3 105个，接种至6孔板，置于37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。待 BMSCs 生长至 40%60%融 合 时，按 Lipofectamine3000 说 明 分 别 转 染SNHG12。转染 48 h，收获细胞并分离外泌体。当BMSCs生长至80%融合时，用无外泌体的培养基培养48 h，收集上清液。上清液以2 000 g离心20 min，再以10 000 g离心40 min，然后用0.22 m无菌过滤器过滤。将上清液以100 000 g超速离心70 min，重悬于PBS中，再以100 000 g离心70 min除去任何剩余的RNA，并用含PBS和RNAse 的混合物稀释，最终获得外泌体悬浮液。1.3BMSCs来源外泌体鉴定取部分外泌体悬浮10山东医药2023 年第 63 卷第 25 期液，加入适量RIPA裂解液充分裂解，提取外泌体总蛋白。加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性。取变性蛋白，SDS-PAGE分离。电泳结束，湿转法转至PVDF膜上。TBST洗膜，5%脱脂牛奶室温封闭，然后分别加入 CD9、CD63、TSG101 一抗，4 孵育过夜。次日，TBST洗膜后滴加IgG二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜，ECL发光，凝胶成像仪曝光并采集图像。1.4缺氧模型建立取H9c2细胞，随机分为阴性对照（NC）外泌体组与SNHG12外泌体组，分别加入等体积NC外泌体、SNHG12外泌体转染；SNHG12外泌体+miR138-5p抑制剂组与SNHG12外泌体+NC抑 制 剂 组，分 别 加 入 等 体 积 SNHG12 外 泌 体+miR138-5p抑制剂及SNHG12外泌体+NC抑制剂转染；SNHG12外泌体+SH-NC组与SNHG12外泌体+SH-SIRT1 组，分别加入等体积 SNHG12 外泌体+SH-NC 及 SNHG12 外泌体+SH-SIRT1 转染。然后根据KOYAMA等8的方法制备缺氧溶液，将各组细胞与缺氧溶液共孵育6 h，建立体外缺氧细胞模型。1.5炎症因子检测收集各组细胞培养液，离心留取上清液。采用ELISA法检测上清液IL-1、IL-18。1.6外泌体特异性生物标志物及细胞焦亡相关蛋白表达检测采用 Western blotting 法。收集各组细胞，加入 RIPA 裂解液充分裂解，提取细胞总蛋白。加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性。取变性蛋白，SDS-PAGE 分离。电泳结束，湿转法转至 PVDF 膜上。TBST洗膜，5%脱脂牛奶室温封闭，然后分别加入 NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD一抗，4 孵育过夜。次日，TBST洗膜后滴加IgG二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜，ECL发光，凝胶成像仪曝光并采集图像。采用Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。1.7细胞活力检测采用CCK-8法。收集各组细胞，接种至96孔板，置于37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24 h。每孔加入CCK-8溶液10 L，37 孵育2 h。酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值。1.8细胞凋亡率检测采用TUNEL法。收集各组细胞，4%多聚甲醛固定，PBS润洗，置于冰上并使用0.1%Triton X-100透化处理，然后加入TUNEL反应液，室温黑暗孵育1 h。PBS洗涤，DAPI衬染细胞核。荧光显微镜下采集图像，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=每视野TUNEL染色阳性细胞数/总细胞数 100%。1.9统计学方法采用 GraphPad7.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以-x s表示，结果比较采用t检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1BMSCs 来源外泌体鉴定经鉴定，BMSCs 来源外泌体特异性标志物CD9、CD63、TSG101表达均呈阳性，证实成功获取BMSCs来源外泌体。2.2BMSCs来源外泌体中SNHG12对体外缺氧心肌细胞的影响NC外泌体组与SNHG12外泌体组细胞凋亡率、细胞活力及上清液IL-1、IL-18水平比较见表 1，NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达比较见表2。2.3下调miR-138-5p表达后BMSCs来源外泌体中SNHG12对体外缺氧心肌细胞的影响在缺氧心肌细胞中，下调miR-138-5p表达后，BMSCs来源外泌体中SNHG12可导致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达降低，细胞活力升高、细胞凋亡率降低（P均0.05），见表3、4。2.4下 调 SIRT1 表 达 后 BMSCs 来 源 外 泌 体 中SNHG12 对体外缺氧心肌细胞的影响在缺氧心肌细胞中，下调 SIRT1 表达后，BMSCs 来源外泌体中SNHG12可导致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD 蛋白表达升高，细胞活力降低、细胞凋亡率升高（P均0.05），见表5、6。3 讨论 心肌梗死是临床常见的急危重症之一，典型临床表现为突然发作剧烈而持久的胸骨后或心前区压榨性疼痛，休息或含服硝酸甘油不能缓解，常伴有烦表1NC外泌体组与SNHG12外泌体组细胞凋亡率、细胞活力及上清液IL-1、IL-18水平比较（-x s）组别NC外泌体组SNHG12外泌体组细胞凋亡率（%）18.20 3.0314.00 1.53*细胞活力（%）1.55 0.322.39 0.34*IL-1（pg/mL）347.26 18.0699.68 11.95*IL-18（pg/mL）194.59 6.0172.15 10.34*注：与NC外泌体组比较，*P0.05。表2NC外泌体组与SNHG12外泌体组NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白相对表达量比较（-x s）组别NC外泌体组SNHG12外泌体组NLRP30.32 0.040.15 0.03*ASC0.33 0.070.18 0.04*Cleaved-Caspase-10.34 0.060.17 0.05*Cleaved-GSDMD0.37 0.070.21 0.06*注：与NC外泌体组比较，*P0.05。11山东医药2023 年第 63 卷第 25 期躁不安、出汗、恐惧或濒死感。在心肌梗死过程中，当冠状动脉粥样硬化斑块破裂或急性血栓形成时，会导致冠状动脉管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧和能量代谢障碍，最终导致心肌细胞死亡9。因此，挽救和修复受损的心肌细胞是心肌梗死治疗的重要目标。BMSCs是一类起源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，是当前再生医学中最有潜力的种子细胞。外泌体是一种由活体细胞通过胞吐方式释放的小囊泡，其内包含细胞的 DNA、RNA、蛋白质等生物活性物质，可介导细胞间的信息传递。近年来，外泌体已经被广泛地应用于临床疾病诊治和生物技术领域，如干细胞治疗、基因递送、药物运载等。将外泌体注射到心肌梗死早期的心肌组织中，能够显著抑制心肌细胞凋亡10。研究表明，BMSCs可通过释放外泌体的方式，提供多种生物活性分子来修复受损的心肌细胞、减少梗死周边区域的心肌细胞凋亡，促进损伤心肌的再生性修复11。lncRNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，可通过竞争内源性RNA机制参与多种心血管疾病的发生、发展4-5。在心血管疾病中，lncRNA已被证实可通过调节心肌细胞增殖、凋亡以及心肌肥厚、纤维化和血管生成等，改善心功能障碍12。外泌体来源lncRNA可抑制心肌细胞凋亡和焦亡，从而发挥对心肌细胞的保护作用13。BMSCs 衍生的外泌体lncRNA mir9-3hg 可通过 Pum2/PRDX6 轴抑制缺血再灌注小鼠心肌细胞铁死亡14。lncRNA SNHG12是一种具有低编码概率的lncRNA，定位于人染色体1q25.1区域。有研究报道，SNHG12高表达可促进肿瘤细胞增殖、阻遏细胞周期进程、抑制肿瘤细胞凋亡以及诱导肿瘤新生血管形成等，从而促进肿瘤的侵袭和转移6。因此，lncRNA SNHG12被认为是一种潜在的肿瘤诊断标志物和治疗靶点。但在心肌梗死中BMSCs来源外泌体中lncRNA SNHG12对心肌细胞的影响及其机制尚不清楚。本研究结果发现，在体外缺氧细胞中，SNHG12外泌体组细胞凋亡率显著低于NC外泌体组，细胞活力显著高于NC外泌体组。提示BMSCs来源外泌体中 lncRNA SNHG12 对心肌细胞具有保护作用。心肌梗死后会引起强烈的全身和局部炎症反应，抑制或减弱炎症反应有利于心肌缺血再灌注后心肌细胞存活15。细胞焦亡是一种炎症性细胞程序性死亡方式。Caspase-1在细胞焦亡中起着至关重要的作用，Caspase-1 激活可触发炎症因子 IL-1、IL-18 释放16。靶向细胞焦亡的抑制剂可减少心肌梗死面积和抑制炎症反应。细胞焦亡的特征在于GSDMD介导的膜孔形成，细胞肿胀和快速裂解，随后大量释放促炎症介质17。NLRP3是启动细胞焦亡的必要条件，心肌梗死患者血浆NLRP3水平显著升高18。本研究结果发现，在体外缺氧细胞中，SNHG12外泌体组 NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD表3SNHG12外泌体+NC抑制剂组与SNHG12外泌体+miR-138-5p抑制剂组NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相对表达量比较（-x s）组别SNHG12外泌体+NC抑制剂组SNHG12外泌体+miR-138-5p抑制剂组NLRP30.56 0.110.37 0.05*ASC0.29 0.030.15 0.03*Cleaved-Caspase-10.61 0.030.53 0.14*Cleaved-GSDMD0.42 0.040.22 0.04*注：与SNHG12外泌体+NC抑制剂组比较，*P0.05。表4SNHG12外泌体+NC抑制剂组与SNHG12外泌体+miR-138-5p抑制剂组细胞活力、细胞凋亡率比较（%，-x s）组别SNHG12 外泌体+NC抑制剂组SNHG12 外泌体+miR-138-5p抑制剂组细胞活力1.71 0.262.06 0.37*细胞凋亡率27.04 3.5219.83 2.27*注：与SNHG12外泌体+NC抑制剂组比较，*P0.05。表5SNHG12外泌体+SH-NC组与SNHG12外泌体+SH-SIRT1组NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相对表达量比较（-x s）组别SNHG12外泌体+SH-NC组SNHG12外泌体+SH-SIRT1组NLRP30.20 0.050.48 0.04*ASC0.48 0.080.64 0.10*Cleaved-Caspase-10.39 0.050.50 0.02*Cleaved-GSDMD0.33 0.020.49 0.16*注：与SNHG12外泌体+SH-NC组比较，*P0.05。表6SNHG12外泌体+SH-NC组与SNHG12外泌体+SH-SIRT1组细胞活力、细胞凋亡率比较（%，-x s）组别SNHG12 外泌体+SH-NC组SNHG12 外泌体+SH-SIRT1组细胞活力1.44 0.200.99 0.27*细胞凋亡率18.30 1.5521.23 2.86*注：与SNHG12外泌体+SH-NC组比较，*P0.05。12山东医药2023 年第 63 卷第 25 期蛋白表达和上清液IL-1、IL-18水平均显著低于NC外泌体组，细胞活力显著高于NC外泌体组。提示BMSCs来源外泌体中 lncRNA SNHG12能够抑制心肌细胞炎症反应及心肌细胞焦亡和凋亡。抑制miR-138-5p表达和过表达SNHG12均可上调SIRT1表达。研究发现，SIRT1在心肌梗死中具有心肌保护作用，敲除SIRT1基因小鼠心肌梗死面积显著增大，而过表达SIRT1基因小鼠心肌梗死面积显著缩小19。有 研 究 证 实，miR-138-5p 可 特 异 性 结 合SIRT120，而lncRNA SNHG12可靶向miR-138-5p21。本研究结果发现，下调 miR-138-5p 表达后，BMSCs来 源 外 泌 体 中 SNHG12 可 导 致 NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达显著降低，细胞活力显著升高、细胞凋亡率显著降低；下调SIRT1表达后，BMSCs来源外泌体中SNHG12可导致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD 蛋白表达显著升高，细胞活力显著降低、细胞凋亡率显著升高。提示BMSCs来源外泌体中lncRNA SNHG12可能通过调节 miR-138-5p/SIRT1 轴抑制心肌细胞炎症反应及心肌细胞焦亡和凋亡。综 上 所 述，BMSCs 来 源 外 泌 体 中 lncRNA SNHG12可能通过调节miR-138-5p/SIRT1轴抑制心肌细胞炎症反应及心肌细胞焦亡和凋亡，从而发挥对心肌细胞的保护作用。参考文献：1XIAO Y，ZHAO J，TUAZON J P，et al.Microrna-133a and 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