电镜技术及超薄切片技术.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,电镜技术,方 周 溪,电镜技术及超薄切片技术,第1页,电镜技术及超薄切片技术,第2页,电镜室现有设备,1,、,H-7500,型透射电镜，购于,年，最大点分辨率为,0.24nm,有效放大倍数达,60,万倍。,2,、,S-3000N,型扫描电镜，购于,年，有效放大倍数达,30,万倍。,3,、辅助设备：,Tome-Power XL,超薄切片机，零界点干燥仪，离子溅射仪等。,电镜技术及超薄切片技术,第3页,1924,年，法国,Broglie,提出了“电磁波与光一样，含有波,动性“假说，并计算出电磁波长为,0.005nm.,1926,年，德国科学家,Busch,发觉了带电粒子在电场或,磁场中偏转聚焦现象。,19281931,年间，德国,Ruska,成功研制了世界上第,一台真正电子显微镜，放大倍数为,1200,倍。,20,世纪,50,年代初到,60,年代末期,，电镜分辨本事得到大,幅度提升，到达,1nm,左右，到,80,年代点分辨率,已靠近,0.1nm,，最新研制,超高压透射电镜（,1000KV),点分辨率可高达,0.001nm,。,电镜技术及超薄切片技术,第4页,电镜基本类型,一、透射式电子显微镜,二、扫描式电子显微镜,三、依据电子枪发射方式不一样，,可分为热阴极电子枪和场发射电子枪。,四、其它,（冷冻或低温电子显微镜、高压或超高压电子显微镜、分析电镜、扫描隧道显微镜、,激光扫描共聚焦显微镜,、扫描光子显微镜、原子力显微镜、环境扫描电子显微镜等约几十种不一样类型电镜）,电镜技术及超薄切片技术,第5页,主要内容,1、电镜基本原理和结构介绍(,了解,）,2、电镜样品制备（透射电镜和扫描电镜）,（,重点在于取材方面,）,3、电镜应用介绍（,熟悉,）,电镜技术及超薄切片技术,第6页,光学显微镜与电子显微镜在工作原理上比较：,光学显微镜是利用玻璃制作透镜对光进行折射，将一物点发出不一样角度光线最终会聚成一个像点。,电子显微镜是利用电场或磁场（,电磁透镜,）折射高速电子束流，到达成像目标。,电镜技术及超薄切片技术,第7页,光 源,聚光镜,样 品,物 镜,投影镜,最终象,透射电子显微镜 光学显微镜,电镜技术及超薄切片技术,第8页,透射电子显微镜原理和结构,光衍射现象：因为光含有波动性，当光线经过小孔或小孔光源经光学系统成象会产生衍射。其图案是,:,中央部分一个亮斑，在其周围有明暗交替圆环。,2D,电镜技术及超薄切片技术,第9页,显微镜分辨本事,显微镜分辩本事是由其产生衍射图中央亮斑半径,D,（分辨能力）大小来决定即,D=,当光波长为,=500nm=0.5m,介质折射率 （油）,=1.5,物体与物镜所形成夹角半数,90,央亮斑半径,D=200nm,=0.2,m,电镜技术及超薄切片技术,第10页,1,、人眼在明视距离,250mm,处能分辨,0.2mm,两点。油镜最小能分辨,0.2 m,两点。则油镜理论最大放大能力为：,0.2mm /0.2 m=,1000,（倍）,2,、假如一台电镜点分辨率为,0.1nm,则其理论放大倍数为：,0.2mm /0.1nm=,2x10,6,3,、,H-7500,型透射电镜点分辨率为,0.24nm,则其理论放大倍数为：,0.2mm /0.24nm=,0.83x10,6,。而其有效放大倍数为,0.6x10,6,电镜技术及超薄切片技术,第11页,光线经过二个比较靠近小孔时，这二个小孔衍射图会重合在一起。当一个衍射图中央亮斑恰好落在另一个衍射图第一暗环中心时，这二个点刚能够分辩。这就是显微镜分辩本事,瑞利准则,。,瑞利准则：,电镜技术及超薄切片技术,第12页,什么是电磁透镜？,因为,轴对称弯曲磁场,对电子束有,聚焦,作用，因而能够得到电子光学像。我们称这种含有轴对称弯曲磁场装置组成电子透镜为电磁透镜（,electron magnetic lenses,）。因为电磁透镜磁场非均匀分布，物、像点在磁场之外，电子在磁场中既受到,轴向分量,作用，又受到,径向分量,作用，使平行于轴进入磁场电子束可取得聚焦。,电镜技术及超薄切片技术,第13页,电磁波长计算 依据公式,=(n m),如,V=50000 v,则,=0.005 nm=0.000005m,代入公式,D=,则,D=0.000002,m,电镜技术及超薄切片技术,第14页,电镜像差和畸变,球差,：电子束光源经过透镜受到,偏转,，经过样品，从物平面向下发射，形成物点孔径角。从物点发出射线，抵达下一级透镜又被聚集。假如透镜有缺点或孔径角太大，则靠近光轴射线和远离光轴射线，受到电磁场作用就会不一样，这些射线在光轴上会聚位置不一样，结果远离光轴射线就会在像面上形成一个最小含糊圈。此时可有图象中央凸起感。这是当前影响电镜分辨率一个主要原因。,电镜技术及超薄切片技术,第15页,像散,：因为透镜磁场强度在,纵向,或,横向,上不一样，以致纵向与横向上射线,聚焦,于光轴,位置,也有上有下，二者共同形成一个,最小含糊像,。,色差,：因为电磁波长随加速电压而改变，当加速电压不稳定时，电子束波长就可变异，因而发生类似像差。,电镜技术及超薄切片技术,第16页,畸变,：因为离轴较远处径向磁场作用力强，使放大倍数随物点离轴距离而改变，进而使图象发生改变而产生。畸变常见有枕形畸变、桶形畸变和S形畸变等，如图所表示：,电镜技术及超薄切片技术,第17页,反差,人眼睛在区分物体时，主要依据物体不一样部位或物体之间光强度与波长差异，这些差异组成了物体,反衬度,，又称为“反差”。电镜与光镜一样也存在反差现象。,因为电镜标本上不一样部位物质结构不一样，疏密度不一样，它们,散射电子能力也各不相同,，散射电子能力强地方，显现为,暗像,；相反，散射能力弱地方，显现为,亮像,。所以，在荧光屏上所看到是由暗像与亮像组成含有一定反差荧光图像。,电镜技术及超薄切片技术,第18页,1,、,照明系统：,电子枪：,可分为热阴极和场发射两种。前者主要有钨丝,(W),和六硼化镧,(LaB6),；后者又分热场发射和冷场发射，普通采取是单晶钨，但现在有采取六硼化镧,(LaB6),趋势。,聚光镜,2,）样品室,3,）成象系统：,物镜 中间镜 投影镜,4,）观察统计系统：,观察室 摄影机,CCD,数字成像系统,5）辅助系统,电镜技术及超薄切片技术,第19页,透射与扫描电镜原理图解,电镜技术及超薄切片技术,第20页,扫描电子显微镜工作原理及结构,经过极细电子束扫描射击标本表面而激发出二次电子或产生反射电子，并经过一定路径被接收到阴极射线管而成像。,扫描电镜由两个主要部分组成：,探查系统和显示系统,电镜技术及超薄切片技术,第21页,一、,探查系统,：由电子枪、电磁透镜组成。,二、,显示系统,：电子检测器，闪烁器，,光电倍增器以及显示器组成。,电镜技术及超薄切片技术,第22页,电镜技术及超薄切片技术,第23页,电子束穿透能力普通较弱，大多数标本无法直接在电镜下观察，必须把样品切成厚度为,101000nm,薄片。我们把切片厚度小于,100nm,薄片称为超薄切片，是电镜观察生物样品惯用方法之一，惯用厚度为,50-100nm,。,(1),超薄切片技术,二、透射电子显微镜样品制备,电镜技术及超薄切片技术,第24页,透射电镜样品制备,(,包埋块制作）操作流程：,取材,漂洗（生理盐水）,前固定（,2.5%,戊二醛，,4,C,冰箱,2,小时以上）,漂洗（,0.1M,磷酸缓冲液，,3,次，,45,分钟）,后固定,(1%,锇酸,1,小时左右）,漂洗（,0.1M,磷酸缓冲液，,3,次，,45,分钟）,块染（,1%,醋酸铀,2,小时）,梯度脱水（,50%,、,70%,、,80%,、,90%,、,100%,丙酮各,15,分钟，,100%2,次，各,10,分钟）,浸透（丙酮：包埋液,=1,：,1,，,37,C,烘箱,2,小时；丙酮：包埋液,=1,：,4,，,37,C,烘箱过夜；纯包埋液,45,C,烘箱,2,小时）,包埋聚合（,45,C,烘箱,3,小时，,65,C,烘箱,48,小时）,电镜技术及超薄切片技术,第25页,透射电镜样品制作示意图,电镜技术及超薄切片技术,第26页,取材关键点及注意事项,快,：取材时间在,12,分钟以内完成；,小,：体积大小在,1,立方毫米左右或横切,面为,1,平方毫米长条形；,冷,：固定液温度在,4,摄氏度左右。,准,：取材部位要准确，尽可能取材于所要,观察部位。,电镜技术及超薄切片技术,第27页,取材方法介绍：,1,、器官组织 取材法：主要针对活体器官组织取材如,肾、肝、肺,等活检组织,2,、游离细胞搜集法：主要针对,培养细胞,及游离细胞如,血,细胞、,脱落,细胞等。惯用方法有血浆或血清预包埋法。,电镜技术及超薄切片技术,第28页,标本取材方向及大小示意图,电镜技术及超薄切片技术,第29页,双刀切割法,电镜技术及超薄切片技术,第30页,常见脏器取材介绍,电镜技术及超薄切片技术,第31页,、灌注固定,2,、注射固定,3,、浸泡固定,4,、位置选择：要观察生精细胞或支持细胞，取材于睾丸睾丸网部位，大鼠与小鼠睾丸网比较表浅，就在白膜下附近。假如要观察成熟精子，最好取材于附睾尾部，此处精子已基本成熟，而且精子密度最高。,睾丸组织取材方法,电镜技术及超薄切片技术,第32页,肝组织取材法,1、灌注固定法,2、浸泡固定法,动物经麻醉后打开腹腔，暴露出肝脏，选取一片肝小叶（如左小叶），先用,细线扎紧,小叶间连接部位预防出血，接着用手术剪剪下这片小叶组织放在滴有固定液蜡板上进行修块，切成1立方毫米大小即可。,电镜技术及超薄切片技术,第33页,1,、脑组织灌注固定（,4%,多聚甲醛溶液）,、取材位置选择：如研究脑神经轴索、髓鞘以及神经胶质细胞，提议取材于脑组织白质部分，此处有髓神经纤维相对较多，胶质细胞比较丰富；如要研究神经元以及血脑屏障结构，提议取材于脑皮质灰质部分。,、定向包埋，以神经元长轴方向（大约为脑组织矢状面）作为切面方向，这么能够很好地观察神经元细胞核、轴突以及树突结构改变，突触以及毛细血管结构也比较轻易见到。,电镜技术及超薄切片技术,第34页,、灌注固定,2,、浸泡固定：,载玻片挤压法：,将组织放在载玻片上，并将固定液滴在其上，用另外一片载玻片轻轻压在上面并轻轻挤压。,3,、位置选择：假如以研究支气管粘膜或研究肺动脉为主（这里指肺内支气管），尽可能取材于靠近肺门部位。假如主要研究肺泡上皮细胞、终末细支气管、呼吸性细支气管以及肺泡隔结构等，提议取材于肺叶靠近,胸膜一侧,或者,肺尖,部。,肺组织取材法,电镜技术及超薄切片技术,第35页,、灌注固定或浸泡固定（主要是,肾穿刺活检,）,、位置选择：依据需要切取皮质或髓质进行观察。动物肾组织取材要注意是，一要取材位置选择在肾,上极,，二要准确判定,皮质,与髓质位置，假如是皮质部位，只要将包膜分离后，将肾最外层组织取下来即可，这里普通都会有肾小球存在。普通要求切长条形。,肾组织取材法,电镜技术及超薄切片技术,第36页,胃肠道取材法,剖开胃肠道腔，暴露出粘膜面，用,PBS,或生理盐水浸洗内腔，尽可能清洗洁净，但注意保护好粘膜面以免损伤，然后剪一段组织进行修块。,详细做法以下：沿着胃肠道纵轴和横轴各切几条长约,2,毫米，宽约,1,毫米长条形组织，尽可能包含粘膜全层结构，以直接浸泡固定方法为宜，注意保护粘膜层细胞免受人为损伤。各试验组选取部位尽可能在相同部位，以利试验比较。,电镜技术及超薄切片技术,第37页,骨组织取材方法,取小块骨片（12mm大小），先用2.5%戊二醛固定2小时，磷酸缓冲液漂洗2次，再将骨片浸入脱钙液进行脱钙处理，视脱钙效果而定脱钙时间，如用EDTA脱钙液，大约3天时间，主要视组织块是否变得柔软，通惯用细针刺脱钙骨片是否轻易刺穿来判断脱钙效果。,软骨组织普通直接固定，不需要脱钙处理。,电镜技术及超薄切片技术,第38页,皮肤组织取材方法,皮肤组织普通观察表皮细胞及部分固有层结构，取材以长条形为主，长约1.5mm,横径在0.5mm-1.0mm,包含表皮全层细胞及部分固有层（依据上文定向取材图示处理），表皮是复层鳞状上皮层，无血管分布。真皮部分位于表皮深面，主要由胶原纤维和弹性纤维交织组成，并含有从表皮陷入毛发和腺体，以及从深层来血管、淋巴管、神经及其末梢，普通不需要定向取材，但要注意位置准确。,电镜技术及超薄切片技术,第39页,外周神经纤维取材方法,脊椎动物外周神经系统包含由脑发出脑神经和由脊髓按节段性排列发出脊神经。按所联络器官不一样，可分为躯体和内脏两大类，每一类又可按照传导兴奋方向不一样而分为传入神经和传出神经两类。取神经纤维时，应先分离掉包裹神经神经外衣，再分离出所要研究神经。假如神经纤维直径在1mm以内，可直接切成1.5mm长条形即可，假如直径较大，则一分为二，一样切成长条形。需要注意是，在包埋时候必须定向包埋，纵横方向都要包埋。,电镜技术及超薄切片技术,第40页,肌肉取材方法,每块肌肉都是含有一定形态、结构和功效器官，有丰富血管、淋巴管分布，在躯体神经支配下收缩或舒张，进行随意运动。肌肉含有一定弹性，当外界刺激较激烈情况下，肌肉往往出现痉挛现象，所以，切取肌肉组织后应先浸泡在生理盐水或磷酸缓冲液中，等肌肉恢复自然常态后再取材，纵横方向都要取，以长条形为主，大小约1*1*1立方毫米，然后浸入固定液内进行固定，需要注意是，在取心肌时候应取在,心尖,部位，在包埋时候必须定向包埋。,电镜技术及超薄切片技术,第41页,胰腺取材方法,胰腺可分为胰头、胰体和胰尾三部分。胰腺普通观察胰岛细胞、腺泡细胞以及导管细胞，胰岛主要分布在胰尾部位，胰体部位较少，腺泡及导管基本存在于胰体内，轻易观察。组织能够直接浸入固定液内固定。值得注意是，因为胰腺腺泡内酶原颗粒较丰富，轻易引发细胞自溶，取材时要尽可能快速取材以免细胞自溶影响结果。,电镜技术及超薄切片技术,第42页,肿瘤组织取材方法,肿瘤生长位置几乎遍布全身，肿瘤组织主要观察肿瘤细胞组织起源、细胞类型、分化程度以及与周围组织关系等内容。电镜标本取材应多位置取材，包含,肿瘤实体内部、生长发生部位、与周围正常组织交界部位以及癌旁组织。,各部位均要取若干个组织块进行固定，这么才能观察比较全方面，尤其怀疑是恶性肿瘤组织。大小约1mm*1mm*1mm,不能过大。,电镜技术及超薄切片技术,第43页,游离细胞取材法,血浆凝集法：,将抗凝全血离心分层（转/每分钟，1020分钟），用毛细吸管沿着管壁轻轻将上清夜吸收（不要破坏白细胞层），接着用吸管吸收固定液，并沿着管壁将2.5%戊二醛固定液慢慢地加入进行固定，然后把它放在4冰箱内保留。,血浆（血清）混正当：,如为细菌、病毒、脱落细胞、培养细胞则先将它们制成,悬液,放置于离心管内（最好是玻璃），离心成团（10003000转/分钟，10分钟，下同），去上清液后加入2.5%戊二醛固定10分钟左右，离心，再弃去多出固定液，然后和少许抗凝血浆或血清混合均匀，离心成团，去上清液（留少许），用吸管吸收2.5%戊二醛固定液,沿着离心管壁迟缓滴入,，,尽可能防止团块分散，静置于4,冰箱内保留备用。,电镜技术及超薄切片技术,第44页,双重固定法：,1,、固定目标是尽可能保持细胞生活时形,态结构以及降低细胞死后改变。,2,、前固定普通采取2.5%戊二醛溶液固定，,后固定采取,1%,锇酸溶液固定,3,、惯用固定剂：,2.5%,戊二醛、,1%,锇酸、,4%,多聚甲醛溶液、福尔马林、高锰酸,钾等，有时还用戊二醛-多聚甲醛混合,固定液固定。,电镜技术及超薄切片技术,第45页,固定不良，染色淡，,结构不清楚,固定很好，染色较深,电镜技术及超薄切片技术,第46页,1,组织块固定：切割小块浸入固定液中方式。,2,游离细胞固定：有离心法和悬浮制备法。,3.,原位固定法：结扎对应血管，在脏器表面切割“井”字型，然后直接在该表面上滴加固定液进行固定。,4.,灌注固定法：当前比较广泛采取，效果很好。,几个化学固定方式：,电镜技术及超薄切片技术,第47页,漂洗,目标是彻底洗净戊二醛固定液残余，预防其与锇酸起化学反应而降低固定效果。,惯用漂洗液为,0.1M,磷酸缓冲液（,PBS,）和二甲砷酸钠缓冲液（注意有毒性）,。,电镜技术及超薄切片技术,第48页,块染,就是对组织块进行,1%,醋酸双氧铀整块染色。,时间为,1,2,小时。,脱水（酒精或丙酮）,梯度脱水：,70%,丙酮,15,分钟，,80%,丙酮,15,分,钟，,90%,丙酮,15,分钟，,100%,丙酮,0,分钟,(,二次,),。,关键在于纯丙酮脱水！,电镜技术及超薄切片技术,第49页,浸泡与包埋,浸泡：使某种适宜液体介质（包埋剂）渗透组织块,取代脱水剂。,包埋：使浸入介质（环氧树脂包埋剂）经高温处理,后聚合为固体，将组织块包埋其中，利于超薄,切片。,惯用包埋剂：,Epon-812,环氧树脂、,DDSA,、,MNA,以及,加速剂,DMP-30,等。,尤其注意：操作过程中要严防包埋剂吸潮,!,电镜技术及超薄切片技术,第50页,包埋剂理想性质,理想包埋剂应含有以下性质：,(1),粘度低，轻易渗透组织；,(2),聚合均匀而充分，聚合前后体积改变小；,(3),有良好切割性能；,(4),能耐受电子束轰击，高温下不变形；,(5),对细胞成份抽提少，微细结构保留良好；,(6),在电镜高倍放大下，本身不显示任何结构；,(7),材料起源丰富、易得，价格低廉，对人体无害。,电镜技术及超薄切片技术,第51页,超微病理标本微波快速制备流程：（了解）,取材（按常规要求方法）,3%,戊二醛固定后经微波高火照射,20,秒,室温继续固定,20,分钟,1%,磷酸缓冲液漂洗,4,次，每次,5,分钟，微波中火照射,20,秒,1%,锇酸微波中火照射,10,秒，室温继续固定,20,分钟,丙酮,50%,、,70%,、,80%,、,90%,脱水，微波中火照射,20,秒，室温继续脱水,2,分钟。,100%,丙酮脱水,3,次，每次微波中火照射,20,秒，室温,3,分钟,丙酮：包埋剂,=1,：,1,浸透，微波中火照射,20,秒，室温继续浸透,5,分钟,丙酮：包埋剂,=1,：,3,浸透，微波中火照射,20,秒，室温继续浸透,5,分钟，,2,次,纯包埋剂微波中火照射,20,秒，室温,10,分钟,常规包埋,聚合：,70 20,分钟，,95 30,分钟，,110 60,分钟,半薄切片光镜定位,超薄切片,醋酸铀微波中火照射染色,30,秒，双蒸馏水漂洗,枸橼酸铅微波中火照射染色,20,秒，双蒸馏水漂洗,45,烘箱干燥,电镜观察。,注意：高火：,600800W,；中火：约,400W,。,电镜技术及超薄切片技术,第52页,超薄切片流程,1,、,切片前准备,：铜网清洗（用丙酮和乙醇浸洗）,2,、,支持膜制备,：惯用,Formvar,膜（聚乙烯醇缩甲醛）,由氯仿配置，浓度为,0.5%,。,3,、,玻璃刀制备,：专用制刀机制作。,4,、,半薄切片光镜定位,（需要了解组织细胞结构）。,5、,超薄切片,：专用超薄切片机切片，需要培训。,厚度在,50100 nm,之间较为适当。,6、,染色：柠檬酸铅,-,醋酸铀双重染色法。假如前面,已经进行块染，只要铅染即可。,电镜技术及超薄切片技术,第53页,电镜观察、拍片、统计等,首先，观察人员要熟悉电镜基本操作程序以及所要观察材料相关知识。熟悉,CCD,数字成像系统基本操作程序。,其次，做好观察统计，选好范围拍片，准确统计底片号码及对应内容。,最终，做好各种资料整理、立案工作。,电镜技术及超薄切片技术,第54页,取材（,做好样品观察面标志,）,漂洗（生理盐水或缓冲液）,固定（,2.5%,戊二醛,2,小时以上）,漂洗（,0.1M,磷酸缓冲液，,3,次，,45,分钟）,后固定（,1%,锇酸，,2,小时）,脱水（,50%,、,70%,、,80%,、,90%,、,95%,各,15,分钟，换醋酸异戊酯,15,分钟或叔丁醇,15,分钟）,干燥（零界点干燥或冷冻干燥）,镀膜（真空镀膜仪或离子溅射仪）,扫描电镜样品制备流程,电镜技术及超薄切片技术,第55页,负染技术,观察颗粒状生物材料外部形状惯用染色方法。,用重金属盐沉积到样品四面，样品四面散射电子能力就较强，因而表现为暗区；样品本身散射电子能力较弱，则表现为亮区，这么便能把样品外形与表面结构清楚地衬托出来。惯用,磷钨酸盐或醋酸铀,溶液。,电镜技术及超薄切片技术,第56页,电镜酶细胞化学技术,电镜酶细胞化学技术是在光镜细胞化学基础上发展起来新一门技术。酶存在特定位置称为酶定位。主要经过酶活性作用结果间接地证实酶存在。当前能在电镜下定位酶有三大类即水解酶、氧化酶和转移酶，有100各种。,注意：在整个处理过程中必须保留酶活性不受破坏。,电镜技术及超薄切片技术,第57页,以下以氧化还原酶（可分为氧化酶和脱氢酶两种）为例进行说明。,在氧化酶细胞化学反应中含有两个既分开又紧密联络底物，一个是生理底物如氧或过氧化氢；另一个是捕捉底物，通常是四盐酸3，3二氨基联苯胺（,DAB,）。DAB很轻易氧化，经过一系列化学改变生成,强嗜锇性,聚合物，再经锇酸固定就形成,锇黑,。,电镜技术及超薄切片技术,第58页,脱氢酶惯用捕捉剂为,铁氰化物,，它在酶作用下被还原为亚铁氰化物，在铜离子存在下深入形成高度不溶性,亚铁氰化铜,沉淀。,电镜技术及超薄切片技术,第59页,酶细胞化学常规操作流程,1、固定,：常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定,液，惯用缓冲液有二甲砷酸钠缓冲液及Tris缓冲液等。,2、切片,：普通采取组织切片机进行切片，厚度在4060m，也能够,用冰冻切片机切片。,3,、漂洗,：用配置孵育液缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟。,4、孵育,：孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内，,在震荡式恒温水浴箱中孵育，孵育温度普通为37。,5、漂洗,：用配置孵育液缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟，然后用,0.1M二甲砷酸钠缓冲液漂洗3次，每次10分钟，所用缓冲液,要保持在4左右。,6、后固定,：用0.1M二甲砷酸钠缓冲液配置1%锇酸固定1小时。,脱水、浸透、包埋、切片同常规超薄切片制作。,7、电镜观察,：超薄切片经烘干后直接进行电镜观察。假如反差不好，,能够进行铅铀双重染色，但必须有不染色切片对照。,电镜技术及超薄切片技术,第60页,免疫电镜胶体金标识技术,免疫电镜胶体金标识技术也称,金标法,（或免疫金染色）。金标法是利用胶体金（Colloidal gold）在碱性环境中带负电荷性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标识。电镜下金颗粒密度很高，清楚可辨。,胶体金是金水溶胶，主要用还原法制备。较多用还原剂有枸橼酸钠、白磷、鞣酸、乙醇、抗坏血酸、过氧化氢等。,电镜技术及超薄切片技术,第61页,枸橼酸三钠还原法,1）取0.01%氯化金（HAuCl4或AuCl3HCl溶液）100ml，放入洁净锥形瓶内煮沸。,2）取1%枸橼酸三钠水溶液4ml，加入煮沸氯化金中。,3）混合、搅拌、煮沸，约5分钟，溶液颜色由蓝紫橙红，冷却后即可。,此时胶体金颗粒直径约为15nm。如将枸橼酸三钠量分别降低至1.5ml、1.0ml、0.75ml,则胶体金颗粒直径将分别增至30、50或60nm.,电镜技术及超薄切片技术,第62页,胶体金标识物（金探针）制备,1,、胶体金标识蛋白质及其纯化,1,）取,100ml,胶体金,PH,为,7.2,。,2,）称取对应最适量蛋白质，于去离子水中溶解（,100ul,）。,3,）在磁力搅拌器中将上述两液混合、静置。,4,）,10,分钟后再加入胶体金稳定剂，如,3%,聚乙二醇（,PEG,）或,5%,小牛血清白蛋白（,BSA,）。,5,）用超速离心法去除未标识蛋白质。离心速度和时间取决于金颗,粒大小及蛋白质种类。胶体金标识羊抗兔,IgG,，以牛血清白蛋,白稳定者，先用低速离心,20,分钟（金颗粒,20nm,者用,250,转,/,分，,5,nm,者用,4000,转,/,分，视金颗粒实际大小情况而定离心速度）。留,取上清液，再以高速离心，,4,下离心,1,小时（金颗粒,20nm,者用,14000,转,/,分，,5 nm,者用,60000,转,/,分，视金颗粒实际大小情况而定,离心速度）。弃上清液，留取沉淀物备用。,6,）将沉淀物用,0.02M PBS(pH8.2,内含,1%BSA,或,PEG),悬浮、清,净，高速离心，重复三次，最终将胶体金标识物溶于原液体积,1/10,TBS,中，即可应用。,电镜技术及超薄切片技术,第63页,免疫金染色法，可分为,包埋前染色和包埋后染色,。包埋前染色对细胞膜穿透性差，普通只用于细胞表面抗原标识。所以，现今普遍采取,包埋后染色,。,电镜技术及超薄切片技术,第64页,电镜包埋后胶体金染色法,1）超薄切片80 nm左右置于无支持膜,镍网,上。,2）至110%H2O2液中处理10分钟1小时不等，越硬需要H2O2,浓度越高越利于抗体进入。,3）双蒸馏水洗3次，每次510分钟。,4）浮于正常羊血清（1：501：100）液滴上，室温3060分钟，,或1：5，5分钟。,5）PBS漂洗3分钟，PBS（内含1%牛血清白蛋白）PH8.2中，5分钟。,6）加适量稀释胶体金标识抗体液（1：301：100），淡红色为,适宜稀释液，420小时或室温10分钟2小时。,7）双蒸馏水洗3次，每次3分钟。,8）如做双重染色，则应将镍网翻过来，用另一类抗体血清，,重复27步骤。,9）5%醋酸铀染色，5分钟，双蒸馏水洗涤，3次。,10）枸橼酸铅染色，5分钟，双蒸馏水充分洗涤。,11）干燥后电镜观察。,结果：阳性抗原部位聚集金颗粒。,电镜技术及超薄切片技术,第65页,标本回顾性研究,石蜡块做超薄切片技术,1,、,定位取材,：依据光镜显示，切取需要部位，大小约,1mm,3,若干小块。,2,、,溶蜡,：先在,37,烘箱内熔蜡,4,小时，再二甲苯,37,烘箱内,浸泡,812h,，期间要震荡摇换一次。,3,、,水化,：用,100%,（,1,小时）、,90%,、,80%,、,70%,丙酮进行,水化（各,15,分钟），直到完全水化。,4,、,漂洗,：用缓冲液漂洗（,0.1M,磷酸缓冲液或二甲砷酸,钠缓冲液,),两次，各,15,分钟。,5,、固定：用,2.5%,戊二醛固定,2,小时以上，其余步骤同常规,电镜样品制作处理。,电镜技术及超薄切片技术,第66页,1,、生命科学上应用：几乎包含全部学科研究领域都已经用,到或即将用到电镜技术。比如,动物或植物细胞超微结构,（包,括细胞核、细胞质及其细胞器等内容物、细胞间连接等）形态观察，经过对比观察，对动植物形态在超微结构水平上进行分类、分型，以探讨遗传、变异及病理病因机理或机制，为生命科学基础研究所不可或缺研究伎俩。,利用常规电镜技术和特殊电镜技术如,免疫,电镜技术、电镜,酶细胞化学,技术、电镜,原位杂交,技术等能够进行细胞细胞超微结构及超微病理分析，以及细胞内抗原、酶等定位、定性甚至定量研究等。,电镜应用介绍,电镜技术及超薄切片技术,第67页,2,、,在临床诊疗中应用,：主要应用于临床活检组织超薄切片观察分析。经过活检组织细胞形态改变及其相互间关系，依据其形态改变规律和特点进行分析诊疗，为临床病理诊疗或辅助诊疗提供较可靠形态,依据,。,在判别,肿瘤组织起源、分化程度、浸润情况,等，以及疾病,病理分型或分期,和,疾病,早期,病理改变等方面，电镜比光镜含有一定优势。病原,微生物,（如细菌、病毒、支原体、囊虫等）形态观察或判别也是电镜观察强项。,电镜技术及超薄切片技术,第68页,3,、,材料上应用,：包含材料,内、外,部结构或形貌观察，颗粒,形态,、,大小,测量、排列分布等情况。假如应用能谱分析仪器，就能够检测材料元素组成、含量、分布等情况。,4,、其它领域上研究：如,矿物质、考古,等。,电镜技术及超薄切片技术,第69页,电镜应用及超微结构,电镜技术及超薄切片技术,第70页,支原体,绒毛内支原体,细菌,卡氏肺囊虫,隐球菌可见荚膜,肺内大肠杆菌感染,电镜技术及超薄切片技术,第71页,艾滋病病毒,艾滋病病毒,病毒,乙型肝炎病毒,电镜技术及超薄切片技术,第72页,核仁,细胞核,质膜内褶,线粒体,溶酶体,电镜技术及超薄切片技术,第73页,卵细胞示意图,透明带,卵黄颗粒,人类卵细胞局部结构,精子鞭毛横断面,系统,小鼠精子结构,线粒体鞘,石璜精子结构,泥螺精子细胞,尾部结构,细胞核,电镜技术及超薄切片技术,第74页,核固缩,突触结构,中心体,神经元细胞,心肌细胞线粒体固缩,胃腺癌细胞肝转移,肌丝溶解现象,RER,版层状排列,电镜技术及超薄切片技术,第75页,骨骼肌糖原沉积,Cap,血脑屏障,内皮细胞,内弹力板,脱髓鞘现象,细胞质溶解,弓形虫感染细胞,肝细胞,淋巴细胞,隐窝细胞,电镜技术及超薄切片技术,第76页,病毒颗粒,电子致密物,细胞水肿,细菌,菌毛,细胞壁,肝细胞糖原沉积,粗面内质网,电镜技术及超薄切片技术,第77页,白血病淋巴细胞,胶体金颗粒,巨噬细胞吞食现象,纳米碳管,电镜技术及超薄切片技术,第78页,足细胞及足突结构,近曲小管上皮细胞,线粒体结构纵切,近曲小管上皮细胞微绒毛,足细胞,足突,溶酶体,线粒体,微绒毛（刷状缘）,电镜技术及超薄切片技术,第79页,果蝇,果蝇复眼,米象,电镜技术及超薄切片技术,第80页,金属出芽,触角,头发,晶体,粘膜表面,化纤,电镜技术及超薄切片技术,第81页,细菌,培养细胞,细菌,肿瘤细胞,电镜技术及超薄切片技术,第82页,人造纤维,人造血管,微球,电镜技术及超薄切片技术,第83页,电镜技术练习题,1、透射电镜标本取材基本要求并简明说明。,2、什么是瑞利准则？电镜与光镜在原理上有何相同和不一样之处？,3、简述透射电镜及扫描电镜样品制作流程,4、惯用化学固定方法有哪些？,5、普通透射电镜包含那些结构？请简明叙述。,6、简述电镜在生命科学中应用,7、简述电镜球差和畸变及其形成原因。,8、简述电磁透镜及其聚焦原理,9、什么是反差？简述电镜荧光图像反差形成原因。,10、游离细胞取材方法有哪些?并简述其处理方法。,11、简述超薄切片流程并简明说明。,12、简述石蜡块做超薄切片样品制作流程,13、简述负染技术及其应用。,电镜技术及超薄切片技术,第84页,选择题,人眼平均分辨率为（）,A 0.4mm B 0.2mm C 0.3mm D O.2m E 0.4m,电子枪产生电子是（）,A 入射电子 B 透射电子 C 弹性散射电子 D 二次电子 E,俄歇电子,用来显示组织和细胞内部超微结构像电子为（,）,A 入射电子 B 透射电子 C 弹性散射电子 D 二次电子 E,反射电子,下面哪项不属于透射电镜样品制备技术（,）,A 镀膜 B 负染技术 C 电镜细胞化学技术,D 超薄切片技术 E 半薄切片技术,5、下面哪项不属于扫描电镜样品制备技术（）,A 表面干燥法 B 浸透包埋 C 冷冻复型,D 冷冻割断法 E 组织导电法,6、下面哪种电镜既可观察结构又对组织细胞内元素成份进行分析（）,A 透射电镜 B 扫描电镜 C 分析电镜,D 超高压透射电镜 E 原子力显微镜,7、观察组织细胞内部超微结构应选取哪种电镜（）,A 原子力显微镜 B 透射电镜 C 扫描电镜,D 磁力显微镜 E 激光扫描共聚焦显微镜,电镜技术及超薄切片技术,第85页,8、下面哪项不是超高压电子显微镜优点（）,A 可用于观察厚切片 B 能够提升分辨率 C 可提升图像质量,D 可观察复杂结构 E 降低辐射损伤范围,9、下面对扫描电镜描述错误是（）,A 利用反射电子和二次电子成像 B 用于观察组织细胞内部结构,C 样品室大，可用于观察块状样品 D 景深长，立体感强,E 样品可被升降和倾斜,10、电子枪由（）组成,A 阴极、阳极 B 阴极、栅极 C 阳极、栅极,D 阴极、阳极、栅极 E 正极、负极、栅极,11、二次电子监测系统不包含（）,A 检测器 B 阴极射线管 C 闪烁器,D 光电倍增器 E 视频放大器,12、固定液中戊二醛惯用浓度为（）,A 0.5%B 2.0%C 2.5%D 4%E 10%,13、下面对透射电镜描述不正确是（）,A 利用透射电子成像 B 观察细胞内部超微结构,C 可观察负染标本 D 景深长、立体感强,E 分辨率高，性能最完善,电镜技术及超薄切片技术,第86页,14、透射电镜反差取决于样品对（）散射能力,A 二次电子 B 入射电子 C 透射电子,D 散射电子 E 反射电子,15、观察生物样品时，透射电镜加速电压普通为（）,A 20-50KV B 50-80KV C 80-100KV,D 100-120KV E 120KV以上,16、超薄切片是指厚度小于（）切片,A 200nm B 300nm C 400nm D 100nm E 500nm,17、超薄切片技术步骤为（）,A 取材、固定、脱水、包埋、切片、染色,B 取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片、染色,C 取材、脱水、固定、包埋、切片、染色,D 取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片,E 取材、脱水、固定、包埋、切片,18、不属于透射电镜标本取材要求（）,A 动作快 B 组织小 C 切割狠 D 部位准 E 环境冷,19、以下试剂中属于强氧化剂以及对粘膜损伤最严重是（）,A 戊二醛 B 环氧树脂 C 锇酸 D 磷酸缓冲液 E MNA,20、负染技术中最惯用染色剂是（）,A 锇酸 B 甲苯胺蓝 C 磷钨酸 D 柠檬酸铅 E 溴化银,电镜技术及超薄切片技术,第87页,谢谢！,电镜技术及超薄切片技术,第88页,