生物信息学软件及使用技巧.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,*,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物信息学软件及使用技巧,Bioinformatics Basics,吴元明 讲师,第四军医大学基础部,wuym,第1页,第1页,生物信息学软件分类,单机分析软件：,如winplas,在线分析软件:,如webcutter,生物学数据库:,如NCBI,DDBJ,EBI,第2页,第2页,生物信息学软件意义,分析和处理试验数据和公共数据，加快研究进度，缩短科研时间。,提醒、指导、替换试验操作，利用对试验数据分析所得结论设计下一阶段试验。,用计算机管理试验数据。,Bioinformatics Basics,第3页,第3页,生物学软件惯用功效（核酸类）,DNA 序列片断拼接-Contig Express,分析mRNA开放读框,限制性酶切位点分析,DNA 模拟电泳,PCR 引物设计,RNA二级结构分析,Bioinformatics Basics,第4页,第4页,生物学软件惯用功效（蛋白类）,蛋白一级结构分析（氨基酸分析）,蛋白二级结构分析（结构域分析）,蛋白三级结构分析（空间结构分析）,Bioinformatics Basics,第5页,第5页,生物学软件惯用功效（共同类）,DNA、蛋白质序列同源分析,进化树构建,Bioinformatics Basics,生物学软件惯用功效（其它类）,质粒绘图类,图象处理软件,第6页,第6页,一、DNA 序列片断拼接,（电子基因克隆）,取得感兴趣EST，在,dbEST,数据库中找出EST最有路径是寻找同源序列，原则：长度100bp，同源性50%以上、85%下列。,然后将检出序列组装为重叠群,（contig）,，以此重叠群为被检序列，重复进行BLAST检索与序列组装，延伸重叠样系列，重复以上过程，直到没有更多重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸，有时可取得全长基因编码序列。,再与GeneBank核酸数据库进行相同性检测，假如有准确匹配基因，将EST序列数据据EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。,第7页,第7页,Vector NTI 5.2-,contig Express,第8页,第8页,二、分析mRNA开放读框,（一)5-UTR结构,1、mRNA5端m7G帽有增强翻译水平作用2、“上游AUG密码子”(位于起始AUG上游其它AUG密码子)存在往往克制下游开放读框翻译效率3、起始AUG旁侧序列对翻译效率影响,Kozak序列：GCCAUGG,(二)3-UTR结构,1poly(A)尾增长翻译效率2富含UA序列克制翻译。,第9页,第9页,二、分析mRNA开放读框,取得尽量长mRNA序列。,分析也许读框（六种）。,软件：Vector NTI，Omiga 等。,在线:,（,au.expasy.org/tools/dna.html,）,选取最也许一个。看是否符合各种条件。,分析环节：,第10页,第10页,当前应用蛋白质结构预测算法,同源预测(一级结构决定高级结构),结构与结构相对比（DALI算法）,当前最先进结构预测办法：,结构类辨认（fold recognition）,先建立一个已知结构类数据库（fold library)，将待测序列“穿过”该数据库构成座标，并依据事先拟定物理限制，逐一位置移动（threading，sequence-structure alignment)，并一个函数（sequence-structure fitness alignment)判断序列与结构类符合程度，找出未知序列在目的结构上能量最优和构象最稳固比对位置。对计算机要求很高。,第11页,第11页,Cn3D 2.5 显示 1EQF A链三维结构,第12页,第12页,十一、,质粒绘图,winplas,Plasmid processor,DMUP beta,Vector NTI,第13页,第13页,Winplas 2.6 质粒构建,第14页,第14页,七、DNA与蛋白质序列同源分析,（进化树构建）,个体与数据库比较。,两个或两个以上个体比较。,不同情况：,internet网络。如，NCBI,BLAST,;,ExPASy,Alignment,.,软件。如，Vecotr NTI,分析办法：,第15页,第15页,Vector NTI Suit AlignX 同源比较主窗口,第16页,第16页,Vector NTI Suit 同源比较进化树,第17页,第17页,八、蛋白质一级结构分析,氨基酸构成。,PI,MW,亚细胞定位,包括：,internet网络。如，ExPASy,primary structure analysis,topology prediction,.,软件。如，Vecotr NTI,Antheprot,分析办法：,第18页,第18页,Omiga 2.0 ORF Map,第19页,第19页,三、限制性酶切位点分析,一个能识别特殊，短核苷酸序列，并在DNA一些位点上切割蛋白质。细菌包含了400种这么酶，能识别和切割100种以上不同DNA序列。,如：EcoRI 识别序列,定义：,GAATTC,GTTAAC,第20页,第20页,三、限制性酶切位点分析,找到待分析核酸序列。,利用Vector NTI软件分析。,利用webcutter 2.0在线分析。（,NTI或其它软件分析。,分析环节：,DNA模拟电泳含有一定试验预示功效。,模拟电泳不能作为试验结果或依据。,注 意：,第22页,第22页,Vector NTI Suit 5.5 模拟电泳,第23页,第23页,Gene Construction Kit 2.0 模拟电泳,第24页,第24页,五、PCR 引物设计,（杂交探针设计）,引物设计原则,引物要跟模板紧密结合；,引物与引物之间不能有稳定二聚体或发夹结构存在；,引物不能在别非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。,第25页,第25页,如：,引物长度（primer length），,产物长度（product length），,序列Tm值(melting temperature)，,G值(internal stability)，,引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin），,错误引起位点（false priming site），,引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增长限制酶切点，引进突变等。,引物设计,需要考虑原因,第26页,第26页,引物设计要点,普通引物长度为16-23bp，惯用长度为18-21bp，过长或过短都不适当。,引物3端碱基普通不用A，由于A在错误引起位点引起效率相对比较高，而其它三种碱基错误引起效率相对小一些。,引物GC含量普通为45-55%，过高或过低都不利于引起反应。上下游引物GC含量不能相差太大。,引物所相应模板序列Tm值最好在72左右，当然由于模板序列本身构成决定其Tm值也许偏低或偏高，可依据详细情况灵活利用。,第27页,第27页,引物设计要点,G值反应了引物与模板结合强弱程度，也是一个主要引物评价指标。,普通情况下，在Oligo 5.0软件G值窗口中，引物G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间部分G值较高，而3端G值相对较低，且不要超出9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有助于正确引起反应而可预防错误引起。,其原理，引物与模板应含有较高结合能量，这样有助于引物与模板序列整合，因此5端与中间段G值应较高，而3端G值影响DNA聚合酶对模板DNA解链，过高则不利于这一环节。,第28页,第28页,引物设计要点,可能错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成相同性，相同性高则错误引发率高，错误引发引发率普通不要高过100，最好没有错误引发位点，如此能够确保不出非目标产物假带。,引物二聚体及发夹结构能量普通不要超出4.5，不然容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓度从而造成PCR正常反应不能进行。,对引物修饰普通是增加酶切位点，应参考载体限制酶识别序列确定，经常对上下游引物修饰序列选取不同限制酶识别序列，以有利于以后工作。,第29页,第29页,关于引物自动搜索和评价分析,推荐使用自动搜索软件：,Primer Premier 5.0,推荐使用引物评价软件：,Oligo 5/6,第30页,第30页,OLIGO 5.0 PCR 引物设计,第31页,第31页,六、RNA二级结构预测,主要软件：,DNAsis,RNAstructure,RNA draw,Vienna RNA Package RDFolder是RNA二级结构预测Web服务器,（,北京大学生物信息学中心,）,意 义：,分析RNA结构稳定性，为也许（酶、核酸）作用位点分析等提供依据。,第32页,第32页,DNASIS 2.5 RNA 二级结构预测,第33页,第33页,DNASIS 2.5 tRNA 二级结构预测,第34页,第34页,RNAStructure 3.5 RNA 二结构预测,第35页,第35页,Antheprot 5.0 预测蛋白跨膜区域,第36页,第36页,Antheprot 5.0 预测信号肽断裂点,第37页,第37页,九、蛋白质二级结构分析,Helix,Sheet,Turn,Coil,包括：,internet网络。,如，ExPASy,secondary structure analysis,软件。如，DNAsis,DNAstar,Vecotr NTI,分析办法：,第38页,第38页,DNASIS 2.5 蛋白二级结构预测,第39页,第39页,DnaStar 之 Protean 对dif14蛋白二级结构预测,Bioinformatics Basics,第40页,第40页,十、蛋白质空间结构分析,该项技术算法十分复杂，尚未成熟。PDB及MMDB数据库当前仍然严禁收录软件预测出来蛋白高级结构模型。,X射线晶体学技术和多维核磁共振技术是当前人们结识蛋白高级结构主要手段，但两种技术都有不足之处。前者要求必需得到高原则蛋白晶体，后者对分子量不小于3万大蛋白不能测定。因此理论模拟和结构预测显得十分主要。,序列与结构关系本源在于“蛋白质折叠问题”，这是近期研究关注焦点。,第41页,第41页,