血液代用品医学宣教.pptx

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,第六章 血液代用具,血液代用品医学宣教专家讲座,第1页,Contents,概论,1,血红蛋白结构和功效,2,血红蛋白化学修饰,4,血红蛋白制备工艺,5,3,血液代用具类型,主要内容,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第2页,1,概论,血液功效,常规输血忧患,血液代用具含有特点,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第3页,血液功效,运输氧气、二氧化碳和营养物质及代谢产物，能够调整组织水分、酸碱度、渗透压和温度，还能够吞噬细菌（白细胞和巨噬细胞），产生抗体（淋巴细胞）等,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第4页,血液,血细胞,红细胞,白细胞,血小板,血浆,(,细胞间质,),水,血浆蛋白、糖、维生素、激素、代谢产物及无机盐等,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第5页,血细胞,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第6页,常规输血忧患,输血时必须血型相配，延误治疗而造成死亡；,血液污染严重，威胁输血安全；,健康供血人群不足，血液严重短缺；,血液保留期短。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第7页,血液代用具含有特点,无菌、无病毒、无毒性、无热源、对输入体,无免疫原性,适合各种血型,与人血液全部组分含有相容性，在最大程度上代替,人血生理功效（具备运输氧、二氧化碳能力，提,供缓冲和自由基淬灭能力，可起到血浆扩容作用并维,持胶体渗透压,),在血管内有较长保留时间，代谢产物无毒并能经,过正常渠道排出,储存时间长，而所需条件不高。,血液代用具指含有携带氧气和扩容功效溶液。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第8页,2,血红蛋白结构和功效,血红蛋白结构和功效；,影响血红蛋白氧亲和力原因。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第9页,Hb,组成与结构,Hb,4,条珠蛋白链,：,1412,；,1462,（共,574,个,AA,）,4,分子血红素,每条多肽链结合一个血红素分子组成一个,Hb,单位,Hb,是四聚体，在红细胞中占干重,95,Hb,组成,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第10页,血红蛋白,两个,肽链,两个,一肽链,四个亚铁红素基团,每个肽链围绕一个,亚铁血红素基团，,此基团可携带,一分子氧或一分子二,氧化碳，,血红蛋白因含有,血红素,而,呈,红色。,血红蛋白特点：,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第11页,血红蛋白功效,血红蛋白是一个双向呼吸载体，主要负责运输,氧和二氧化碳；,血红蛋白和氧结合与解离主要取决于氧分,压和血液,pH,。血红蛋白氧饱和分数和氧分压,关系呈,S,形曲线；,曲线说明血红蛋白与氧结合随氧分压增高,而加紧，释放氧则伴随氧分压降低而加紧。,这么血红蛋白可在较窄氧分压范围内完成输,氧任务，使机体内氧水平不致有较大起伏。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第12页,影响血红蛋白对氧亲和力原因,P,50,；,影响血红蛋白氧亲和力原因包含红细胞内,H,+,、,CO,2,，,氧,2,3-DPG,以及其它阴离子浓度等；,波尔效应；,2,3-DPG,影响。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第13页,3,血液代用具类型,无载氧功效血管扩容剂（第一代红细胞代用）；,全氟碳化合物、化学修饰血红蛋白及基因重组血红蛋白（第,二代血红蛋白代用具）；,模拟天然红细胞膜和红细胞内生理环境，用仿生高分子材,料将血红蛋白包裹起来，制备成“人工红细胞”。（第三代血,液代用具）,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第14页,全氟碳化合物,全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)国外很早就有些人开始血液代用具研究。1966年，由美国Cincinnati大学Clark 首创并做动物试验，发觉小鼠在含有PFC饱和氧中能正常生存。1978年Naito,等首次将第一代氟碳化合物,（,Fluosol DA),用于临床试验,。PFC优点是能够直接用化学方法合成，价格低廉，而且不受生物起源影响，防止因异体输血而造成交叉感染。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第15页,全氟碳化合物,定义及性质,PFC是将碳氧化合物中氢原子全部用氟原子取代而产生一类环状或直链状结构有机化合物。PFC随温度改变而可成固、液、气态，常温下PFC为液态，但不溶于水，需要经过乳化变为可溶性乳剂。PFC氧离曲线与氧分压呈直线相关，不受pH值影响，其溶解,氧,能力约为血液2倍、水20倍,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第16页,全氟碳化合物,全氟萘烷,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第17页,全氟碳化合物,优点：,生产不依赖于过期人血或者其它生物起源血液，能够大批量生产，而且纯度能够很好控制；对于不愿意接收他人血液或者血液替换品宗教信仰者。可使用这种化学合成物；,缺点：,使用时必须呼吸,70%-100%,氧；有效时间短；存放需要适当温度和条件；流感样症状。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第18页,血红蛋白类血液代用具,天然血红蛋白；,血红蛋白类血液代用具；,1,）血红蛋白制备；,2,）血红蛋白化学修饰。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第19页,天然血红蛋白,比全氟碳化合物更符合人体生理需要，起源广泛；,20,世纪,30,年代，,Amberson,将制备血红蛋白输送给动,物进行研究，结果表明这种血红蛋白能有效地输送氧,气，不过对肾脏毒性大。其原因主要是溶血质中存在,少许膜基质及杂蛋白；,无基质血红蛋白（,stroma free hemoglobin,SFH),。,1,）失去,DPG,变构调解作用（放氧和载氧降低）；,2,）易解聚为,二聚体，氧传递能力下降，轻易从肾,脏滤出，形成血尿，其代谢产物还会在肾脏小管腔,内产生毒性效应。,3,）在体内保留时间短。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第20页,血红蛋白类血液代用具,血红蛋白制备,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第21页,样品处理粗分离纯化纯度判定,1.,样品处理：,蛋白质提取和分离步骤,操作过程,可选取猪、牛、羊或其它脊椎动物血液来分离血红蛋白,(1),红细胞洗涤,:,洗涤目标,:,去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白,分离纯化，,洗涤次数不可过少。,洗涤操作：,1,、采集血样。,2,、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离效果）,3,、吸收血浆：上层透明黄色血浆。,4,、盐水洗涤：用五倍体积质量分数为,0.9,氯化钠溶液洗涤。,5,、低速离心（低速短时间）,6,、重复,4,、,5,步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤洁净。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第22页,首次离心后结果,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第23页,次洗涤后结果,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第24页,(2),血红蛋白释放：,加蒸馏水到,原血液体积,，,再加,40,体积,甲苯,，,置于,磁力搅拌器,上充分搅拌,10,分钟,（,加速细胞破裂,）,细胞破裂释放出,血红蛋白,。,(3),分离血红蛋白溶液：,过程：,将搅拌好混合液转移到离心管内，以,r/min,速度离心,10 min,。,试管中溶液层次：,第,1,层（最上层）：甲苯层（,无色透明,）；第,2,层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（,白色薄层固体,）；第,3,层（中下层）：血红蛋白水溶液层（,红色透明液体,）；第,4,层（最下层）：杂质沉淀层（,暗红色,）。,分离：,用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层,红色透明液体,。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第25页,(4),透析：,过程：,取,1ml,血红蛋白溶液装入,透析袋,中，将透析袋放入盛有,300ml,物质量浓度为,20mmol/l,磷酸缓冲液,中（,pH,为,7.0,），透析,12,小时。,透析目标：,除去样品中分子量较小杂质,。,原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第26页,透析过程动画演示,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第27页,利用透析袋透析,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第28页,凝胶色谱操作,:,（,1,）凝胶色谱柱制作：,取长,40,厘米，内径,1.6,厘米玻璃管，,两端需用砂纸磨平。,底塞制作：,打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用,100,目尼龙纱包好，插到玻璃管,一,端,。,注意事项,：,底塞中插入玻璃管上部不得超出橡皮塞凹穴底面，不然难以铺实尼龙网，还会造成液体残留，蛋白质分离不彻底。,顶塞制作：,打孔安装玻璃管,。组装：,将上述三者按对应位置组装成一个整体,。,安装其它从属结构。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第29页,（,2,）凝胶色谱柱装填,凝胶选择：,A,、材料：,交联葡聚糖凝胶（,G-75,）。,B,、代表意义：,“,G”,表示凝胶交联程度，膨胀程度及分离范围,。,75,表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水,7.5,克。,凝胶前处理：,配置凝胶悬浮液：,计算并称取一定量凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,凝胶色谱柱装填方法：,A,、固定：,将色谱柱装置固定在支架上。,B,、装填：,将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,注意：,1,、凝胶装填时尽可能紧密，以降低凝胶颗粒之间空隙。,2,、装填凝胶柱时不得有气泡存在：,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质洗脱次序，降低分离效果,。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第30页,装配好凝胶柱,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第31页,洗涤平衡：,装填完成后，马上用缓冲液洗脱瓶，在,50cm,高操作压下，用,300ml,20mmol/l,磷酸缓冲液（,pH,为,7.0,）,充分洗涤平衡,12,小时,。,注意：,1,、,液面不要低于凝胶表面，不然可能有气泡混入,，影响液体在柱内流动与最终生物大分子物质分离效果。,2,、,不能发生洗脱液流干，,露出凝胶颗粒现象,。,（,2,）凝胶色谱柱装填,50cm,高,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第32页,（,3,）样品加入与洗脱,调整缓冲液面：,打开下端出口，使柱内缓冲液迟缓下降到与凝胶面平齐，关闭出口。,滴加透析样品,：,吸管吸,1ml,样品加到色谱柱顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁围绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,样品渗透凝胶床：,加样后打开下端出口，使样品渗透凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。,洗脱：,小心加入,pH=7.0,20mmol/l,磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。,搜集：,待红色蛋白质靠近色谱柱底端时，用试管搜集流出液，每,5ml,搜集一试管，连续搜集。,（在分离过程中，假如红色区带均匀一致移动，说明色谱柱制作成功）,注意：,正确加样操作：,1,、不要触及并破坏凝胶面。,2,、贴壁加样。,3,、使吸管管口沿管壁围绕移动。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第33页,（,3,）样品加入与洗脱,注意：,正确加样操作是：,1,、不要触及并破坏凝胶面。,2,、贴壁加样。,3,、使吸管管口沿管壁围绕移动。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第34页,搜集得到纯化后蛋白,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第35页,血红蛋白类血液代用具,血红蛋白化学修饰,目标：稳定血红蛋白,4,聚体结构，增加蛋,白相对分子量，以到达降低毒性,作用。,原理：表面有许多可修饰功效基团,类型：分子内交联血红蛋白、多聚血红蛋,白、共轭血红蛋白、脂质体包封血,红蛋白；基因重组血红蛋白,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第36页,分子内交联血红蛋白,血红蛋白化学修饰,血红蛋白肽链间交联，降低氧亲和力。,试剂：含有负电基团并能结合在血红蛋白中心,腔位置，如双阿司匹林类化合物（,3,，,5-,二溴水杨基双延胡索酸酯），吡哆醛,类化合物。,产品：美国,Baxter,企业,DCLHb,、加拿大,Hemosol,企业,Hemolink,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第37页,DCLHb,血红蛋白化学修饰,diaspirin cross-linked hemoglobin,。用,3,，,5-,二溴,水杨基双延胡索酸酯对脱氧无基质血红蛋白,进行分子内修饰生成,链间交联产物。相对分,子量,65000,。,临床：患者出现皮肤黄染、无症状血尿、肠梗,阻发生率显著提升，三期临床死亡率增加，于,1999,年底止临床试验。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第38页,Hemolink,血红蛋白化学修饰,O-,棉籽糖交联血红蛋白，由各种相对分子量,聚合、非聚合成份组成，含交联,Hb,大于,95%,。,临床：三期已在美国、英国和加拿大开展。不良,反应是血压升高，但在,48-72,小时内恢复对肝肾功,能无影响。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第39页,多聚血红蛋白,血红蛋白化学修饰,分子间修饰主要是形成份子聚合物，从而预防,血红蛋白四聚体快速解离，延长在血管中,停留时间。,交联剂主要有戊二醛、乙醇醛、糖醛等。与血红,蛋白反应时无特异 结合位点，属于多位点修,饰，形成相对分子量不等交联聚合体，从而,降低溶液中分子数目，溶液渗透压和黏度也随,之降低。,产品：美国,Biopure,企业,Hemopure,和,Northfield Laboratories,企业生产,Polyheme,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第40页,共轭血红蛋白,血红蛋白化学修饰,血红蛋白与天然或者合成可溶性高分子反应，形成共轭结合物，能够大大增加,Hb,稳定性，有效地预防四聚体解离；同时包裹在,Hb,周围高分子链覆盖了抗原位点，起到了降低免疫原性，提升存留时间；而且，分子稳定性好，能在循环中维持较高氧含量，并降低网状内皮系统吞噬，较少可能过敏和免疫反应。,可使失血,30-50%,狗在两周内无死亡现象，体重、食物摄入量均正常，无显著毒性反应，尿液分析和血液动力学指标也无显著改变。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第41页,化学修饰存在问题,血红蛋白化学修饰,产品是非均一性混合物；,病原微生物还未处理；,大分子聚合体使一些蛋白溶液引发许多病症；,终产物不稳定性，造成交联,Hb,间重新排列；,重现率低。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第42页,脂质体包封血红蛋白,血红蛋白化学修饰,模拟天然红细胞膜和红细胞内生理环境，用仿生高分子材料将血红蛋白包裹起来，制备成“人工红细胞”,优点：,1,）血红蛋白不直接暴露于内环境；,2,）可将红细胞所属各种酶类包含在人工细胞内，防止四聚体解离而产生肾毒性；,3,）脂质体不与血型抗体反应，延长其循环时间；,4,）血红蛋白未经过化学修饰，确保其正常生理功效；,5,）包裹天然红细胞内高铁血红蛋白还原系统；,6,）包封入,DPG,，可降低,Hb,氧结协力，增加传递氧能力。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第43页,脂质体包封血红蛋白,血红蛋白化学修饰,制备两个基本条件：,1,）制备过程中确保极易被氧化血红蛋白不被氧化；,2,）脂质体包封血红蛋白及其辅助成份在制备和保留过程中有足够稳定性，并使脂质体包封血红蛋白循环存留时间延长,工艺发展,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第44页,脂质体包封血红蛋白工艺发展,血红蛋白化学修饰,第一代脂质体：,从鸡蛋、大豆中提取不饱和脂肪酸、胆固醇以及维生素,E,等造成：,1,）、半衰期短；,2,）、不饱和脂质在血浆中氧化使血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白。,第二代脂质体：,长链饱和磷脂，延长半衰期，降低了脂质过氧化。（合成二硬脂酰卵磷脂）,第三代：,第二代脂质体和冻干保留血红蛋白方法结合。（冻干粉末状脂质体包封血红蛋白）,日本研制,NRC,（,Terumo,企业,-,泰尔茂,),Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第45页,脂质体包封血红蛋白缺点,血红蛋白化学修饰,主要不良反应是被网状内皮细胞吞噬，抑制网状内皮系统功效，使机体免疫功效受损，易引发感染性休克等,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第46页,基因重组血红蛋白（,rHb),血红蛋白化学修饰,经过酵母、昆虫、转基因动物、植物进行重组血红蛋白表示。,含有些人为控制血红蛋白产量及从根本上消除病毒污染有点。,基因策略：,1,）使红细胞蛋白亚基间串联；,2,）利用氢键、疏水作用力等稳定四聚体；,3,）将特定氨基酸突变为半胱氨酸使形成链间二硫键。,存在问题：表示量低。,关键步骤：构建表示,rHb,工程菌；提升分离纯化技术。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第47页,血红蛋白制备,交联剂：辛二酸二琥珀酸亚胺酯（,DSS),。,交联类型：分子内交联。,交联过程：,步骤：,1,）高纯度血红蛋白制备；,2,）取浓缩血红蛋白溶液，用,50mM,PBS(pH7),稀释，置于容器中，然后加入溶有,40mM DSS,DMSO,溶液，,DSS,与血红蛋白质量比：,10,：,1,，在,N,2,保护下反应,1h;3),反应后用超滤膜浓缩并更换生理缓冲液，操作温度为,4,。,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第48页,思索题,什么是血液代用具？一个好血液代用具应具备,哪些特点？,血液代用具发展能够分为那几个阶段？,血红蛋白修饰方法有哪些？各有什么优缺点？,Company Logo,血液代用品医学宣教专家讲座,第49页,