免疫原和抗血清制备.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,免疫原和抗血清制备,免疫原和抗血清制备,第1页,案例一,常州狂犬疫苗造假事件,该企业生产4个批次人用,狂犬疫苗,效价低于,国家标准，可能造成疫苗接种后免疫抗体水平低，无法充分,发挥疫苗应有,预防保护,作用，属于不合格产品。,免疫原和抗血清制备,第2页,什么是疫苗？,抗原？,抗体？,作用？,1,2,3,4,免疫原和抗血清制备,第3页,疫苗,病原微生物,及其代谢产物,预防疾病,用于人工主动免疫生物制剂,人工减毒、灭活、利用基因工程等,经过特殊处理抗原,免疫原和抗血清制备,第4页,A vaccine is a,biological preparation,that improves immunity to a particular disease.A vaccine typically contains an,agent,that,resembles a disease-causing microorganism,and is often made from,weakened or killed forms of the microbe,its toxins or one of its surface proteins,.The agent stimulates the bodys immune system to recognize the agent,as foreign,destroy it,and remember it,so that the immune system can more easily recognize and destroy any of these microorganisms that it later,encounters,.,免疫原和抗血清制备,第5页,疫苗分类,传统,新型,传统,新型,传统,新型,类毒素,重组抗原疫苗,重组载体疫苗,DNA疫苗,减毒活疫苗,灭活疫苗,亚单位疫苗,合成肽疫苗,基因工程疫苗,免疫原性强病原微生物，如伤寒、霍乱等，理化方法灭活,人工诱导变异或从自然界中筛选毒力高度减弱病原微生物,用0.3%-0.4%甲醛处理，丧失毒性外毒素,去除有害成份，保留免疫原性成份，脑膜炎球菌荚膜疫苗,将含有免疫原性多肽抗原或氨基酸序列与适当载体或佐剂结合成疫苗,采取DNA重组技术制备只含保护性抗原组分基因工程疫苗,将编码病原体免疫原性基因插入减毒病毒或细菌，接种到人体,将编码抗原基因转入真核表示载体后注入人体，它需要人体细胞来利用这段基因自己表示抗原,免疫原和抗血清制备,第6页,疫苗大致能够分为六大类：,灭活疫苗，是被彻底杀死病原，相当于把反动分子枪毙以后曝尸示众，因为是已经死掉阶级敌人，,往往造成革命队伍警觉性不很高，常需要重复刺激；,减毒活疫苗，其实就是能够改造好黑五类后代，经过教育改造，已经减弱或丧失了危害性，进入人体后现身说法介绍反革命分子长相，,而且能够繁殖供长久围观，效果很好，但也存在突然又反叛危险，,所以在筛选确认时花费时间极长；,类毒素疫苗，是处理后细菌外毒素，相当于,阶级敌人便便经过消毒后给革命群众作为识别特征,；,亚单位疫苗，是除去其它成份后提取病原体中有效免疫原所得，如多糖类疫苗等，,相当于将谋逆贼子砍头后传首九边以供识别,；,免疫原和抗血清制备,第7页,上述种种，均直接起源于病原，真正,像照片,，其实是,基因重组疫苗和DNA疫苗，它们都是对病原体摄影找到编码免疫原基因这段基因相当于底片，,在基因重组疫苗中，该基因被插入表示系统比如把乙肝HBS抗原基因植入酵母菌当中，,酵母菌就是冲片机,，表示出抗原相当于冲印好照片，经过纯化制成疫苗；,DNA疫苗则是将编码抗原基因转入真核表示载体后注入人体，它需要人体细胞来利用这段基因自己表示抗原-,相当于上级只发放底片，得自己冲洗,。,免疫原和抗血清制备,第8页,免疫原,疫苗,抗原,免疫原和抗血清制备,第9页,抗原,诱导机体产生免疫应答（免疫原性）,与免疫应答产物结合（抗原性）,疫苗,经过特殊处理,诱导机体产生免疫应答,免疫原,诱导机体产生免疫应答,抗原,半抗原,仅含有抗原性,免疫原和抗血清制备,第10页,疫苗都是免疫原？,免疫原都是疫苗？,免疫原都是抗原？,抗原都是免疫原？,免疫原和抗血清制备,第11页,疫苗,免疫原,抗原,免疫原和抗血清制备,第12页,合格疫苗？,安全性,有效性,专一性,可取得性,适合大批量生产,易保留,经济,免疫原和抗血清制备,第13页,怎样制备？,疫苗制造过程，大致上能够分成4个别：,1.筛选种毒；,2.扩繁病原；,3.处理纯化；,4.验证批签。,免疫原和抗血清制备,第14页,怎样制备？,颗粒性抗原制备（细胞、细菌、寄生虫等）,灭活疫苗,细胞抗原（绵羊红细胞）经,生理盐水等溶液,洗净，配制成一定浓度；,细菌抗原 纯菌增菌后处理,制备菌体(O)抗原置于100水浴2-2.5h去除鞭毛(H)抗原；,制备H抗原，菌液用0.3%-0.5%甲醛处理；,制备细菌毒素抗原，杀菌后用0.5%-1%氯化钙处理。,免疫原和抗血清制备,第15页,可溶性抗原,亚单位疫苗,包含：蛋白质、核酸、多糖、脂蛋白等,起源：组织和细胞,步骤：提取和纯化,免疫原和抗血清制备,第16页,粗提,组织、细胞破碎，取上清,组织匀浆：必须为新鲜或低温保留,高速组织捣碎机法；,研磨法（脑、胰腺）,2.细胞破碎：,冻融法，迟缓融化，适合用于细胞,超声破碎法，间歇进行，适合用于细胞,酶法，不易破坏内含物成份，适合用于微生物,表面活性剂处理法，多用于细菌提取核酸,免疫原和抗血清制备,第17页,纯化（以蛋白为例）,超速离心法,差速离心法 分离大小和密度差异较大颗粒,差速离心法原理示意图,免疫原和抗血清制备,第18页,纯化,密度梯度离心法,将样品放在惰性介质（梯度液）中进行离心沉淀,蔗糖、甘油、氯化铯等,免疫原和抗血清制备,第19页,纯化,特点,适合用于少数大分子抗原及一些比重较小抗原,免疫原和抗血清制备,第20页,纯化,选择性沉淀法,盐析法 纯度不高，适合初步纯化，常见33%-35%饱和度硫酸铵,有机溶剂沉淀法 必须在0下进行，常见乙醇和丙酮,聚合物沉淀法 PEG，分子量越大，PEG浓度越低,核酸沉淀剂法 硫酸鱼精蛋白、核酸酶等去除核酸,免疫原和抗血清制备,第21页,免疫原和抗血清制备,第22页,纯化,层析法,1.凝胶层析法 分子量不一样,2.离子交换柱层析法 蛋白质等电点不一样,3.亲和层析法 生物分子结合特异性和可逆性,免疫原和抗血清制备,第23页,纯化-凝胶层析法,免疫原和抗血清制备,第24页,纯化-凝胶层析法,免疫原和抗血清制备,第25页,纯化-离子交换层析,1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；,2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大,免疫原和抗血清制备,第26页,纯化-亲和层析,免疫原和抗血清制备,第27页,纯化,电泳法,分子量,电荷数量,免疫原和抗血清制备,第28页,纯化,粗分级普通采取盐析、有机溶剂分级等方法；,细分级普通采取层析法，包含凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等方法。,必要时，还可采取电泳法，包含等电聚焦等作为蛋白质提纯步骤。,免疫原和抗血清制备,第29页,细胞破碎,固液分离,粗分级,细分级,Going Up,免疫原和抗血清制备,第30页,纯化抗原判定,含量,双缩脲法、比浊法、酚试剂法、直接紫外吸收法等,分子量,SDS-PAGE,纯度,SDS-PAGE、HPLC,免疫活性,双向免疫扩散、ELISA等,免疫原和抗血清制备,第31页,琼脂糖凝胶电泳,免疫原和抗血清制备,第32页,琼脂糖凝胶电泳-模式图,免疫原和抗血清制备,第33页,SDS是一个阴离子表面活性剂，能使蛋白质氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度负电荷，其数量远远超出了蛋白质分子原有电荷量,蛋白质分子电泳迁移率主要取决于它分子量大小,免疫原和抗血清制备,第34页,人工抗原,人工结合抗原（半抗原）,人工合成抗原,基因工程抗原,免疫原和抗血清制备,第35页,人工结合抗原,半抗原（=20）,载体(1),蛋白质 牛血清蛋白,多肽类聚合物 多聚赖氨酸,大分子聚合物 羧甲基纤维素,完全抗原,物理,化学,羧甲基纤维素,聚乙烯吡咯烷酮,一些功效基团,判定,吸收光谱分析法,放射性核素标识法,免疫原和抗血清制备,第36页,人工合成抗原,化学方法,化学方法,合成肽疫苗,免疫原和抗血清制备,第37页,基因工程抗原,基因工程疫苗,提取、纯化、判定,免疫原和抗血清制备,第38页,毒性试验（安全性试验）,通常包含杀菌剂残留，防腐剂含量，热源含量，有没有微生物污染，培养基残留等，比如因为可能有些人对鸡蛋过敏，所以全部鸡胚培养疫苗必须严格监控卵清蛋白残留；而怀疑牛血清中可能有对人体不利物质，凡添加了牛血清培养细胞，必须监控牛血清白蛋白残留量；对于灭活疫苗，还要检测其灭活程度，通常是把成品或处理后原液接种到细胞或试验动物，动物或细胞没有感染迹象才算过关，对于弱毒疫苗，还要用动物做毒力测定，以确保疫苗没有复壮成致病株。,免疫原和抗血清制备,第39页,效力试验（免疫保护试验）,有效性检测，最基础，是用抗血清检验疫苗中确实含有目标抗原，然后做效力测定，给试验动物注射疫苗，检验有没有产生促发特异免疫应答产生特定抗体，或者，比较倒霉试验动物会被接种致病菌观察疫苗保护效应。,免疫原和抗血清制备,第40页,我疑问,抗原到疫苗，到底要怎么处理？,免疫原和抗血清制备,第41页,参考：,三枪拍案说疫苗生产科学松鼠会,蛋白质分离纯化生物秀论坛,嗜水气单胞菌亚单位疫苗研制孙建和、严亚贤等,从乙肝疫苗制备看疫苗纯化技术发展张国强、赵铠,免疫原和抗血清制备,第42页,经验,概念,：,1.看书,2.wikipedia,3.科学松鼠会,方法技术：,1.文件,2.论坛,丁香园,生物秀,小木虫,免疫原和抗血清制备,第43页,此次课程结束，谢谢大家,免疫原和抗血清制备,第44页,