大黄素在草鱼体内的药代动力学研究.pdf

89 大黄(Rheum officinale Baill)是常用的中药材，其干燥根及根茎味苦、性寒，有治疗泻下攻积、清热泻火、解毒止血、活血化瘀、清利湿热等功效1。大黄主要含有蒽醌类、鞣质类、二苯乙烯类、苯丁酮类等化学成分，其中蒽醌类成分又分双蒽核类和单蒽核类，现在研究最多的主要有大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄酸和大黄素甲醚 5 种，双蒽核类有番泻苷A-D等，大黄中所有化学成分几乎都有药理活性2。大黄的主要成分大黄素有以下几种功效：可抑制钠离子和钾离子从肠腔转运至细胞，肠腔内离子浓度升高，使水分保留在肠腔内，刺激大肠，促进其蠕动，从而起到泻下作用3；另外大黄素还有明显的止咳和降压作用，大黄素对金黄色葡萄球菌、卡他球菌等均有抑制作用4；大黄素对小鼠实体肉瘤S-180，小鼠肝癌、乳腺癌、艾氏腹水癌、淋巴肉瘤、黑色素瘤和大鼠瓦克瘤及 A-549 均有抑制作用5。本研究将大黄、黄连、黄芩等中药材添加到饵料中饲喂草鱼，取其脑、肝脏为实验材料。利用高效液相色谱法检测草鱼脑、肝脏中在饲喂后不同时段大黄素的含量，观察其动态变化过程，找出禁药期。以收稿日期：2022-03-17基金项目：贵州省普通本科高等学校服务农村产业革命战略行动计划项目“贵州池塘健康养鱼示范及推广”（黔教合KY字 2018091 号）；遵义师范学院“2021 年乡村振兴专项”（贵州省教育厅专项科研资金）项目“在提高草鱼抗病免疫力的中草药饵料中添加青贮饲料的研究”（黔教合 KY 字 2012 017-8 号）作者简介：钱正敏，女，贵州绥阳县人，遵义师范学院生物与农业科技学院实验师，主要从事分子生物学及鱼类病害研究。*通讯作者：王庆容，女，贵州务川人，遵义师范学院生物与农业科技学院教授，主要从事动物分子生物学及养殖动物疾病防治。E-mail：大黄素在草鱼体内的药代动力学研究钱正敏a,吴志勇b,陈莫a,王庆容a*（遵义师范学院 a.生物与农业科技学院；b.数学学院，贵州 遵义 563006）摘要：目的：为了找出明确的禁药期,检测了大黄的主要成分大黄素在草鱼的脑组织、肝组织等部位的代谢情况。方法：采用高效液相色谱法，柱子为 C-18，流动相为甲醇-0.1%磷酸(8515)；流速为 0.8mL/min；检测波长为 254nm。结果：大黄素浓度在0.0016525 0.05mg/mL 范围内呈良好的线性关系（r=0.9998）；大黄中大黄素的含量为 0.1916mg/g。结论：HPLC 法适用于测定大黄中大黄素的含量,方法精确、简便、重现性好。关键词：草鱼；大黄；高效液相色谱法；药代动力学中图分类号：Q75文献标识码：A文章编号：1009-3583（2023）-0089-03Study on the Pharmacokinetics of Emodin in Grass CarpQIAN Zheng-mina，WU Zhi-yongb，CHEN Moa，WANG Qing-ronga*(a.School of Biological and Agricultural Science Technology;b.School of Mathematics,Zunyi Normal University,Zunyi 563006,China)Objective:in order to find out the period of prohibition,the metabolism of Emodin,the main component of Phubarb,in brainand liver tissues of grass carp was examined.Methods:High-performance Liquid Chromatography method was used,the column wasC-18,the mobile plase was methanol-0.1%phosphoric acid(85:15),the flow rate was 0.8mL/min,and the detection wavelength was254nm.Results:TheconcentrationofEmodin waslinearin therangeof0.00165250.05mg/mL(r=0.9998),andthecontentofEmodinwas 0.1916mg/g.Conclution:High-performance Liquid Chromatography(HPLC)is suitable for the determination of Emodin in Rheumofficinale.The method is accurate,simple and reproducible.grass carp;Chinese rhubarb;high performance liquid chromatography;pharmacokinetics第 25 卷第 2 期2023 年 4 月遵义师范学院学报Journal of Zunyi Normal UniversityVol.25,No.1Apr.2023 90 第 25 卷第 2 期遵义师范学院学报2023 年 4 月期为水产经济动物的养殖以及添加中草药饵料的生产和推广提供理论参考。1 材料与方法1.1 实验材料草鱼（遵义市余庆县乌江构皮滩水域渔业养殖基地提供）、添加中草药的饵料（金鼎山饲料公司生产）、中药材大黄（购于本地医药公司）。1.1.1 主要试剂大黄素（西亚试剂，批号：X4852）、甲醇为色谱纯(天津市大茂化学试剂厂)、磷酸为分析纯（成都市科龙化工试剂）。1.1.2 主要仪器岛津高效液相色谱仪（LC-20AT），C18色谱柱，超声清洗机（SB-120D,新芝生物科技股份有限公司），AR224CN电子天平，RE5203 旋蒸仪（上海亚荣生化仪器）,SH2-D 循环水真空泵（上海亚荣生化仪器），0.45 m 滤膜。1.2 实验方法1.2.1 色谱条件与标准品的制备色谱柱为 InertsustainC18/phenvlhexvl 柱（5um，250mm 4.6mm），流动相为甲醇（A）-0.1%磷酸水（B），85%A，15%B。流速 0.8mL/min，等浓度洗脱；进样体积 10 L，柱温 30；检测波长为 254 nm6。精密称取大黄素标准品 5mg，置于 100mL的容量瓶中，加甲醇使其溶解，配制成0.05mg/mL的标准品母液，再用微量移液器分别吸取1.00mL、0.50mL、0.25mL、0.125mL、0.0625mL于 2mL的EP管中，用甲醇稀释至为 25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L、1.5625mg/L，备用。1.2.2 供试品溶液的制备将大黄药材烘干粉碎，精密称取粉末 2g，置100mL 量瓶中，加入甲醇 96mL，旋蒸浓缩 1h，将上清液转入 25mL的容量瓶中，用甲醇清洗残渣两次，并将两次清洗液一并装入 25mL 的容量瓶中，定容至刻度，再用超声清洗机处理 30 min，备用。1.2.3 含中草药的饵料中大黄素含量的测定精密称取含中草药的饵料 2g，放入研钵中，加入 10mL甲醇充分研磨，然后将研磨液 5000r/min离心 15min，取上清液备用。1.2.4 脑、肝组织中大黄素含量的测定用含中草药饵料饲喂草鱼，分别于 1h、2h、6h、12h、24h、48h后取脑、肝组织各2g放入研钵中，加入5g 甲醇进行研磨，混匀后 5000r/min 离心 15min，取上清液备用。2 结果与分析2.1 大黄素标准品的检测及标准曲线的绘制将各浓度大黄素标准品溶液经 0.45 m 微孔滤膜过滤至进样瓶中，进行高效液相色谱检测，结果如图 1，大黄素标准品的保留时间为 12.415min，出峰时间良好，符合定性分析要求。图 1 大黄素标准品的色谱图通过 HPLC 对各浓度的标准品检测后，将大黄素的峰面积为横坐标，其浓度为纵坐标绘制大黄素标准曲线，回归方程为：Y=410-8X+0.0009，R=0.9997，在浓度为 0.0015625-0.025mg/mL 的范围内有良好的线性关系，在此浓度范围内符合定量分析要求，见图 2。图 2 大黄素的标准曲线2.2 供试品大黄中大黄素的含量将供试品中大黄素溶液通过 0.45 m 微孔滤膜过滤至进样瓶中，进行高效液相色谱检测，结果见图3。大黄素供试品的保留时间为 12.481min，与大黄素标准品的出峰时间吻合，符合定性分析要求。通过回归方程计算中药大黄的大黄素的浓度为0.003832mg/mL，经计算，供试品大黄中大黄素的含量为 0.191614mg/g。2.3 含中草药的饵料中大黄素的含量将含中草药饵料溶液的上清液通过 0.45 m 微孔滤膜过滤至进样瓶中，进行高效液相色谱检测，结果如图 4。饵料中大黄素的保留时间为 12.419min，符合定性分析，通过回归方程计算饵料中大黄素的 91 浓度为 0.003107mg/mL，经计算饵料中大黄素的含量为 0.015535mg/g。图 3 大黄素供试品的色谱图图 4 含中草药饵料中大黄素的色谱图2.4 草鱼脑、肝组织中大黄素的含量将脑、肝组织中的上清液通过 0.45 m微孔滤膜过滤至进样瓶中，进行高效液相色谱检测，但在上述几个时间里，草鱼的脑、肝组织中都未检测到大黄素。可能是大黄素含量太低，没有通过血-脑屏障进入脑、肝组织中，或是提取方法不当没有提取出来，这需要做进一步研究。3 讨论大黄是一种纯天然中草药，是治疗临床疾病的常用中药，具有活血凉血、解毒清热等功效。大黄的药理作用为抗炎、清除自由基、降脂、免疫调控、抗肿瘤、致泻等，通常作为方剂的组成部分普遍应用于各类中药汤剂中。大黄适用于出血、肝胆疾病、肾脏疾病、便秘等疾病的临床治疗，且治疗效果较为理想1。对大黄的研究主要集中在药理、对疾病的临床治疗效果等方面7-10，有关大黄素在动物体内的药代动力学研究较少11，在鱼体内的药代动力学实验研究的则未见报道。我们用中草药饵料饲喂草鱼，分别于1h、2h、6h、12h、24h、48h 后取脑、肝组织为材料，用高效液相色谱法检测不同时间里大黄素在脑组织、肝组织的含量，分析“量-时”变化的动态规律，并确定一个禁止饲喂饲料时间，使出售的鱼体内不含中草药成分以保证质量安全。经高效液相色谱法未能检测到大黄素在草鱼脑、肝脏组织中的残留。影响中药材大黄中大黄素含量的因素很多12，如干燥方法、产地、饮片、炮制方法等，为了避免上述因素的影响，我们采用的是同一产地同一批次的大黄。在草鱼的脑、肝组织中都未检测到大黄素。可能是大黄素含量太低，没有通过血-脑屏障进入脑、肝组织中，或是提取方法不当没有提取出来，这需要做进一步研究。参考文献：1潘玉霞.大黄的药理作用及临床应用进展J.中国城乡企业卫生,2021,236（6）:20-222屈义虎,孙茜,李颖,等.大黄蒽醌类化合物生物转化研究进展J.广东化工,2018,45(11):124-125,1093宋信莉，刘丹，汪云霞，等.大黄黄连泻心汤提取工艺研究J.贵州科学，2019，37（5）：31-36，59.4王前波，韩亮.大黄粉治疗消化道出血的临床疗效J.血栓与止血学，2020，26（2）：233-234.5张珊珊,林琦雄,王明.大黄抗肿瘤研究进展J.中国中医药现代远程教育,2021,19(13):195-2016王勤,邸多隆,蒋生祥.大黄类药物分析方法研究概况J.中成药,2007,29(8):1199-12027高畅,吴振起,刘光华,等.不同工艺提取的大黄外用对肺炎支原体感染小鼠肺部炎症的影响J.中国现代应用药学,2021,38(22):2781-2786.8李玮,林名瑞,郭小艳,等.大黄对脓毒症小鼠早期肠道菌群的影响J.蛇志,2021,33(2):138-140,1499李蕴,曹焕泽,蔡平平.大黄在妇科血证中的应用J.中西医结合研究,2021,13(4):264-26610张丽娟,李瑾,王梅,等.生地黄汤不同配伍组成多糖含量变化及止血作用的实验研究J.医学研究杂志，2010,39(11):41-4311辛颖,耿慧春,张嵩,等.三黄泻心汤及大黄中大黄酸在大鼠体内的药代动力学J.中国方剂学杂志,2009,15(3):56-5912李东辉,王临艳,吴红伟,等.四种因素对大黄有效成分含量影响研究J.辽宁中医杂志,2021,48(6):182-185(责任编辑：徐国红)钱正敏等大黄素在草鱼体内的药代动力学研究