尤文肉瘤细胞总RNA修饰的树突状细胞的体外培养及其鉴定.doc

尤文肉瘤细胞总 RNA 修饰的树突状细胞的体
外培养及其鉴定

作者：王剑，桑宏勋，王臻，郭征

【关键词】 树突细胞；肉瘤,Ewing；总 RNA；逆转录聚合酶链反

应；癌症疫苗

【 Abstract 】 AIM: To investigate RNA expression of

dendritic cells(DC) pulsed with totol RNA from Ewing sarcoma

cells. METHODS: DC was generated from the peripheral blood

mononuclear cells(PBMC) of Ewing sarcoma patients. Surface

markers of matured DCs was detected by flow cytometer(FCM).

Total RNA was isolated from Ewing sarcoma by Trizol. DC were

transfected with total tumor cell RNA. The expression of DC

tansfected with total RNA was measured by RTPCR method. RESULTS:

Surface markers of DC pulsed with total RNA changed apparently.

CD40 increased from 32.24% to 72.32%. CD83 increased from 17.39%

to 30.97%, while monocyte CD14 declined from 26.37% to

10.46% .This indicated the significant reinforcement of antigen

presentation of DC. RTPCR showed the specific sequence EWSFLI1

of Ewing sarcoma can be combined with the primer specifically

at the best temperature of 54℃. CONCLUSION: DC pulsed with total

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RNA of Ewing sarcoma cells can present tumor specific antigen

and express its characteristic sequence EWSFLI1 specifically.

【Keywords】 dendritic cells; sarcoma, Ewings; total RNA;

reverse transcriptase polymerase chain reaction; cancer

vaccines

【摘要】 目的： 探讨树突状细胞（DC)经尤文肉瘤细胞总 RNA

加载后的体外 RNA 表达情况. 方法：采用分离尤文肉瘤患者外周血单

核细胞体外诱导 DC,用流式细胞仪检测 DC 成熟后的表面标志，Trizol

法提取患者尤文肉瘤组织总 RNA,用总 RNA 转染 DC， RTPCR 方法检测 用

肿瘤总 RNA 加载的 DC 的表达. 结果： 经尤文肉瘤总 RNA 加载的 DC

表面标记发生明显变化，DC 的特异性表面标志如 CD40 由 32.24%增高

至 72.32%,CD83 由 17.39%增高至 30.97%,而代表单核细胞的 CD14 则由

26.37%下降至 10.46%，标志其抗原呈递功能显著增强. RTPCR 测定显

示尤文肉瘤中的特异性序列 EWSFLI1 可以和引物特异性结合，并且最

佳结合温度为 54℃. 结论： 尤文肉瘤细胞总ＲＮＡ转染的 DC 可以呈

递肿瘤特异性抗原，并特异性的表达其特有序列 EWSFLI1.

【关键词】 树突细胞；肉瘤，Ewing；总 RNA；逆转录聚合酶

链反应；癌症疫苗

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0 引言

细胞毒性 T 淋巴细胞(cytotoxic Ｔ lymphocytes, CTL)能够介

导特异性免疫应答,引导特异性肿瘤细胞杀伤效应. CTL 的特异性免疫

应 答 依 赖 于 肿 瘤 抗 原 的 存 在 ,肿 瘤 抗 原 被 抗 原 呈 递 细 胞 (antigen

presenting cell, APC)识别吞噬后,在抗原递呈细胞内加工处理形成

特定的多肽片段,与 MHCＩ类分子完全匹配后递呈到细胞表面,被相应

Ｔ细胞受体(T cell receptor, TCR)识别,形成肿瘤抗原多肽 MHCTCR

复合物,在协同刺激因子的共同作用下,激活特异性细胞毒性Ｔ淋巴细

胞,产生免疫反应、 清除肿瘤细胞 1］ 树突状细胞 dendritic cells,
［. （

DC)是体内最重要的专职抗原递呈细胞［2］,可由骨髓干细胞、外周血

干细胞及外周血单个核细胞在细胞因子作用下诱导扩增. 95%的尤文

肉瘤家族具有特异的染色体异位,从而形成的 EWSFLI1 融合基因是尤

文肉瘤家族发生、进展的主要原因［3］. 本研究从尤文肉瘤患者外周

血中分离单个核细胞在 IL4 和 GMCSF 诱导下分化扩增 DC,从患者尤文

肉瘤组织中提取肿瘤总 RNA 加载 DC,并对经总 RNA 加载后的 DC 进行鉴

定，确定经肿瘤 RNA 加载的 DC 持续表达相应特异性肿瘤抗原,为 DC

在尤文肉瘤生物学免疫治疗中的临床应用提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料 RPMI1640 (美国 GIBCO 公司,14.1 g/包)；胎牛血清（杭

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